的能力弱于MUP-2。摘 要 对羊肚菌多糖(Morchella esculenta polysaccharides， MEP)进行分离纯化，对多糖组分进行纯度鉴定及结构分析。利用 DEAE-52纤维素层析柱和Sephadex G-100层析柱纯化得到2种组分(MEP-2和MEP-3)，均为均一多糖。利用红外图谱(fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR)和刚果红实验分析内部结构，MEP-2是一种吡喃环多糖且具有双螺旋结构，MEP-3含有甘露糖无双螺旋结构。利用高效凝胶渗透色谱法(high-performance gel permeation chromatography, HPGPC)与高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography, HPLC)测定2种组分分子量及单糖组成，MEP-2由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖组成，摩尔比为2.97∶13.69∶1∶2.60，分子质量为8.3 kDa。MEP-3由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖组成，摩尔比为18.25∶0.84∶1∶1.53，分子质量为11.6 kDa。扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)和原子力显微镜(atomic foree microseope, AFM)对MEP-2和MEP-3的组成和结构进行分析，MEP-2呈现不同大小的球形构象，MEP-3主要为球状和片状。MUP-3清除DPPH自由基、·OH、ABTS·的能力、还原力优于MUP-2, 清除的能力弱于MUP-2。
羊肚菌(Morchella esculenta)因具有较高的营养价值和独特的香味，在海内外久享盛誉。据《本草纲目》记载，羊肚菌对胃肠炎症、消化不良[1]病症具有良好的治疗效果。羊肚菌多糖是羊肚菌的主要成分之一。因其具有抗疲劳[2]、抗肿瘤[3]、抗氧化[4]、抗菌活性[5]、抑制癌细胞增殖[6]等诸多作用成为研究热点。
羊肚菌多糖(Morchella esculenta polysaccharides, MEP)的分离纯化与结构分析影响对多糖生物活性的研究。魏芸等[7]采用DEAE-纤维素离子交换柱及SepharoseCL-6B柱纯化羊肚菌菌丝体得到单一多糖MEP-SP1，并得出其主要由木糖、葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖4种单糖组成。明建等[8]利用DEAE-52纤维素柱层析Sephadex G-100 凝胶色谱纯化羊肚菌多糖，得到均一组分PMEP-1，并推测出其结构中含有吡喃环。孙玉军等[9]从羊肚菌菌丝体中分离出组分MEP-II，测出分子质量为2.8×104 Da。
山西省羊肚菌资源丰富，本实验以安泽县褐赭羊肚菌子[10]实体为原料，利用超声波辅助酶法提取羊肚菌多糖，脱蛋白、脱色，通过DEAE-52纤维素柱和SephadexG-100凝胶柱层析纯化，利用紫外光谱法、红外光谱法、液相色谱法对2种组分进行纯度鉴定、光谱特征、单糖组成等基本特征研究，并进行抗氧化实验，旨在为更好地开发和利用羊肚菌的多糖组分提供理论依据。
羊肚菌子实体购于山西省安泽县惠原科贸有限公司，经山西大学生命科学学院韩建荣教授鉴定为褐赭羊肚菌 (Morchella umbrina)；D-甘露糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-半乳糖、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA),北京百灵威科技有限公司；乙腈 (色谱纯),Ther-moFisher公司；右旋糖酐标准品、纤维素酶,美国Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。
Agilent 1260 Infinity II高效液相色谱仪,美国安捷伦公司；UV-1801紫外分光光度计,北京北分瑞利分析仪器有限责任公司；FD-1D-50冷冻干燥机,北京博医康实验仪器有限公司；SC-3614离心机,安徽中科中佳科学仪器有限公司；SP-2000UV型紫外分光光度计,上海光谱仪器有限公司；AL204 电子天平,梅特勒-托利多仪器有限公司；72-1电热恒温干燥箱,湖北省黄石市医疗器械厂；Thermo Scientific Nicolet iS50红外光谱仪,美国Thermo Fisher公司；AFM Multimode8,美国Bruker公司；JSM-6701F扫描电镜(scanning electron microscope, SEM),日本电子公司。
