血橙属甜橙类，其种植起源于欧洲。我国种植的血橙品种有路比(Ruby)、塔罗科(Tarocco)、桑吉耐洛(Sanguinello)、摩洛(Moro)等，主要从意大利、西班牙等国家引进[1]。目前，我国种植面积最广的是‘Tarocco’血橙[2]。血橙因富含多酚、类黄酮、抗坏血酸等具有抗氧化活性的物质，深受消费者喜爱。血橙是唯一含花色苷的柑橘，花色苷的积累使其果实呈现特有的紫红色[3]。花色苷是一种天然水溶性色素，属于黄酮类化合物[4]。花色苷是血橙中主要的抗氧化活性成分，具有极强的抗氧化性，可有效地清除羟自由基[5]、增强植物抗胁迫能力[6]。花色苷还对人体具有许多生理保健功能，如抗衰老、预防肥胖症、抗炎症[7-8]。因此，探究采后处理对血橙花色苷积累和抗氧化活性的影响具有重大意义。
温度对花色苷的积累有一定的影响[9-12]。SHINOMIYA等[9]对葡萄进行采前低温结合光照处理，花色苷合成途径的关键基因UFGT达到最高水平表达，从而促进花色苷积累，使得果皮色泽更加诱人。CARMONA等[10]报道在4 ℃和9 ℃下贮藏‘Moro’血橙均能增加花色苷的含量，且进一步研究发现，在9℃条件下可诱导血橙中花色苷合成相关的结构基因上调幅度显著，其中DFR/FLS远大于在4 ℃条件下贮藏，使二氢黄酮醇代谢途径更加偏向于生成花色苷的方向。PANNITTERI等[11]发现‘Tarocco’血橙在4 ℃下贮藏70 d花色苷的含量明显高于对照组(20 ℃)，但在1 ℃时贮藏20 d，血橙中花色苷含量没有明显的变化。而TSANIKLIDIS等[12]研究发现甜樱桃在1℃下贮藏，其花色苷含量低于对照组(20 ℃)，进一步研究得到，生成花色苷途径的结构基因ANS和UFGT表达降低。因此，在温度过低的情况下，反而抑制花色苷合成途径的基因表达，不利于果实中花色苷的积累。
由此可知，适宜的贮藏温度能更有效地增加果实中花色苷含量。目前，国内外对低温诱导花色苷合成的研究报道不少，但对于低温诱导血橙花色苷合成，同时维持果实的良好品质有待进一步研究。本实验拟通过不同温度贮藏‘Tarocco’血橙，探究贮藏温度对血橙花色苷合成规律及血橙果肉中的总酚、总黄酮含量和酶活性的变化规律，筛选出适宜血橙贮藏的温度，有利于提高血橙营养价值及商品价值，并为采后血橙品质调控提供理论依据及可行技术。
血橙品种为‘Tarocco’血橙，2019年2月26日下午在重庆市万州区血橙基地采摘，次日运回北碚区实验室。挑选出大小均匀，表面无损伤，无病害的果实，并用500 mg/L咪鲜胺溶液和250 mg/L 2,4-D溶液浸泡1 min，取出晾干备用。
乙酸钠(优级纯)，上海麦克林生物公司；Al(NO3)3(分析纯)，冰醋酸(优级纯)，成都市科隆化学品有限公司；愈创木酚(化学纯)，中国佘山化工厂；NaNO2、邻苯二酚、PEG 6000(分析纯)，成都市科龙化工试剂厂；福林酚试剂(生物试剂)，生工生物工程股份有限公司；儿茶素标准品和没食子酸标准品，南通飞宇生物科技有限公司。
PCR仪，成都立德赛科技有限公司；CF16RN高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；HZK-FA210S电子天平，福州华志科学仪器有限公司；CM-5分光色差仪，柯尼卡美能达公司。
1.3.1 样品处理
将晾干的血橙单果包装随机分在不同温度下贮藏。温度的选择参考相关文献[10-11]得出，并结合实际情况作相应调整：对照组，15～20 ℃、80%～85% RH(CK)；处理组1，6～8 ℃、80%～85% RH(T1)；处理组2，4～6℃、80%～85% RH(T2)，每组约300个果实，分别在空间大小都一致、且处于无光照条件下的冷库室及通风室内贮藏。每隔15 d随机取样1次，每组取15个果实进行各项指标测定，3个生物学重复。最后，果肉用液氮速冻后置-80 ℃的冰箱备用。
1.3.2 色差测定
柑橘榨汁，过滤混合后取样，根据CIE L*、a*、b*参数采用CM-5色差仪于室温下测得。参考CHEN[13]等采用色泽指数(citrus color index，CCI)表示柑橘果汁颜色变化。CCI值为正则表示红黄色，为负表示蓝绿色，值的绝对值越大代表颜色越深；为零表示红，黄和蓝绿复合色。CCI计算如公式(1)所示：
