高血压是一种常见的慢性疾病，临床综合特征表现为体循环动脉压增高，会损伤人体眼睛、心脏、大脑、肾脏等器官，并引发动脉瘤、心肌梗死和心力衰竭等心血管并发症[1]。研究表明，氧化应激是导致高血压产生的主要原因。氧化应激或活性氧自由基如超氧化物、羟基自由基等会攻击身体的健康细胞，导致其失去结构和功能[2]；高血压会使氧化应激水平升高，加速了与之相关的活性氧释放，因此，抗氧化剂在高血压治疗中发挥着重要的作用。另外，血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme, ACE)在调节血压中起着关键作用。ACE通过催化血管紧张素-I转化为血管紧张素-Ⅱ，抑制缓激肽活性，导致血压升高，因此，抑制ACE活性也可以降低机体血压[3]。
目前，已有多种植物多酚用于降血压的研究和药物开发。研究发现，橄榄叶多酚类物质能够有效地改善血压、血脂以及心血管疾病[4]；甜茶多酚可以显著降低自发性高血压大鼠的收缩压，对舒张压也有一定的降低作用，且在停药2周后，仍能起到一定的降压作用[5]。此外，黑加仑含有花青素、黄酮、酚酸等多种酚类物质，对OH·和
有很强的清除能力，能有效地抑制脂质过氧化，具有一定的抗氧化活性[6-7]。考虑到黑加仑多酚分子质量小于1 kDa[8]，本研究采用实际生产中应用较为广泛的超滤技术，将黑加仑多酚初步提纯，研究黑加仑粗多酚及其纯化物的体外抗氧化活性及血管紧张素转化酶的抑制性，同时研究其体内降压活性，评价黑加仑多酚的降血压效果，并进一步研究多酚纯化物的结构组成，为天然抗氧化剂和降血压食品添加剂的开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑加仑，购自新疆；自发性高血压大鼠(SHRs，SPF级无特定病原体)，北京维通利华实验动物技术有限公司；人肝癌细胞HepG2(BG040)细胞,上海博谷生物有限公司；没食子酸、福林酚试剂、血管紧张素转化酶-I(ACE)、6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-羧基(Trolox)、2′，7′-二氯荧光素二乙酸(DCFH-DA)、偶氮二异丁脒盐酸盐(AAPH)、N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸(FAPGG)、FeSO4、水杨酸-乙醇溶液、L-谷氨酰胺等试剂,北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清(FBS)、二甲基亚砜(DMSO)、DMEM高糖完全培养基、双抗(青霉素和链霉素)、胰蛋白酶等,美国Gibco公司；色谱级甲醇，墨克公司;其他试验所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
DF-101S集热式磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；冷冻离心机，美国贝克曼库尔特有限公司；冷冻干燥机，德国CHRIST公司；Stirred Cell 8010超滤装置，美国Millipore；Stirred Cell 801096孔白色底部透明微孔板，美国Coming公司；ELX800全自动酶标仪，美国Bio-Tek公司；Triple-TOF 5600高分辨质谱仪，美国AB sciex公司。
1.3 黑加仑多酚提取及膜分离
参考许海棠等[9]的方法提取黑加仑粗多酚，并进行部分修改。将冻干黑加仑粉碎，按料液比1∶7(g∶mL)加入无水乙醇溶液(含0.1%乙酸)，40 ℃恒温水浴，搅拌2 h，离心(8 000×g，4 ℃)20 min，收集上清液，浓缩冷冻干燥得到黑加仑多酚粗提物。粗多酚溶解后过截留分子质量(molecular weight cutoff, MWCO)为1 kDa的超滤膜超滤，制得分子质量<1 kDa的多酚纯化物，冻干备用。