1.3.1 粗多糖提取
羊肚菌粗多糖的提取参考课题组已有的方法[11]：羊肚菌子实体→干燥 (40 ℃、6 h) →粉碎过80目筛 →酶解→超声波提取→灭酶 (95 ℃、15 min) →离心 (4 500 r/min、15 min) →取上清液→浓缩→4倍体积无水乙醇醇沉过夜→离心 (4 500 r/min、15 min) →沉淀溶解(蒸馏水)→定容→TCA法脱蛋白→H2O2法脱色素→MEP。
1.3.2 分离纯化
1.3.2.1 DEAE-52 柱层析
用Tris-HCl溶液将DEAE-52纤维素层析柱(2.6 cm×30 cm)平衡12 h，将羊肚菌粗多糖配制成5 mg/mL 的溶液，上样量2 mL，流速2.5 mL/min，分别用Tris-HCl、0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L 的NaCl 溶液进行梯度洗脱[12]，每2 min收集1管，采用苯酚-硫酸法测定洗脱液中多糖含量，以每管洗脱液吸光度为纵坐标，合并相同组分的收集液，浓缩，透析，冻干。
1.3.2.2 Sephadex G-100 柱层析
将DEAE-52 柱层析收集的冻干组分配制成5 mg/mL的多糖溶液，上样2 mL，Sephadex G-100 柱层析洗脱液为0.1 mol/L NaCl，流速为0.5 mL/min，每5 min收集1管[13]，采用苯酚-硫酸法测定洗脱液中多糖含量，以每管洗脱液吸光度为纵坐标，以收集管数为横坐标绘制洗脱曲线收集主峰的洗脱液，浓缩，透析，冻干。
1.3.3 羊肚菌多糖结构鉴定
1.3.3.1 羊肚菌多糖紫外光谱分析
利用紫外分光光度计在190～400 nm 范围内扫描，扫描间距为1 nm，观察在280和260 nm处是否有明显的吸收峰。
1.3.3.2 羊肚菌多糖红外光谱分析
称取经真空冷冻干燥后的羊肚菌多糖组分MEP-2、MEP-3各5 mg 置于红外光谱仪样品台上，固定样品，用红外光谱仪7 800～350 cm-1 扫描。
1.3.3.3 羊肚菌多糖分子质量测定
根据文献[14]报道的方法，采用HPGPC法测定多糖的平均相对分子质量。色谱条件：色谱柱：TSKgel GMPWXL(7.8 mm×300 mm，5 μm)，检测器：示差折光检测器，SHODEX Rl-201H，柱温箱HT-330，柱温：35 ℃，进样量：20 μL上样浓度：5 mg/mL，洗脱液：去离子水，流速：0.5 mL/min。用已知分子质量的右旋糖酐做标准品，以色谱峰的保留时间(Rt)，右旋糖苷葡聚糖标准品 (T-180, T-2000, T-4600, T-7100, T-10,000, T-21,400, T-84,400, T-133,800, 和T-2,000,000) 的平均分子质量的对数值 (logMw) 制作标准曲线，标准曲线方程为lg MW=-0.480 3Rt+12.798，R2=0.989 1。
1.3.3.4 羊肚菌多糖单糖组成分析
单糖组成分析用 PMP 柱前衍生化单糖，经高效液相色谱分离鉴定，具体试验操作参考文献[15]并做适当的修改。多糖样品5 mg，加入5 mL 4 mol/L TFA，置于样品瓶中，生料带封口，110 ℃ 水解4 h，冷却至室温，加入甲醇，真空干燥3次。取400 μL单糖混样加入4 500 μL 0.3 mol/L NaOH、450 μL 0.5 mol/L PMP 甲醇溶液中，混匀，70 ℃衍生2 h，冷却至室温，加入450 μL 0.3 mol/L HCl 中和，加入1 mL氯仿，充分振荡，弃去有机相，重复萃取3次，过0.45 μm 膜，置于样品瓶，待上样。
HPLC条件： 流速 1.0mL/min，上样体积：10 μL，检测波长 250 nm，柱温：40 ℃，洗脱液：流动相 A(乙腈)∶流动相 B(0.06 mol/L 磷酸缓冲液)=16∶84(体积比)。
1.3.3.5 羊肚菌多糖三螺旋结构分析
将多糖样品配制成2 mg/mL，加入等体积的0.2 mmol/L的刚果红溶液与NaOH溶液，混合均匀，使NaOH的最终摩尔浓度由 0～0. 4 mol/L等梯度增加[16]，室温静置5 min，测定最大吸收波长的变化。
1.3.3.6 羊肚菌多糖表观形貌观察
将羊肚菌组分MEP-2、MEP-3经过冷冻干燥制成白色絮状物，挑取适量黏到铜质样品台，表面喷金，用扫描电镜观察多糖外部结构。
1.3.3.7 羊肚菌多糖分子形貌观察
称取羊肚菌组分MEP-2、MEP-3各1 mg溶解于10 mL 蒸馏水中，稀释到最终质量浓度为10 μg/L，用 0.45 μm 滤膜过滤，取40 μL 滴在云母片上，自然干燥。用双面胶将云母片固定在样品台上，用原子力显微镜(atomic foree microscope, AFM)观测多糖分子形貌。