(1)
式中：L*为亮度；a*为红绿色差；b*为黄蓝色差。
1.3.3 花色苷含量测定
采用pH示差法[14-15]。使用两种缓冲液，pH=1.0的KCl缓冲液和pH=4.5的乙酸钠缓冲液。用相应的缓冲液(1∶6)稀释样品，于510 nm和700 nm处测定吸光度。
1.3.4 总酚含量和总黄酮含量测定
液氮研磨冷冻的血橙果肉样品，称取2 g粉末，加入80%甲醇10 mL，涡旋混匀，室温超声30 min，然后将混合液离心(22 ℃、5 000×g、10 min)，取上清液到25 mL容量瓶中，残渣重提1～2次，将所有上清液用80%甲醇定容于25 mL容量瓶中，混合后溶液置于5 mL离心管中，低温保存备用。
总酚含量测定：参考季露等[16]方法并略作修改。采用Foiln-Ciocalte法，用没食子酸作标准物。准确取待测样品溶液0.3 mL，加入1.2 mL蒸馏水，再加入福林酚试剂0.3 mL，混匀后暗反应6 min，再加入3 mL 7%Na2CO3、2.4 mL蒸馏水，室温静置90 min，于760 nm下测定吸光度，重复3次。以每克果蔬样品干重相当于没食子酸的毫克数。
总黄酮含量测定：参考季露等[16]和张东峰等[17]方法并略作修改。用儿茶素做标准物。准确称取待测溶液0.6 mL、2.4 mL 80%甲醇、0.3 mL 5%NaNO2溶液，混匀后静置6 min，再加入0.3 mL 10%Al(NO3)3溶液，混匀后静置6 min，最后加入2.4 mL 4%NaOH溶液，混匀静置15 min，于510 nm下测吸光度，重复3次。以每克果蔬样品干重相当于儿茶素的毫克数。
1.3.5 多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)和过氧化物酶(peroxidase，POD)活性测定
称取5 g血橙果肉冻样，置于预冷的研钵中，加入5 mL提取缓冲液(1 mmol聚乙二醇6 000、4%聚乙烯吡咯烷酮和1%Triton X-100)，在冰浴下研磨成匀浆，于4 ℃、12 000×g离心30 min，收集上清液，即为酶提取液，放置4 ℃低温保存备用。
PPO活性测定：参考ZHOU等[18]方法略作修改，取一支干净试管，向其加入4.0 mL 0.1 mol/L、pH 5.5乙酸-乙酸钠缓冲液和1.0 mL 100 mmol/L邻苯二酚溶液，再加入1 mL酶提取液，立即混合均匀，在波长420 nm测吸光度，重复3次。以每克果蔬样品在420 nm处每分钟吸光度变化值增加0.01为1个PPO活性单位。
POD活性测定：参考CHANCE等[19]方法略作修改，取一支干净试管，向其加入3 mL 25 mmol/L愈创木酚溶液、0.5 mL酶提取液，再加入200 μL 0.5 mol/L H2O2溶液迅速混合后启动反应，在波长470 nm测吸光度，重复3次。以每克果蔬样品在470 nm波长每分钟吸光度变化值增加1为1个POD活性单位。
1.3.6 RNA提取、cDNA第一链合成及荧光定量PCR
1.3.6.1 RNA提取和cDNA第一链的合成
根据Tiangen植物多糖多酚总RNA试剂盒操作说明书，提取果肉中RNA。以提取的RNA为模板，利用Tiangen FastKing RT Kit反转录试剂盒操作说明合成cDNA。
1.3.6.2 荧光定量PCR(qRT-PCR)
基因PAL、C4H、4CL、CHI、FLS、F3H、F3′5′H、DFR、ANS、UFGT、GST的引物参考CARMONA[10]等；内参基因(EF-1α)和CHS引物参考LO PIERO[20]等。qRT-PCR反应在96孔PCR板上加入如下反应体系：EvaGreen Express 2X，5 μL；Forward Primer，0.4 μL；Reverse Primer，0.4 μL；cDNA，1 μL；RNase-Free ddH2O，3.2 μL；总体积为10 μL。qRT-PCR反应使用BIO-RAD CFX96TM Real-Time Systerm仪器，其中反应程序是：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s；58 ℃、30 s；经过40个反应循环。溶解曲线为：95 ℃、10 s，降温至65 ℃之后再开始升温，维持5 s采集荧光信号，到95 ℃结束反应。每个模板做3次重复，采用2-△△CT法计算基因相对表达量。