1.4 黑加仑多酚含量的测定
采用福林酚比色方法[10]，测定样品多酚含量。吸取一定量黑加仑多酚溶液于10 mL容量瓶内，加入福林酚试剂，充分摇匀，反应5 min，加入75 g/L的饱和Na2CO3溶液0.4 mL，以蒸馏水定容至刻度并摇匀。避光置于30 ℃恒温水浴锅中反应1 h后，用酶标仪于765 nm 下测定吸光值。用没食子酸为标准品，绘制标准曲线回归方程为：y=0.021 3x+0.002 7(0.1～0.7 mg/mL，R2=0.998 1)，分析样品中多酚含量。
1.5 羟基自由基清除能力测定
按照吕旭聪等[11]的方法，测定羟基自由基(·OH)清除能力，取不同浓度待测样品溶液1 mL，分别加入9 mmol/L FeSO4、9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液各1 mL，通过滴加8.8 mmol/L过氧化氢1 mL启动反应，在37 ℃水浴下反应30 min，用酶标仪在波长510 nm下测定各浓度溶液的吸光度A，以蒸馏水作为样品的空白对照。按公式(1)计算·OH清除率：
·OH清除率
(1)
1.6 氧自由基吸附能力测定
根据TAVADYAN等[12]的方法测定样品的氧自由基吸附能力(ORAC)。用pH 7.4的PBS将黑加仑多酚样品稀释成不同浓度梯度(1 000、500、100、50、10、5 μg/mL)，在96 孔板中加入20 μL样品、20 μL Trolox标准品(6.25～50 μmol/L)以及120 μL的Fluorescein(荧光指示剂，0.008 μmol/L)，37 ℃培养20 min后，加60 μL，150 mmol/L AAPH，在激发波长485 nm，发射波长530 nm下，间隔2 min测1次，测60 min，以PBS为空白对照。
ORAC值
(2)
式中:AUC，荧光衰减曲线下面积分面积，μmol TE/mg DW。
1.7 细胞抗氧化活性(cellular antioxidant activity, CAA)实验
CAA根据SAKULNARMRAT等[13]的方法进行部分调整，具体操作步骤如下：
将HepG2细胞以6×104 cells/孔的数量种到96孔板中。将粗提物和纯化物溶于DMEM培养液中。细胞培养24 h后，弃掉培养液，每孔用100 μL的PBS溶液清洗1次，并加入100 μL含有25 μmol/L DCFH-DA的样品液处理1 h后，弃掉样品液，加入100 μL 600 μmol/L的AAPH工作液。96孔板置于多功能酶标仪上读取荧光值，温度37 ℃。发射波长538 nm，激发波长在485 nm，每5 min测试1次，持续1 h。每个孔板均设置空白组和对照组，对照组不添加样品，只添加DCFH-DA工作液和AAPH工作液；空白组仅添加DCFH-DA工作液。按照公式(3)计算CAA unit。
(3)
式中：
样品组的峰面积，
对照组的峰面积。此外，槲皮素在本研究中作为标准品使用，样品的CAA值单位表示为：mmol槲皮素(QE)/100 g DW。
1.8 ACE活性的测定
根据IKARASHI等[14] 方法分析黑加仑多酚的ACE抑制活性。依次在96孔板中加入40 μL不同浓度的黑加仑多酚HEPES样品溶液，50 μL 1.0 mmol/L的FAPGG/HEPES溶液，10 μL ACE。40 μL的HEPES缓冲液作为样品对照。于37 ℃下预热5 min，在340 nm波长下测定30 min，每30 s读取1次，测试5 min,根据公式(4)计算样品的ACE抑制活性。
ACE抑制率
(4)
式中：ΔA样品和ΔA空白分别代表样品和空白每分钟ACE活性变化速率。
1.9 体内降压效果评价
