罗望子(Tamarindus indica L.)属于苏木科(Caesalpiniaceae)酸角属(Tamarindus)，又称酸角、酸豆、罗晃子等。罗望子果肉含有丰富的糖类、有机酸、氨基酸和矿物质元素。除此之外，罗望子果肉中还含有较多的多糖类、酚类和黄酮类化合物[1-2]及丰富的生物活性物质[3]，可以被加工为糕点、蜜饯、果脯、果肉粉、浓缩汁和咖喱粉等产品[4]。
如今，随着生活水平的提高，人们的消费观念发生变化，人们开始热衷选择营养丰富的浑浊型果汁饮料。浑浊型罗望子饮料最主要的问题是在贮藏和运输过程中会出现固体颗粒的沉淀，这会对消费者的感官造成负面影响[5]。而非热加工是目前果汁加工的趋势，例如通过高压均质、超高压[6]、超声[7]和高压脉冲电场[8]等处理来保护果汁的营养品质或延长货架期，其中高压均质是应用最广泛的加工方式之一。
根据Stokes公式，颗粒沉降速度与颗粒粒径成正比，颗粒尺寸越小，沉降速度越慢，因而在果汁加工中常用均质处理降低果汁颗粒的粒径，以提高产品的物理稳定性。高压均质能够破坏食品基质，破坏果肉细胞的完整性，将细胞破碎成碎片，从而导致果汁的平均粒径降低，颗粒分布变窄，果汁稳定性增强。但是高压均质处理时，样品经过高压均质阀时受压力、剪切力、高速碰撞、空穴效应等作用可能会对果汁中生物活性物质产生一些难以控制的影响。
高压均质技术可以用于改善各种果汁的物理稳定性，但是目前没有关于利用高压均质处理罗望子浊汁的相关研究。本研究的目的是：(1)研究高压均质处理条件对罗望子浊汁物理稳定性的影响(离心沉淀率、清液浊度、粒径分布)；(2)尽量减小高压均质处理对罗望子浊汁生物活性的影响(总酚、总黄酮、多糖含量和抗氧化能力)。
新鲜成熟的甜型罗望子果实产自云南省西双版纳，购于昆明市建航商贸有限公司。运至实验室后立即剔除受到虫害和霉变的果实，剥取果肉密封后在-20 ℃冰箱存放。
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸、水杨酸、三氯乙酸、硫酸亚铁、过氧化氢、氯化铁、碳酸钠、福林酚试剂均为分析纯，购于成都科隆化学品有限公司。纤维素酶(酶活：10万U/g，最适温度50 ℃，最适pH 4.8)为食品级，购于和氏璧生物科技有限公司。
Rise-2006型激光粒度仪，济南润之科技有限公司；ZDG型浊度仪，无锡市优量智能流量仪表有限公司；Varioskan Flash型荧光酶标仪，美国Thermo公司；GJJ型高压均质机，上海诺尼轻工机械有限公司；JYL-C012型打浆机，九阳股份有限公司。
1.3.1 样品处理方法和均质条件
将罗望子果肉以固液比1∶11混合浸泡30 min，使罗望子果肉质地变软利于打浆。然后将果肉和水的混合物一起倒入打浆机中进行打浆，大约1 min后观察到果浆中没有果肉颗粒判断为制浆完成。向制备好的罗望子果浆中加入底物浓度1.5‰的纤维素酶，混合均匀后于50 ℃水解50 min。酶解好的罗望子果浆经过300目滤袋粗滤后分装到饮料瓶中。制备好的罗望子浊汁经过水浴平衡20 min后转移至均质机进料口中，调节压力阀，按照条件对罗望子浊汁进行均质。均质完成的样品立即水浴冷却后装入无菌玻璃瓶中在4 ℃储存直至分析。在控制进料温度为50 ℃、均质压力20 MPa、均质次数为2次的基础条件下，改变其中一项均质条件对罗望子浊汁进行处理。选取均质压力0～30 MPa，进料温度20～70 ℃，均质次数0～5次。
1.3.2 浊汁离心沉淀率和上清液浊度的测定
称量5 mL离心管的质量m1，加入3.5 mL均质后的样品溶液，称量离心管和饮料的质量m2，以250 g的离心力离心20 min，取上层清液用蒸馏水稀释20倍后放入玻璃样杯中用浊度仪测定浊汁上清液浊度。拭去盖子、管口及内壁上的残余液体后精确称量离心管和沉淀的质量m3，按照公式(1)计算离心沉淀率SR，离心沉淀率SR越大，说明饮料的稳定性越差。
离心沉淀率
(1)
1.3.3 激光粒度仪分析
用激光粒度分析仪进行测定，在室温下吸取一定量的罗望子浊汁加入到以蒸馏水为分散介质中，调节遮光比大于0.6，测定罗望子浊汁粒度分布曲线。
1.3.4 总酚的测定