采用Origin 2018软件绘图和SPSS 20.0软件进行单因素方差分析、LSD多重比较及Pearson相关系数分析。
血橙色差变化由L*、a*、b*、CCI参数大小来表示(图1)。L*值表示血橙果汁的亮度，整个贮藏期间，CK组在贮藏30 d急剧上升，显著高于T1、T2组，而T1、T2组在贮藏15 d后显著下降，趋于稳定状态；a*值表示果汁的红绿色差，在这里，a*值越大，表明红色越深。T1和T2组a*值逐渐升高，而CK组呈现下降趋势；b*值表示黄蓝色差，这里则表明b*值越大，黄色越深，CK组升高趋势显著，突出CK组贮藏的果实的果汁颜色会倾向于黄色；CCI值表示综合色差，CCI值越大，果汁红色越深，T1和T2组逐渐升高，而CK组逐渐下降，可能由于在贮藏期间CK组中的亮度变亮，黄色占主要颜色，反之T1和T2组亮度变暗，红色占主要颜色。其中，在贮藏后期，L*、a*、b*、CCI值在各处理温度之间均出现显著性差异(P<0.05)。
a-颜色变化；b-L*；c-a*；d-b*；e-CCI；CK-15～20 ℃；T1-6～8 ℃；T2-4～6 ℃；下同
图1 贮藏期间血橙颜色变化
Fig.1 Color changes of blood orange during storage
注：图中的不同字母表示在P<0.05范围内存在显著性差异
如图2-a所示，T1、T2组，血橙中的花色苷呈现逐渐上升的趋势。T2组，血橙果肉中花色苷从15.98 mg/L增加到28.36 mg/L。而CK组，血橙果肉中花色苷含量总体呈现下降趋势，贮藏到60 d时，血橙中花色苷含量为11.07 mg/L，与T1和T2组存在显著差异(P<0.05)。相较于CK组血橙中花色苷的积累，T1、T2组更有利于花色苷的积累。由此可见，花色苷生成对低温有一定依赖性，这与前人研究结果一致[21-22]。
如图2-b所示，总黄酮含量均增加。在整个贮藏中，CK、T1和T2之间不存在显著差异性(P>0.05)。其中，T2组的总黄酮含量一直呈现逐渐上升状态，贮藏至60 d时，达到最大值。如图2-C所示，血橙总酚含量也有一定的增加。T2组，其含量从0.76 mg/g增加到1.05 mg/g-1。其中，在贮藏至15，45，60 d时，CK与T1、T2均出现显著性差异(P<0.05)。
如图3-a所示，在整个贮藏期间，CK、T1组，POD活性呈现先下降再升高再下降，且贮藏至30 d时，POD活性达到最大值，随后CK组的酶活性出现大幅度下降。T2组，POD活性出现先下降再升高再降低再升高，且始终低于0 d时的酶活性。并且，在各个贮藏阶段，各处理温度之间均存在显著差异(P<0.05)。其中，CK组的POD活性保持在较高水平，而在T2组处于较低状态。
a-花色苷；b-总黄酮；c-总酚
图2 在贮藏期间花色苷含量、总黄酮含量、总酚含量的变化
Fig.2 Changes of anthocyanin content、total flavonoids content and total phenols content during storage
图3-b所示，CK组，PPO酶活性变化趋势与POD活性一致，在贮藏到30 d时出现最大值，之后急剧下降；T1组，酶活性呈现先下降再升高再下降，并在贮藏后期的PPO活性高于CK和T2组；T2组，PPO活性出现先下降后略微上升趋于平稳，处于最低水平。
a-POD；b-PPO
图3 贮藏期间血橙中POD、PPO的变化
Fig.3 Changes of POD and PPO in blood
oranges during storage