根据汪丽[15]的方法进行微调动物实验，取15只10周龄雄性自发性高血压大鼠进行测试。饲养条件：将大鼠置于SPF动物实验室，分笼饲养，每笼3～4只，自由进食、饮水。室温控制在约25 ℃，湿度65%，12 h光照/黑暗，保持安静，排除其他干扰。实验动物随机分为4组(n=5)，分别灌胃1 mL 0.9%生理盐水(对照组)、卡托普利(captopril)(10 mg/kg bw)、黑加仑粗品、小于1 kDa多酚组分(100 mg/kg bw)。采用夹尾法测量SHRs的血管收缩压(systolic blood pressure, SBP)，结果以灌胃后2、4、6、8、24 h SHRs的SBP减去灌胃前SBP表示。
1.10 质谱分析黑加仑多酚成分
利用高效液相色谱-质谱联用(HPLC-Q-TOF-MS-MS)分析和鉴定<1 kDa的多酚组分。液相色谱条件为：色谱柱Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18(2.1 mm×100 mm，2.7 μm)；柱温35 ℃；流速0.5 mL/min；进样体积10 μL；流动相：A：水，B：甲醇；洗脱条件：10%～80% B(0～15min)，80%～95% B(15～20 min)，95% B(20～25 min)，10% B(25～26 min)；检测波长为287 nm。质谱条件：ESI负离子模式；喷射电压4 000 V，喷射压力138 kPa；碰撞能量35 V，锥孔电压40 V；干燥气流速10 L/min；干燥气温度335 ℃；扫描质量范围m/z：100～1 000。采用PEAKS VIEW(Version 8.0)软件解析质谱数据。
1.11 统计分析
采用SPSS 19.0对数据进行单因素方差分析Duncan多重比较，显著差异选用P<0.05。每组实验重复3次，结果采用平均值±标准差来表示；采用Origin Pro 2016制图。
2 结果与讨论
2.1 黑加仑多酚的羟基自由基清除能力
从图1可以看出，多酚粗提物、<1 kDa多酚的羟基自由基清除率均与样品浓度呈正相关，此结果与段凤敏等[16]研究的青毛茶中茶多酚提取液浓度对羟基自由基(·OH)清除效果的研究结果一致。与粗多酚相比，<1 kDa多酚羟基自由基清除能力提高了1.9～9.47 μg/mL，同时<1 kDa多酚羟基自由基清除能力的IC50值(7.12±0.13 mg/mL)明显低于粗多酚的IC50值(75.49±3.87 mg/mL)。这个结果与马艳弘等[17]的研究结果比较相似，测得纯化草莓多酚清除羟自由基的IC50值为0.17 mg/mL，粗多酚的IC50值则显著高于纯化多酚，达到0.76 mg/mL。
A-粗多酚;B-<1 kDa多酚
图1 黑加仑多酚对·OH清除能力的影响
Fig.1 ·OH scavenging ability of blackcurrant polyphenols
注：不同小写字母表示具有显著性差(P<0.05)(下同)
2.2 黑加仑多酚的总抗氧化能力
ORAC法是评价食品抗氧化的标准方法，用于检测抗氧化物质对过氧化氢自由基的清除能力。结果得出，黑加仑粗多酚的ORAC值为(467.69±1.83) μmol TE/mg DW，<1 kDa组分的多酚ORAC值为(492.74±1.55) μmol TE/mg DW。数据表明，<1 kDa组分比粗提物更能有效地清除过氧化氢自由基。本研究结果略高于LIU等[18]研究的矮樱桃多酚的总抗氧化能力(94.79～205.68 μmol TE/g DW)，同时也高于CARBONNEAU等[19]研究红高粱和白高粱多酚的ORAC值(103.8±2.1 μmol TE/g和4.2±0.2 μmol TE/g)。
表1 黑加仑多酚的总抗氧化能力
Table 1 Total antioxidant capacity of black currant
polyphenols
组分ORAC值/(μmol TE·mg-1 DW)粗多酚467.69±1.83a<1 kDa多酚492.74±1.55b
注：不同小写字母代表有显著性差异(P<0.05)(下同)
2.3 黑加仑多酚的细胞内抗氧化能力