采用Folin-Ciocalteus法[9]，取样品0.4 mL，加入2 mL稀释10倍的Folin酚试剂，反应5min后加入10% Na2CO3溶液3 mL，混合均匀后常温放置1 h，于765 nm处测定OD值，对比相应的没食子酸标准曲线计算总酚含量。
1.3.5 总黄酮的测定
采用分光光度法，吸取稀释了2倍的样品溶液0.3 mL，加入30%的乙醇溶液3.4 mL和0.5 mol/L的NaNO2溶液0.5 mL，6 min后加入0.3 mol/L的AlCl3·6H2O溶液0.15 mL，6 min后在410 nm处测定波长，并对比相应芦丁标准曲线计算总黄酮含量[9]。
1.3.6 抗氧化能力的测定
利用DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和羟自由基清除能力[10-11]评价罗望子浊汁的体外抗氧化能力。
对于DPPH自由基的清除能力，将1 mL混匀后的罗望子浊汁与0.5 mL 0.35 mg/mL DPPH乙醇溶液振动均匀后在暗处反应20 min后在517 nm测量溶液的OD值。
对于ABTS自由基的清除能力，首先将ABTS粉末用蒸馏水溶解为浓度为7 mmol/L的ABTS溶液，再与浓度为140 mmol/L的K2S2O8溶液混合，室温避光静置过夜。使用时用0.1 mol/L PBS缓冲液稀释，要求其在734 nm波长下的OD值为0.70±0.02。取稀释后的ABTS自由基溶液3.9 mL加入0.1 mL样品振荡后在黑暗处静置10 min后在734 nm处测定OD值。
对于羟自由基清除能力，向试管中依次加入1 mL、9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、1 mL、9 mmol/L FeSO4溶液和稀释10倍的罗望子浊汁样品，充分混合后迅速转移到37 ℃水浴锅中避光反应30 min后在510 nm处测定OD值。
对于不同自由基清除能力的测定，均用蒸馏水替代样品溶液作为阴性对照，结果表示为罗望子浊汁中抗坏血酸当量。
每组测量实验重复3次，最终数据为平均值，并计算标准偏差。用Microsoft Excel 2013进行基本数据处理，用软件SPSS 21.0进行显著性分析，采用Origin 8.0制图。
不同高压均质压力、进料温度和均质次数对罗望子浊汁粒度的影响如图1所示。所有的样品均呈现单峰分布。由图1-A可以看出，未进行均质处理的样品粒度分布范围最大。其中，从1～7 μm的颗粒占颗粒总体积的90%以上。随着均质压力的提升，罗望子浊汁的粒度分布迅速向低粒度区域移动。同时还观察到随均质压力的升高，浊汁粒度分布范围明显变得集中，当均质压力达到15 MPa以上时，继续提升压力罗望子浊汁的粒度分布几乎没有变化。这表明较大的果肉颗粒经过压力阀时被破碎成较小的颗粒，这种变化规律与橙汁、番茄汁和菠萝汁相同[12-14]。当均质压力到达15 MPa以上时，2 μm以下的颗粒占颗粒总体积90%以上。由图1-B可以看出，在压力为20 MPa、均质次数2次的条件下，温度的变化对罗望子浊汁的粒度影响不显著，但是由图1可以看出40～60 ℃条件下，罗望子浊汁中颗粒的平均粒径较低，较高的温度使得浊汁粒度部分增加可能是较高的入口温度导致蛋白质的凝固[15]。由图1-C可以看出均质次数对罗望子浊汁粒度影响显著，均质1次后，浊汁的粒径迅速减小，当均质次数达到2次后，继续增加均质次数无法明显的减小浊汁的粒度。
A-50℃/0～30 MPa/2次；B-30～70℃/20 MPa/2次；C-50℃/20 MPa/0～5次
图1 不同均质压力、进料温度和均质次数的粒度分布曲线
Fig.1 Particle size distribution curves of different homogenizing pressures, feeding temperature and passes number