1.3.4 抗氧化能力测定
1.3.4.1 清除DPPH自由基能力测定
参考MA等[17]的方法并加以改动，样品组(A1)为2 mL DPPH试剂与2 mL多糖样品，空白组(A0)用水代替样品，对照组(A2)用无水乙醇代替DPPH试剂，Vc 为阳性对照。
1.3.4.2 清除·OH能力测定
采用水杨酸法[18]测定羊肚菌多糖对羟自由基的清除能力，在试管中依次加入 9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液、不同浓度多糖溶液1 mL 以及 30%的 H2O2 溶液 1.0 mL，静置 30 min，510 nm 波长处测定吸光度。对照组(A2)用蒸馏水代替H2O2，空白组(A0)用蒸馏水代替样品，Vc 为阳性对照。
1.3.4.3 清除
能力测定
采用文献[19]方法测定超氧阴离子清除率，取 4.5 mL Tris-HCl缓冲液，加入 2.4 mL 蒸馏水及多糖溶液1 mL，混匀，25 ℃水浴 10 min，再加入 0.1 mL 邻苯三酚，摇匀，25 ℃ 水浴 3 min，加入 0.5 mL 0.1 mol/L HCl，320 nm 处测定吸光度(A1)，对照组(A2)用蒸馏水代替邻苯三酚，空白组(A0)用蒸馏水代替样品，VC作为阳性对照。
1.3.4.4 清除ABTS·能力测定
采用谢惠等[20]的方法测定清除ABTS自由基的能力，样品组(A1)为3.9 mL ABTS试剂与0.1 mL样品，空白组(A0)用水代替样品，对照组(A2)用95%乙醇代替ABTS试剂，VC作为阳性对照。
1.3.4.5 还原力测定
采用普鲁士蓝显色法[21]测定MEP的还原力，取不同浓度多糖溶液 1.0 mL于试管中，加入 0.2 mol/L 磷酸缓冲液、2.0 mL K3(Fe(CN)6)，50 ℃水浴 30 min，冷却，加入 2.0 mL TFA。吸取反应液 2.0 mL，加入2.0 mL蒸馏水、0.4 mL FeCl3 溶液，混匀，暗室反应 30 min，700 nm处测定吸光度，Vc 为阳性对照。
1.3.4.6 清除率
清除率按公式(1)计算：
清除率
(1)
2.1.1 羊肚菌多糖DEAE-52柱层析
羊肚菌粗多糖经过脱蛋白、脱色后得率为7.79%。采用DEAE-52纤维素柱对羊肚菌粗多糖进行纯化，得到3个组分MEP-1、MEP-2和MEP-3(如图1所示)。因MEP-1含量较少，将组分MEP-2和MEP-3透析，干燥，进一步纯化。
图1 羊肚菌多糖DEAE-52 色谱柱洗脱曲线
Fig.1 Elution curves of Morchella esculenta polysaccharides
on DEAE-52 cellulose column
注：MEP-1、MEP-2和MEP-3分别为DEAE-52色谱柱洗脱后
3个组分
2.1.2 羊肚菌多糖Sephadex G-100色谱柱进一步纯化
利用Sephadex G-100色谱柱对初步纯化的羊肚菌多糖MEP-2和MEP-3组分进一步纯化(如图2所示)。
图2 羊肚菌多糖Sephadex G-100色谱柱洗脱曲线
Fig.2 Elution curve of Morchella esculenta polysaccharides
on Sephadex G-100 colum
由图2可知，经过Sephadex G-100凝胶色谱柱进一步分离纯化得到的2个组分均为单一洗脱对称峰，证明所得的羊肚菌多糖为较纯均一多糖，收集2组组分液，透析、干燥，得到羊肚菌多糖纯品MEP-2和MEP-3。
2.2.1 羊肚菌多糖紫外光谱分析
由图3可知，羊肚菌纯化组分MEP-2、MEP-3在紫外扫描范围内均无吸收峰，表明经过分离纯化后得到的MEP-2、MEP-3样品中均不含有核酸或蛋白质等物质。
图3 羊肚菌多糖紫外-可见光谱扫描图
Fig.3 UV-vis spectrum of Morchella esculenta polysaccharides
2.2.2 羊肚菌多糖的红外光谱分析
MEP红外光谱如图4所示。
图4 羊肚菌多糖红外光谱扫描图
Fig.4 FT-IR spectrum of Morchella esculenta
polysaccharides
MEP-2和 MEP-3在3 500～3 100 cm -1处具有宽广和强烈的多糖的特征吸收峰，是O—H伸缩振动的结果[22]，MEP-2与MEP-3在3 324、3 286 cm-1处的吸收峰表明分子间或分子内存在O—H；在MEP-2的红外光谱中2 941 cm-1处的吸收峰是C—H的伸缩振动；1 652 cm-1处的吸收峰是C
