海地瓜是我国大宗低值海参品种，虽食用品质较差，但营养价值与刺参、梅花参等高品质海参相似，生理活性物质含量丰富[1]。目前海参加工产业增长速度虽快，但发展水平低，低值海参资源利用不充分、精深加工产品较少。对低值海参活性物质的深入研究，是充分利用海参资源、实现海参精深加工的关键科学问题。海参岩藻聚糖硫酸酯 (acaudina fucoidan，AFuc)是海地瓜体壁主要活性物质之一，具有抗辐射、增强免疫、抗氧化、增殖巨噬细胞等多种功能[2-4]。AFuc是一类主要由岩藻糖及硫酸基团组成的多糖，单糖组成及硫酸基团含量的不同会导致其抗凝血活性有较大差异[5]。张殉等[6]研究发现冰岛刺参AFuc的硫酸酯化程度比海地瓜AFuc稍高一些，冰岛刺参AFuc抑制肿瘤生长和转移的作用也优于海地瓜AFuc，由此推测AFuc的抗肿瘤作用可能与高硫酸酯化程度有关。朱玉婕等[7]研究发现AFuc改善胰岛素抵抗的效果与硫酸酯化位点、支链结构等分子特征密切相关，硫酸酯化位点多且无支链的AFuc的改善效果显著。多糖的硫酸酯化修饰可提高其水溶性、增强负电荷、改变多糖的空间立体结构，从而使其生物学活性明显改变[8-9]。选择适宜的硫酸酯化剂对AFuc进行酯化处理以增强其生理活性，成为提高海地瓜AFuc物质经济价值、促进低值海参资源高值化利用的有效途径。
目前人们对不含硫酸基的多糖的酯化修饰做了大量研究工作[10-11]，而对含硫酸基的多糖的酯化修饰研究鲜见报道。海地瓜AFuc虽结构本身含硫酸基团，但硫酸酯化反应不仅增加硫酸基的含量，也可改变多糖分子结构，从而提高原有的生物活性，甚至增加新的功能[12]。故AFuc的硫酸酯化研究可为揭示AFuc的构效关系、研发高活性AFuc产品提供理论指导，进而拓宽其产业化应用范围。目前多糖硫酸酯化常用的酯化剂有氯磺酸、浓硫酸和三氧化硫吡啶复合物，通过酯化可使单糖残基上的羟基连接上硫酸基团[13-14]。氯磺酸法操作困难、反应剧烈、危险性大，浓硫酸法易导致多糖碳化，三氧化硫吡啶复合物法反应温和、易于操作，且效果较好。硫酸酯化常用的溶剂有N, N- 二甲基甲酰胺(DMF)、吡啶和二甲基亚砜(DMSO)，但有研究发现DMSO不适宜用作多糖硫酸酯化溶剂[15]。本文拟以海地瓜AFuc为原料，采用三氧化硫吡啶复合物法对其进行硫酸酯化，以硫酸基取代度为指标设计正交试验，确定DMF和吡啶两种不同溶剂下的最佳酯化工艺参数，并对酯化产品进行红外光谱分析和抗氧化活性的测定。
AFuc粗品(纯度为56.12%，硫酸基取代度为0.83)，为本实验室自制[16]；N, N-二甲基甲酰胺、吡啶、三氧化硫吡啶复合物(C5H5N·SO3)、明胶、NaOH、K2SO4、乙醇等试剂，均为分析纯。
WCT-200型磁力加热搅拌器，常州国华电器有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；KDC-1044型低速离心机，科大创新股份有限公司；FT/IR-480型傅里叶红外光谱仪，日本岛津公司；Cary50型紫外可见分光光度计，美国Varian公司；JDG-0.2B型真空冷冻干燥机，兰州科近真空冻干技术有限公司。
1.3.1 三氧化硫吡啶复合物/N,N-二甲基甲酰胺法(C5H5N·SO3/DMF法)
将15 mL吡啶加入锥形瓶中，磁力搅拌下加入一定量的C5H5N·SO3，热水浴加热至反应温度，再加入AFuc产品0.2 g，保温反应。反应完毕后冷却至室温，用2 mol/L的NaOH溶液调至中性，蒸馏水透析72 h，旋蒸浓缩10倍后加入3倍体积95%的乙醇，4 ℃下静置过夜，收集沉淀冷冻干燥，得硫酸酯化海参岩藻聚糖硫酸酯(sulfated acaudina fucoidan，SAFuc)产品。
在单因素试验基础上，选定反应温度、酯化剂用量、反应时间3个参数为影响因素，每个因素取3个水平，设计正交试验L9(33)。
1.3.2 三氧化硫吡啶复合物/吡啶法(C5H5N·SO3/C5H5N法)
将15 mL吡啶加入锥形瓶中，磁力搅拌下加入一定量的C5H5N·SO3，热水浴加热至反应温度，再加入AFuc产品0.2 g，保温反应。反应完毕后冷却至室温，用2 mol/L的NaOH溶液调至中性，蒸馏水透析72 h，旋蒸浓缩10倍后加入3倍体积95%的乙醇，4 ℃下静置过夜，收集沉淀冷冻干燥，得SAFuc产品。
在单因素试验基础上，选定反应温度、酯化剂用量、反应时间3个参数为影响因素，每个因素取3个水平，设计正交试验L9(33)。
采用明胶-比浊法[17-18]测定硫酸基的质量百分数S%，然后按公式(1)计算硫酸基取代度(degree of substitution，DS)。
(1)