不同条件高压均质处理对罗望子浊汁离心沉淀率和清液浊度的影响如图2所示。浑浊型果汁中含有较多的悬浮颗粒，这些悬浮颗粒常常是不溶性的果胶、蛋白质、纤维素和半纤维素，它们通过吸收光线造成了果汁的浑浊。由图1-A得知，随着均质压力的增加浊汁离心沉淀率显著下降，清液浊度显著上升。由斯托克斯定律，颗粒的沉降速度与颗粒粒径成正比，颗粒尺寸越小沉降速度越慢。未均质的样品颗粒尺寸大，容易在离心过程中沉降下来，因此离心后清液的浊度也较低[16]。随着均质压力的增加，果肉中颗粒逐渐降低，所以浊汁的稳定性也提高了。但是当均质压力达到20 MPa后，浊汁离心沉淀率和清液浊度均变得稳定，这与浊汁的粒度分布结果相似。由图1-B可知，适当进料温度有利于浊汁离心沉淀率的下降和清液浊度的提高，但当进料温度提高至50 ℃以上时，浊汁离心沉淀率升高且清液浊度下降，这可能是因为70 ℃条件下蛋白质等变性造成颗粒聚集，从而导致浊汁稳定性降低。由图1-C可以看出，2次均质对浊汁的离心沉淀率和清液浊度有显著的影响，能显著提高浊汁的稳定性。但是当均质次数超过3次后，浊汁的离心沉淀率上升且清液浊度下降。这可能是因为过多的均质次数使果汁中颗粒粒径变小、表面积增大、颗粒之间的相互作用增强，且均质过程中提供大量能量导致了小颗粒快速重新聚集[17-18]。
A-50 ℃/0～30 MPa/2次；B-30～70 ℃/20 MPa/2次；C-50 ℃/20 MPa/0～5次
图2 不同均质压力、进料温度和均质次数条件下离心沉淀率和上清液浊度的变化
Fig.2 Changes of centrifugal precipitation rate and turbidity of supernatant at different homogenizing pressure,
feeding temperatureand passes number
注：不同字母表示不同提取条件间差异显著(P<0.05),下同
均质压力、进料温度和均质次数变化对罗望子浊汁活性物质含量及抗氧化活性的影响如表1所示。对于所有的处理，浊汁中多糖含量与对照组相比均没有显著差异，这与BENGTSSON等的研究结果相似[19]。对于均质压力，较低的均质压力能显著提高浊汁总酚含量、DPPH自由基清除能力和羟自由基清除能力。15 MPa的均质压力处理与对照组相比，浊汁总酚含量、DPPH自由基清除能力和羟自由基清除能力分别提高了13.45%、10.06%和7.77%。但是对于过高的均质压力，浊汁黄酮含量、ABTS自由基清除能力和清自由基清除能力与对照组相比均发生显著下降。对于进料温度温度，随进料温度的上升，除多糖含量外所有指标均呈现下降趋势。当进料温度达到60 ℃时，总酚含量、黄酮含量、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和羟自由基清除能力与室温进料相比均下降显著。对于均质次数，2次均质有利于浊汁活性物质的溶出，但当均质次数达到4次，浊汁中总酚含量和黄酮含量显著降低。
这种现象可能由多种因素决定，一方面，高压均质减小果汁中悬浮物的粒度，可能使结合状态的酚类物质释放出来，成为游离态的酚类而被检测到[20]。但另一方面，由于高压均质处理激活了浊汁中多酚氧化酶和糖苷酶的活性，使浊汁中的部分多酚类物质降解[21]。且高压均质过程中的空穴效应可能使得浊汁溶解氧浓度升高，导致了多酚类物质的氧化分解[22]。另外，均质过程中使浊汁温度升高，可能导致体系内的化学反应和物理反应速率加快。
浊汁活性物质含量与浊汁体外抗氧化活性指标间相关性分析结果如图3，浊汁多糖含量与3种自由基清除能力间没有显著相关性，浊汁总酚含量与DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力间均呈现极显著正相关，相关系数分别为0.808和0.679。浊汁黄酮含量与羟自由基清除能力呈现显著正相关，相关系数为0.543；浊汁黄酮含量与ABTS自由基清除能力和DPPH自由基清除能力呈现极显著正相关，相关系数分别为0.934和0.581。酚类物质和黄酮类物质被认为具有良好的抗氧化活性，酚类物质和黄酮类物质与3种自由基清除能力的正相关关系说明了它们是影响罗望子浊汁抗氧化能力的重要因素。3种自由基清除能力之间也呈现较好的相关性，说明这3种体外抗氧化活性评价方法能有效地反映浊汁的抗氧化活性。