O的非对称伸缩振动；1 417、1 362 cm-1处的吸收峰是C—H的弯曲振动[23]；1 152 cm-1为糖的酯基C—O—C 伸缩振动吸收峰；1 079 cm-1 处的吸收峰是糖醛上C—OH伸缩振动引起的；1 019 cm -1是糖类羧基中CO的伸缩振动；845 cm-1为α型糖苷键的吸收峰；759 cm-1是吡喃环的特征吸收峰。在MEP-3的红外光谱中，2 975 cm-1处为弱的 C—H 伸缩振动峰。1 552及1 630 cm-1 处是羰基的弯曲振动。MEP-3 在1 087和 1 037 cm -1所呈现的强吸收为伯醇和仲醇的特征峰；893 cm-1 处吸收峰是吡喃糖β型C—H变角振动的吸收峰[24]，800 cm-1 处吸收峰表明含有甘露糖。
2.2.3 MEP的分子量测定
由图5可知，经HPGPC检测，羊肚菌多糖2个组分MEP-2和MEP-3的洗脱峰单一且较为对称，这说明2个组分纯度相对较高。羊肚菌多糖MEP-2、MEP-3两组分的保留时间分别为18.482、18.182 min，通过线性回归方程计算，得到它们的分子质量分别为8.3和11.6 kDa。
a-MEP-2;b-MEP-3
图5 羊肚菌多糖HPGPC色谱图
Fig.5 HPGPC chromatograms of Morchella esculenta
polysaccharides
如图6所示，MEP-2是由D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖组成，摩尔比为2.97∶13.69∶1∶2.60；MEP-3的单糖组成为D-甘露糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-半乳糖，摩尔比为18.25∶0.84∶1∶1.53。
a-标准单糖；b-MEP-2；c-MEP-3;1-D-甘露糖；2-L-鼠李糖；
3-D-葡萄糖；4-D-半乳糖；5-D-木糖；6-D-阿拉伯糖
图6 标准单糖、MEP-2、MEP-3高效液相色谱图
Fig.6 HPLC of mixed standard monosaccharides,
MEP-2 and MEP-3
2.2.5 MEP三螺旋结构分析
由图7可知，随着NaOH浓度的增加，MEP-2与刚果红反应形成的络合物的最大吸收波长是先增加后降低的。在弱碱性条件下，即NaOH溶液摩尔浓度在0～0.06 mol/L区间内逐渐增大时，溶液的最大吸收波长也随之逐渐增大；随着溶液碱性的逐渐增大，最大吸收波长基本呈现逐渐减小的趋势，可能是因为多糖之间的氢键在碱性条件下被破坏[25]，因此可以推断，MEP-2具有三股螺旋结构。MEP-3无此现象，可以证明MEP-3无双螺旋结构。
图7 不同摩尔浓度NaOH刚果红试剂与多糖混合液
λmax变化图
Fig.7 Changes in absorption wavelength maximum of
mixture of congo red and polysaccharides at various
concentrations of NaOH
2.2.6 MEP表观形貌分析
如图8所示，在放大500倍时MEP表面光滑，呈现不规则的网状结构，物质间相互作用强，紧密结合，MEP-2呈现不同大小的球形构象，MEP-3主要为球状和片状，碎片大小不一。放大1 000倍下观察发现，MEP部分网状结构有小的间隙。MEP-2晶体间有非常微小的空隙，使得多糖并未完全集合,这说明多糖分子间存在相互排斥力，分子间吸引力较为弱小[26]。MEP-3具有一面光滑，一面粗糙的形貌。
a-MEP×500;b-MEP×1 000;c-MEP-2×500;d-MEP-2×1 000;
e-MEP-3×500;e-MEP-3×1 000
图8 羊肚菌多糖扫描电镜观察外部形貌
Fig.8 Observation of the polysaeeharides from
Morchella eseulenta
2.2.7 MEP分子形貌分析
MEP的原子力显微镜(atomic force microscope, AFM)图像如图9所示，扫描范围为2 μm×2 μm，由图9可知，MEP-2聚集体呈链状与带有裂纹球形体，链高0.53～1.34 nm，链宽40.16～98.62 nm；球形体直径约为50.46～100.02 nm；MEP-3呈现球状，球形体直径约为60.52～104.62 nm，高度在1.62～4.86 nm。
a-MEP-2;b-MEP-3
图9 羊肚菌多糖原子力显微镜图
Fig.9 The AFM images of the polysaeeharides from
Morchella eseulenta
由图10可知，质量浓度为1 mg/mL时，MUP-2对DPPH自由基