红外光谱分析：称取1 mg干燥产品与适量溴化钾成均匀粉末，然后用压片机压片，形成透明薄片，在500～4 000cm-1进行红外扫描，测定其红外光谱图。
DPPH体系法[18-19]测定清除1,1-二苯基-苦肼基自由基(DPPH·)的能力；
Fenton反应体系法[20-21]测定清除羟基自由基(·OH)的能力。
2.1.1 单因素试验结果
C5H5N·SO3在DMF中的溶解性较好，常温下可溶解，反应过程可常温操作。考察了DMF为溶剂时反应温度、酯化剂用量、反应时间对硫酸酯化效果的影响，结果如图1所示。
A-反应温度；B-CSH5N·SO3用量；c-反应时间
图1 DMF为溶剂时反应温度(A)、C5H5N·SO3用量(B)和反应时间(C)对产物取代度的影响
Fig.1 Effects of reaction temperature, C5H5N·SO3 dosage and time on DS of DMF as solvent
图1-A显示，温度低于50 ℃时，随着反应温度的增加，产物取代度逐渐升高；60 ℃时，取代度略有下降。在一定温度范围内，随反应温度的上升，分子运动加快，取代反应的几率增加。但温度过高也会导致多糖的降解及结构的破坏，所以取代度先上升后下降；图1-B表明，30 ℃下反应1 h，取代度随着酯化剂用量的增加而上升，说明随着硫酸盐浓度的升高，硫酸基团和多糖间的结合逐渐增多[22]，故酯化剂用量越高越利于酯化反应的进行，但酯化剂用量越高成本越高；图1-C显示，反应温度30 ℃下，在2 h内取代度随反应时间的增加而增加，超过2 h取代度呈下降趋势，过长的反应时间不利于酯化，这说明过长的反应时间会导致多糖的降解及结构的破坏。同时酯化时间过长也会增加经济成本，故反应时间以2 h为宜。
2.1.2 正交试验结果
在单因素试验的基础上，采用正交试验法确定C5H5N·SO3/DMF法的最适条件，各因素水平及实验结果列于表1。
由表1可以看出，运用C5H5N·SO3/DMF法进行AFuc的酯化修饰，影响酯化反应因素的主次顺序为 B>A>C，即酯化剂用量对酯化度影响最大，其次是反应温度和反应时间。最佳工艺组合为A1B3C3，即反应温度为40 ℃、酯化剂用量1.2 g、反应时间为3 h时酯化效果最好，产品取代度可达15.63(该产品编号为SAFuc-1)。为进一步考察优化工艺的可靠性和稳定性，称取3批各0.2 g AFuc产品按上述最佳工艺条件进行验证试验，结果产品取代度为14.87±1.13，说明该工艺条件下，产品取代度较高。验证试验结果表明，该优选工艺稳定可靠。
表1 DMF为溶剂时正交试验设计及结果
Table 1 Orthogonal experiment design and results of
DMF as solvent
组别反应温度/℃C5H5N·SO3用量/g 反应时间/hABC 取代度1400.612.302500.623.673600.635.754400.927.075500.933.766600.916.057401.2315.638501.218.319601.2211.12K18.3333.9075.553K25.2475.6277.287K37.64011.6878.380R3.0867.7802.827
2.2.1 单因素试验结果
C5H5N·SO3在吡啶中溶解性较差，常温下酯化剂不溶解，必须加热至60 ℃才可溶解。同样考察了吡啶为溶剂时反应温度、酯化剂用量、反应时间对硫酸酯化效果的影响，结果如图2所示。
A-反应温度；B-C5H5N·SO3用量；C-反应时间
图2 吡啶为溶剂时反应温度、C5H5N·SO3用量和反应时间对产物取代度的影响
Fig.2 Effects of reaction temperature, C5H5N·SO3 dosage and time on the degree of substitution of pyridine as solvent
图2-A显示，随温度的上升，取代度逐渐增加，高温利于酯化。可能原因在于，随反应温度的上升，C5H5N·SO3在吡啶中的溶解性越好，分子运动也越快，更利于取代反应；图2-B显示，90 ℃下反应1 h，取代度随着酯化剂用量的增加而显著增加，同样是因为随着硫酸盐浓度的升高，硫酸基团和多糖间的结合逐渐增多从而使取代度增大，但高温条件下，酯化剂用量过高也会使多糖结构发生破坏[22]。图2-C表明，反应温度90 ℃下，随着反应时间的增加，硫酸基取代度先升高后有所下降。在3 h内，酯化时间增加，有助于酯化反应的进行；但在高温条件下，酯化时间过长，也会引起多糖的部分降解，导致取代度有所下降。
2.2.2 正交试验结果