血橙中的花色苷合成通路已经有较为成熟的阐述[10]。首先，由苯丙烷代谢途径中的苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL)、肉桂酸羟化酶(cinnamate hydroxylase，C4H)、香豆酞CoA连接酶(coriander CoA ligase，4CL)、查尔酮合成酶(chalcone synthase，CHS)、查尔酮异构酶(chalcone isomerase，CHI)、黄烷酮-3-羟化酶(flavanone-3-hydroxylase，F3H)和类黄酮-3,5-羟化酶(flavonoid-3,5-hydroxylase，F3′5′H)的作用下发生一系列反应生成二氢黄酮醇。紧接着二氢黄酮醇可通过黄酮醇合成酶(flavonol synthase，FLS)作用下反应生成黄酮醇，还可由二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol-4-reductase，DFR)、花青素合成酶(anthocyanin synthase，ANS)和类黄酮3,5-糖苷转移酶(flavonoid 3,5-glycoside transferase，UFGT)作用下生成稳定的花色苷，最后，花色苷在谷胱甘肽转移酶(glutathione transferase，GST)作用下储藏于液泡中。
如图4所示，基因表达量T1、T2组均有增强。以二氢黄酮醇为分节点，即花色苷早期合成基因有PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H和F3′5′H；后期合成基因有DFR、ANS、UFGT和GST。从图中看出，早期合成基因中无相对一致的变化规律性。花色苷的合成初始基因PAL在3组温度中出现明显差异，CK组PAL表达量几乎为零，而T2组贮藏至15、30 d时，PAL表达量提高，达到0 d的10.5～11.0倍，并达到CK组的34.3～49.1倍。随后，在贮藏到60 d时，PAL表达量达到CK组的76倍。同时，T2组，早期结构基因CHS和F3′5′H表达量一直呈现上升趋势，在贮藏60 d时，与CK组相比，达到13.4倍(CHS)，9.92倍(F3′5′H)；与T1组相比，达到1.8倍(CHS)，1.3倍(F3′5′H)。其他早期合成基因C4H、4CL、CHS、CHI、F3H的表达量出现先升高后降低趋势，但均高于CK组。而另一条途径二氢黄酮醇通过黄酮醇合成酶(FLS)作用下反应生成黄酮醇中FLS的基因表达在各贮藏温度中均出现下调，T1和T2组基因下调更为显著。后期合成花色苷的基因DFR、ANS、UFGT和GST。T2组，贮藏至30 d时，达到了贮藏期间的较高值，与CK组相比，达到14.2倍(ANS)，5倍(UFGT)，16.2倍(GST)；贮藏到60 d时，相比CK组，达到16倍(DFR)，15.1倍(ANS)，8.1倍(UFGT)，28.4倍(GST)。尽管基因DFR、ANS、UFGT和GST在贮藏30 d达到较大值，但贮藏60 d时与CK组的比值更大，即随着贮藏时间加长，花色苷合成速率减缓，在CK组血橙中花色苷合成途径受到的影响更大。并且T1、T2组，DFR基因的高表达与FLS基因的低表达，从而诱导血橙中花色苷的生成。
a-PAL;b-C4H;d-SCL;e-CHI;f-F3H;g-F3′5′H;h-FLS;i-DFR;g-ANS;k-UFGT;l-GST
图4 血橙果肉中花色苷合成相关结构基因相对表达量的变化
Fig.4 Changes in relative expression of anthocyanin-related structural genes in blood orange pulp
如表1所示，在整个贮藏期间，血橙中花色苷含量与结构基因PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3′5′H、DFR、ANS、UFGT和GST呈正相关，与基因FLS呈现负相关，且结构基因之间也基本呈现显著正相关；基因C4H与其他结构基因和花色苷未有显著性。
血橙因含有花色苷，酚类物质、维生素等营养物质，得到广泛的关注。本文对血橙采后进行不同温度贮藏，贮藏30 d直至60 d，4～6 ℃条件的CCI值与15～20 ℃呈现显著差距，其血橙果汁红色逐渐加深。相应的，在4～6 ℃条件下的花色苷含量从30 d开始出现线性增加。进一步发现，血橙中花色苷合成的主要基因PAL、CHS、DFR、ANS、UFGT和GST的表达量处于较高水平，并与花色苷含量呈显著正相关。其中，C4H与花色苷含量之间存在较低的相关性，可能因为C4H属于花色苷合成的前期基因，而低温对花色苷合成的后期基因DFR、ANS、UFGT和GST有主要促进作用。