表1 均质条件变化对罗望子浊汁活性物质含量及抗氧化活性的影响
Table 1 Effect of homogenization conditions on the content of active substances and antioxidant activity in
turbid juice of tamarind
变化因素处理条件总酚含量/[mg·(100 mL)-1]黄酮含量/[mg·(100 mL)-1]多糖含量/(mg·mL-1)DPPH自由基清除能力/[mg Vc·(100 mL)-1]ABTS自由基清除能力/[mg Vc·(100 mL)-1]羟自由基清除能力/[mg Vc·(100 mL)-1]对照未进行均质处理67.56±0.94cd36.50±0.84efgh12.17±0.12a3.08±0.10abcde5.79±0.21cd289.51±3.20abc均质压力50℃/0 MPa/2次66.97±2.53c38.95±1.88ij12.85±0.65a2.97±0.16abc5.88±0.14d303.53±9.82cde50℃/5 MPa/2次72.50±0.92def37.85±0.93hij12.38±2.91a3.21±0.09defgh6.01±0.06d313.91±0.82d50℃/10 MPa/2次72.92±0.57efg37.62±0.67hij12.32±0.83a3.57±0.21i5.94±0.08d312.36±11.45d50℃/15MPa/2次76.57±1.47fg37.28±0.26fghi12.98±1.59a3.39±0.05ghi5.98±0.05d312.01±11.47d50℃/20 MPa/2次72.27±1.76def35.31±0.12def13.35±0.40a3.36±0.09fghi5.95±0.09d304.79±11.43cde50℃/25 MPa/2次67.14±0.92c32.75±1.36bc11.70±0.94a3.31±0.08fgh5.51±0.19c307.94±11.45de50℃/30 MPa/2次67.77±3.15cd31.33±0.57b12.31±1.44a3.22±0.14defgh4.90±0.23b314.83±6.72d进料温度室温/20 MPa/2次77.97±2.04g36.82±0.27efgh13.27±0.84a3.39±0.04ghi5.91±0.14d305.00±4.23cde30℃/20 MPa/2次77.08±3.70fg39.45±0.40i12.14±0.91a3.41±0.06hi6.01±0.29d310.91±6.46d40℃/20 MPa/2次75.61±3.38fg37.15±0.46fghi12.99±1.84a3.38±0.12ghi5.94±0.11d303.10±3.98cde50℃/20 MPa/2次72.27±1.76def35.01±0.92de11.62±0.65a3.34±0.04fgh5.73±0.11cd307.95±2.38de60℃/20 MPa/2次68.63±4.82cde31.68±0.69b12.04±0.79a3.15±0.02bcdef5.19±0.08b284.62±8.25ab70℃/20 MPa/2次59.97±0.55b25.35±0.44a12.41±1.47a2.89±0.03a4.51±0.23a275.17±6.16a均质次数50℃/20 MPa/1次73.03±1.03efg37.36±0.96ghi12.15±1.19a3.21±0.06defgh5.86±0.09d297.95±8.34bcde50℃/20 MPa/2次72.27±1.76def35.43±0.48defg12.76±0.36a3.28±0.03efgh5.88±0.09d297.79±6.50bcde50℃/20 MPa/3次66.07±0.88c34.13±1.25cd12.33±0.61a3.17±0.08cdefg5.79±0.21d292.12±5.82bcd50℃/20 MPa/4次58.63±0.77b32.20±1.02b13.28±0.56a3.03±0.04abcd5.51±0.02c306.87±4.73cde50℃/20 MPa/5次51.61±2.78a30.08±1.85b13.32±1.36a2.96±0.04ab5.17±0.14b300.43±1.92bcde