在单因素试验的基础上，采用正交试验法确定C5H5N·SO3/C5H5N法的最适条件，各因素水平及实验结果列于表2。
表2 吡啶为溶剂时正交试验设计及结果
Table 2 Orthogonal experiment design and results of
Py as solvent
组别反应温度/℃C5H5N·SO3用量/g 反应时间/hABC 取代度1700.621.142800.631.963900.641.274700.935.765800.946.786900.9210.777701.244.738801.228.569901.2313.31K13.8771.4576.823K25.7677.7707.010K38.4508.8674.260R4.5737.4102.750
表2显示，运用C5H5N·SO3/C5H5N法进行AFuc的酯化修饰，影响酯化反应因素的主次顺序为B>A>C，即酯化剂用量对酯化度影响最大，其次是反应温度和反应时间。最佳工艺组合为A3B3C2，即反应温度为90 ℃、酯化剂用量1.2 g、反应时间为3 h时酯化效果最好，产品取代度可达13.31(该产品编号为SAFuc-2)。为进一步考察优化工艺的可靠性和稳定性，称取3批各0.2 g AFuc产品按上述最佳工艺条件进行验证试验，结果产品取代度为13.11±1.25，说明该工艺条件明显优于正交试验的其他组。验证试验结果表明，该优化工艺也是稳定可靠的。
图3为AFuc和SAFuc的红外光谱图，图中3 422 cm-1是O—H及N—H的伸缩振动峰、2 941 cm-1为C—H伸缩振动峰、1 677 cm-1为C
O的伸缩振动峰，1 049 cm-1为C—O—C的伸缩振动峰，它们都是多糖的特征吸收峰，酯化反应前后无明显变化，说明C5H5N·SO3对AFuc的多糖结构并无明显影响。1 232 cm-1为SO 伸缩振动峰，830 cm-1为C—O—S的伸缩振动峰，两者均是硫酸酯的特征吸收峰[23-24]，SAFuc-1和SAFuc-2的红外光谱显示相同的官能团吸收，酯化后硫酸酯的特征吸收峰明显增强，由此可以证实硫酸基被酯化到AFuc的多糖骨架上。
图3 AFuc、SAFuc-1及SAFuc-2的红外光谱图
Fig.3 Infrared spectra of AFuc, SAFuc-1 and SAFuc-2
测定质量浓度为2 mg/mL的AFuc和SAFuc溶液对DPPH·及·OH的清除效果，结果如图4所示。图4显示AFuc、SAFuc-1及SAFuc-2溶液对DPPH·的清除效果高于·OH； AFuc酯化修饰后对DPPH·和·OH的清除效果均显著增强，且SAFuc-1(取代度15.63)对DPPH·和·OH的清除效果均优于SAFuc-2(取代度13.31)，说明硫酸基团的增加利于AFuc抗氧化活性的提高。该结论与不含硫酸基的多糖(如鱼腥草多糖[25]、怀山药多糖[26]等)硫酸酯化修饰后抗氧化活性测定结果一致。谢明勇等[27]分析了硫酸酯化改变抗氧化活性的原因在于：硫酸基团的引入使得多糖的构象变得更为伸展，改变了多糖在溶液中的构象，从而利于其活性的表达。与氯磺酸吡啶法相比，C5H5N·SO3为酯化剂所得产品的硫酸基含量虽低，但抗氧化活性却更高[17-18]，可能原因在于：酯化反应条件不同，对多糖空间构象的改变影响不同。
图4 AFuc、SAFuc-1及SAFuc-2对DPPH·和·OH的清除效果
Fig.4 Scavenging effect on DPPH· and ·OH of AFuc,
SAFuc-1 and SAFuc-2
采用C5H5N·SO3为酯化剂可有效对AFuc进行酯化改性，且在DMF和吡啶两种不同溶剂下，影响酯化效果的诸因素主次顺序均为：酯化剂用量影响最大，其次是反应温度、反应时间。DMF为溶剂时最佳酯化工艺条件为：反应温度为40 ℃、酯化剂用量1.2 g、反应时间为3 h，硫酸基的取代度由0.83提高至15.63；吡啶为溶剂时最佳酯化工艺条件为：反应温度为90 ℃、酯化剂用量1.2 g、反应时间为3 h，产品取代度提高至13.31。红外光谱检测表明，SAFuc在硫酸酯处的特征吸收峰明显加强；抗氧化活性测定显示，酯化反应后，产品抗氧化活性提高。总体而言，DMF为溶剂时，酯化反应条件温和、硫酸基取代度较高，且产品抗氧化活性更优，故C5H5N·SO3/DMF法更适于AFuc的酯化反应，是一种很有应用前景的硫酸酯化多糖的方法。本试验为低值海参的高值化开发应用提供了科学依据，为丰富多糖构效关系、拓宽多糖的应用领域研究提供了理论基础。
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