则还可能是低温启动了血橙果实中Ruby转录因子表达，从而调控血橙中花色苷合成相关的后期结构基因表达显著上调。BUTELLI等[23]研究中低温启动了血橙中Ruby转录因子的显著表达，提高了花色苷合成的相关基因表达量，从而诱导血橙中花色苷积累。其他研究者也得出花色苷合成的结构基因受到相应转录因子的调控，进而影响结构基因的表达。KOBAYASHI等[24]报道了MYB基因调控UFGT基因表达上调，从而促进巨峰葡萄果实中花色苷积累。柑橘中R2R3-MYB转录因子基因CsMYBF1，该转录因子可激活CHS基因的启动子，提高CHS基因的表达[25]。在菊花中，CmbHLH2和CmMYB6结合调控DFR基因表达上调而提高花色苷的含量[26]。因此，之后还可对血橙中花色苷合成相关的转录因子进行更深一步研究。
表1 皮尔逊相关系数
Table 1 Pearson correlation coefficients
指标PALC4HCHS4CLCHIF3HF3′5′H FLSDFRANSUFGTGST花色苷PAL10.2710.946∗∗0.844∗∗0.817∗∗0.891∗∗0.702∗∗-0.329 0.872∗∗ 0.981∗∗ 0.941∗∗ 0.977∗∗ 0.669∗C4H10.2050.2790.2450.2590.114-0.0940.1950.260.2550.2560.134CHS10.862∗∗0.853∗∗0.953∗∗0.868∗∗-0.365 0.961∗∗ 0.955∗∗ 0.907∗∗ 0.973∗∗ 0.812∗∗4CL10.799∗∗0.920∗∗0.692∗∗-0.458 0.899∗∗ 0.914∗∗ 0.889∗∗ 0.917∗∗ 0.710∗∗CHI10.862∗∗0.639∗-0.018 0.903∗∗ 0.878∗∗ 0.923∗∗ 0.869∗∗ 0.673∗F3H10.848∗∗-0.374 0.943∗∗ 0.928∗∗ 0.887∗∗ 0.937∗∗ 0.781∗∗F3′5′H 1-0.319 0.835∗∗ 0.717∗∗ 0.619∗ 0.752∗∗ 0.836∗∗FLS1-0.349-0.336-0.241-0.373-0.249DFR1 0.928∗∗ 0.915∗∗ 0.945∗∗ 0.782∗∗ANS1 0.976∗∗ 0.992∗∗ 0.692∗∗UFGT1 0.964∗∗ 0.642∗GST1 0.751∗∗花色苷1
注：表中每列“**”表示P<0.01；“*”表示P<0.05
血橙中抗氧化活性成分除花色苷外，果实中富含的多酚、类黄酮也具有抗氧化活性。本文中4～6 ℃条件，血橙中的总酚、总黄酮含量高于15～20 ℃、6～8 ℃条件的果实，并在贮藏期逐渐上升。可能因为多酚、类黄酮均属于苯丙烷途径中的代谢产物，4～6 ℃条件提高PAL、CHS、4CL的基因表达量，促进了多酚及类黄酮的积累，从而增强了果实的抗氧化性。HABIBI等[27]研究发现了血橙中的花色苷和酚类物质可增强总抗氧化活性。这一结果与何礼等[28]一致，低温诱导花色苷积累，花色苷含量与血橙果实的抗氧化性呈显著正相关。说明在4～6 ℃条件下，血橙中的花色苷和总酚可提高果实的抗氧化能力。
POD和PPO活性高低与果实中酚类物质的氧化有关[29-30]。图3所示，在4～6 ℃条件下贮藏血橙，POD和PPO活性均处于较低水平。由此可见，该温度贮藏抑制了果实中POD和PPO活性，降低血橙果肉中酚类物质的氧化，而使血橙中酚类物质的含量高于15～20 ℃、6～8 ℃条件的果实。这一结论与王雅楠等[29]一致：水扬酸(salicylicacid，SA)处理李果实，推迟POD和PPO活性上升，降低酚类物质氧化，从而减轻了果实褐变程度。
本文中低温诱导血橙果实合成花色苷结构基因的表达，从而促进花色苷积累。同时，还提高果实中总酚总黄酮含量，增强了果实的抗氧化性，从而保持血橙采后品质。其中，以4～6 ℃贮藏的血橙中花色苷含量、总酚总黄酮含量最高，所以4～6 ℃贮藏血橙最适宜。但本文对血橙果实抗氧化活性只在于初步研究，针对低温下果实抗氧化活性变化规律还需进一步研究。
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