的清除率分别为65.64%、86.86%、83.79%、37.67%，MUP-3对DPPH自由基的清除率分别为79.50%、89.62%、77.67%、42.96%，MUP-2、MUP-3还原力吸光度为0.577、0.686。
a-DPPH自由基清除率；b-·OH清除率；
清除率；d-ABTS·清除率；e-吸光度
图10 抗氧化能力结果图
Fig.10 The chart of antioxidant capacity result
MEP清除·OH的能力较强，推测可能与多糖分子含有的单糖种类和糖苷键连接方式有关，多糖分子中含有大量的羟基，羟基上的氢和化学性质活泼的·OH反应，生成稳定碳自由基和水，达到清除·OH的目的[27]。MUP-3清除DPPH自由基、·OH、ABTS·的能力、还原力强于MUP-2, 清除
的能力弱于MUP-2。
利用超声波辅助酶法提取MEP、经过醇沉、脱蛋白、脱色、透析、冷冻干燥后得到MEP。经过分离纯化得到2个组分MEP-2与MEP-3。经紫外分光光度计检测2种组分均为为单一多糖。红外光谱结果显示MEP-2含有吡喃环，MEP-3含有甘露糖。HPGPC测定MEP-2与MEP-3的分子质量分别为8.3和11.6kDa。MEP-2是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖组成，摩尔比为2.97∶13.69∶1∶2.60；MEP-3由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖组成，摩尔比为18.25∶0.84∶1∶1.53。MEP-2具有双螺旋结构，而MEP-3无此结构。在SEM与AFM下观察到MEP-2呈现球形结构，MEP-3主要为片状。MUP-3清除DPPH自由基、·OH、ABTS·的能力、还原力由于MUP-2, 清除的能力弱于MUP-2。本实验对MEP的2个组分进行了研究，旨在为更好地开发和利用羊肚菌的多糖组分提供理论依据。
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ABSTRACT In this study, the polysaccharides from Morchella esculenta (MEP) were purified, characterized and structure analyzed. Two homogenous polysaccharides (MEP-2 and MEP-3) were purified by DEAE-52 and Sephadex G-100 column chromatography. The molecular weight and monosaccharide composition of two components were determined by high performance gel permeation chromatography (HPGPC) and high-performance liquid chromatography (HPLC). The results showed that MEP-2 was composed of mannose, glucose, galactose and Arabia sugar. The molar ratio was 2.97∶13.69∶1∶2.60 and the molecular weight was 8.3 kDa. Furthermore, MEP-3 was composed of mannose, rhamnose, glucose and galactose with a molar ratio of 18.25∶0.84∶1∶1.53 and molecular weight of 11.6 kDa. The composition and structure of MEP-2 and MEP-3 were analyzed by scanning electron microscopy (SEM) and atomic force microscopy (AFM). MEP-2 exhibited spherical conformations of different sizes, while MEP-3 was mainly spherical and flaky. The abilities of MUP-3 to scavenge DPPH,·OH, ABTS·free radicals and reducing power were higher than that of MUP-2, however, lower than MUP-2 in scavenging capability.