注：同一列不同小写字母表示具有显著性(P<0.05)
图3 浊汁活性物质含量与浊汁体外抗氧化活性指标间
相关性分析结果
Fig.3 Results of correlation analysis between the content
of active substances in turbid juice and the antioxidant activity
indexes in vitro
注：*表示在P<0.05水平条件下的相关显著性；**表示P<0.01
水平条件下的相关显著性
通过以上实验结果发现，适当的均质条件可以提高浊汁稳定性且较大程度保留浊汁的活性物质含量，但是过于强烈的均质条件会导致浊汁稳定性和活性物质含量下降。为在尽可能提高浊汁稳定性的前提条件下保留浊汁较高的抗氧化活性，选择进料温度水平为40、50和60 ℃，均质压力水平为15、20和25 MPa，均质压力水平为1、2和3次，以浊汁离心沉淀率和上清液浊度为评判指标进行正交实验。
由表2可知，离心沉淀率及上清液浊度均呈现相似的结果，各因素对浊汁离心沉淀率及上清液浊度影响的主次顺序为均质次数>均质压力>进料温度，得到最优提取工艺为A2B3C2，即：进料温度50 ℃、均质压力25 MPa、均质次数2次。对最优均质条件进行3次重复实验验证，在此均质条件下，罗望子浊汁离心沉淀率为1.18%、上清液浊度为435.50 NTU。
高压均质处理可以显著减小罗望子浊汁中颗粒的粒度，随着均质压力和均质次数的增加，浊汁粒度分布向低粒径区域移动。适当的均质条件可以提高罗望子浊汁的稳定性和抗氧化能力，过多的均质次数或进料温度不利于罗望子浊汁的稳定性，过高的进料温度和均质次数甚至会导致罗望子浊汁总酚和黄酮含量低于对照组(P<0.05)，但是浊汁多糖含量对均质条件的变化不敏感。相关性分析表明，浊汁中总酚含量和黄酮含量与浊汁DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和羟自由基清除能力呈现较好的相关性。通过正交实验对均质工艺进行优化，最优工艺条件为进料温度50 ℃、均质压力25 MPa、均质次数2次，在此均质条件下，罗望子浊汁离心沉淀率为1.18%、上清液浊度为435.50NTU。
表2 正交实验设计及极差分析结果
Table 2 Results of orthogonal experimental design
and range analysis
实验号ABCD评价指标进料温度/℃均质压力/MPa均质次数空列上清液浊度/NTU离心沉淀率/%11(40)1(15)1(1)1319.251.70 21(40)2(20)2(2)2406.251.20 31(40)3(25)3(3)3420.001.19 42(50)1(15)2(2)3409.501.23 52(50)2(20)3(3)1420.001.21 62(50)3(25)1(1)2359.251.44 73(60)1(15)3(3)2405.001.29 83(60)2(20)1(1)3330.251.57 93(60)3(25)2(2)1432.251.24k1381.80377.90336.30390.50k2396.30385.50417.00390.20k3390.20404.80415.00386.60上清液浊度极差R14.4026.9080.803.90主效应C>B>A最优组合A2B3C2k11.36 1.41 1.57 1.38 k21.30 1.33 1.22 1.31 k31.37 1.29 1.23 1.33 离心沉淀率极差R0.07 0.12 0.35 0.08 主效应C>B>A最优组合A2B3C2
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