CAA检测可以评估活细胞内多酚抗氧化活性，能够反映多酚降低细胞内氧化应激的能力，以半数有效量(EC50)表示样品的细胞抗氧化能力的大小。从图2可以看出，黑加仑多酚的细胞内抗氧化活性与浓度呈正相关(P<0.05)。粗多酚对HepG2细胞的EC50值为(6.38±0.17) mmol QE/100 g DW，<1 kDa组分的EC50值为(5.14±0.08) mmol QE/100 g DW，<1 kDa多酚组分的细胞抗氧化活性效果较好。研究认为，黑加仑多酚具有一定的抗氧化活性，这是因为黑加仑多酚能够防止DCFH和膜脂的氧化，减少HepG2细胞中DCFH的形成，从而对AAPH产生的过氧自由基起到抗氧化作用。黑加仑多酚的细胞内抗氧化活性略优于红茶多酚(CAA值59.3 μmol QE/100 mg DW)[20]，差于蔬菜(CAA值为0.93～5.61 μmol QE/100 g)[21]，但经过纯化后多酚的抗氧化效果可以达到和这些蔬菜相近的抗氧化效果，可以采用膜分离的纯化方法提高黑加仑多酚的抗氧化活性。
A-粗多酚;B-<1 kDa多酚
图2 黑加仑多酚细胞内的抗氧化能力
Fig.2 Cellular antioxidant activity of blackcurrant polyphenols
2.4 黑加仑多酚的ACE抑制活性
从图3可以看出，黑加仑多酚可以显著抑制ACE的活性。ACE抑制率随着多酚浓度的升高而增强，在5.6～550 μg/mL浓度范围内具有显著性差异(P<0.05)，浓度在550 μg/mL以上的粗多酚对ACE的抑制率达到73.17%，半数抑制浓度(IC50)为(342.91±4.22) μg/mL。<1 kDa组分的ACE的抑制活性也与浓度呈正相关，浓度为550 μg/mL时ACE抑制率达到84.25%，IC50值为(225.66±1.82) μg/mL，ACE抑制活性显著优于粗提物(P<0.05)。这一结果与OBOH等[22]研究紫洋葱多酚结果相一致，紫洋葱多酚(IC50=0.59 mg/mL)对ACE的抑制作用优于白洋葱多酚(IC50=0.66 mg/mL)和大蒜(IC50=0.96 mg/mL)。因此，黑加仑多酚可能会通过抑制ACE达到降血压的作用[23]。
A-粗多酚;B-<1 kDa多酚
图3 黑加仑多酚的ACE抑制活性
Fig.3 ACE inhibitions of blackcurrant polyphenols
2.5 大鼠降压效果
降低机体SBP是抗高血压药物的一个重要特征，黑加仑多酚的降血压效果如图4所示。
图4 黑加仑多酚对SHRs收缩压的影响
Fig.4 Effect of blackcurrant polyphenols on systolic blood
pressure of SHRs
注：*表示与SHR组相比具有显著性差异(P<0.05)。
灌胃SHRs黑加仑多酚6 h后SHRs的SBP显著降低(P<0.05)，其中，分子量<1 kDa多酚降低SBP的效果显著优于粗多酚，并且在4～8 h平均降低SHRs的SBP达到(24.4±2.8) mm Hg，对照组卡托普利降低了(28.6±2.3) mm Hg的SBP。由此可见，多酚对于SHRs血压的治疗能在灌胃后4～8 h内保持稳定，从而能起到很好的降血压作用。SEOK-CHUN等[24]研究了一种海生藻类多酚在8 h内对SHRs收缩压的影响，结果显示，该多酚能够降低SHRs中的SBP，从而表现出良好的降压作用。ALASHI等[25]研究添加蔬菜面包的降血压效果也得到类似的结论，蔬菜中多酚能使降压作用维持在8 h以内。另外，王著等[26]研究石榴多酚的降血压作用发现不同给药时间点均能显著降低SHRs的舒张压，也体现了植物多酚的降血压作用。
2.6 黑加仑多酚组分分析
采用HPLC-Q-TOF-MS/MS鉴定<1 kDa组分多酚的组成，总离子色谱图如图5所示，<1 kDa组分有6个明显的色谱峰。其中，峰1母离子384 m/z，子离子含有飞燕草素特征峰338 m/z，参考SYLWIA等[8]的研究结果，鉴定峰1为飞燕草素-3-葡萄糖苷。峰2母离子497.3 m/z，子离子449为矢车菊素的特征峰，鉴定为矢车菊素-3-葡萄糖苷；峰3母离子696.4 m/z，子离子610 m/z为芸香糖苷的特征峰、289 m/z 为矢车菊素的特征峰，鉴定为矢车菊素-3-芸香糖苷；峰4母离子723.5 m/z，子离子449为牵牛花素、芸香糖苷的特征峰，鉴定为芍药素-3-芸香糖苷；峰5母离子836.6 m/z，子离子451 m/z 和225 m/z 为芸香糖苷、芍药素的特征峰，鉴定为飞燕草素-3-芸香糖苷；峰6母离子949.7 m/z，子离子449为牵牛花素、芸香糖苷的特征峰，鉴定为牵牛花素-3-芸香糖苷-5-葡萄糖(表2)。
图5 <1 kDa的多酚纯化物质谱分析总离子色谱图
Fig.5 Total ion chromatography of less than 1 kDa
purified polyphenols by mass spectrometry
表2 <1 kDa组分的结构鉴定分析
Table 2 Structural identification of less than
1 kDa fraction
峰MS(m/z)MS-MS(m/z)成分1384338、320飞燕草素-3-葡萄糖苷2497.3449矢车菊素-3-葡萄糖苷3696.4648、610、564、289、130、115矢车菊素-3-芸香糖苷4723.5677.5、338、225芍药素-3-芸香糖苷5836.6790、772、451、338、225飞燕草素-3-芸香糖苷6949.7903、654、451牵牛花素-3-芸香糖苷-5-葡萄糖
正是由于黑加仑多酚中含有飞燕草素-3-葡萄糖苷等6种花青素，使得其具备了相应的降血压效果。例如，因含有飞燕草素、矢车菊素糖苷等花青素，洛神葵提取物具备了较好的自由基清除能力和ACE抑制活性[27]，VENDRAME等[28]也认为花青素在调节机体血压方面发挥着重要的作用。
3 结论
本研究中利用较为简便的膜分离法制备了分子量<1kDa的黑加仑多酚纯化物，并研究了粗提物和纯化物的抗氧化、降血压能力。结果发现粗多酚和纯化后分子量<1 kDa的多酚的·OH清除能力的IC50值分别为(75.49±3.87) mg/mL和(7.12±0.13) mg/mL；粗多酚的ORAC值为(467.69±1.83) μmol TE/mg DW，多酚纯化物的ORAC值为(492.74±1.55) μmol TE/mg DW；粗多酚和纯化物对细胞的抗氧化活性的EC50值分别为(6.38±0.17) mmol QE/100 g DW和(5.14±0.08) mmol QE/100 g DW；粗多酚和多酚纯化物的ACE抑制活性的IC50分别为(342.91±4.22) μg/mL和(225.66±1.82) μg/mL，动物研究得出粗多酚和分子量<1 kDa的多酚纯化物均表现出了与对照组相似的降压趋势，且在灌胃4～8 h，<1 kDa的多酚具有与商业化降血压药卡托普利(剂量为10 mg/kg bw)相似的降血压效果。研究结果表明黑加仑粗多酚及<1 kDa组分均具有良好的降血压作用，其作用机制与抗氧化能力和血管紧张素转化酶的抑制性密切相关。最后本文研究利用HPLC-Q-TOF-MS-MS鉴定出<1 kDa组分中含有飞燕草素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-芸香糖苷、芍药素-3-芸香糖苷、飞燕草素-3-芸香糖苷、牵牛花素-3-芸香糖苷-5-葡萄糖6种花青素。这些组分可能是起到降血压作用的重要原因，这有待进一步研究。本研究为后续黑加仑多酚作为天然降血压药物和功能食品的开发原料提供了一定的理论基础和现实依据。
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