柑橘类水果是世界第一大水果，并且是位于小麦、玉米之后的第三大贸易农产品[1]。其中有近2/5的柑橘用于加工成汁。血橙为柑橘属橙种，我国主要种植的血橙品种为来自意大利的塔罗科。其个头大，果肉细腻多汁，口感酸甜适中，无核，营养价值非常高[2]。近年来，由于我国经济增速放缓，果汁行业产品创新性低，加之其以低浓度果汁为主的不合理产品结构导致消费者消费欲望降低。随着人均GDP的不断上升，人们的生活态度也发生着翻天覆地的变化，更注重高膳食纤维、高蛋白的健康营养饮食习惯。高浓度果汁在果汁饮料零售量中仅占5%左右，鲜榨血橙汁是一种可以很好地保留血橙本身的营养物质和酸甜可口味蕾体验的高浓度果汁，但其贮藏期短仍是限制其销量和规模化市场推广的主要原因。在4 ℃冷藏条件下，采用向鲜榨血橙汁中添加ε-聚赖氨酸的方式减少巴氏杀菌、瞬时杀菌、超声微波杀菌对营养成分的损耗，从而提高对鲜榨血橙汁营养成分的保留并延长其货架期。
ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine)以下简写为(ε-PL)是从链霉菌属的代谢分泌产物中得到的天然食品添加剂[3]。其具有广谱抑菌性[4]、广泛的pH使用范围、耐高温、溶水性强、协同增效性强、安全性高[5]等优势。2014年ε-聚赖氨酸被正式列入中国食品添加剂名录，在《食品添加剂使用标准》中明确规定可应用于焙烤食品、熟肉制品、果蔬汁类制品[6]，且规定限量均为0.2 g/L(以下均写为200 μg/mL)。
本文以鲜榨血橙汁为研究对象，探究在贮藏期内鲜榨血橙汁理化指标、感官指标、微生物指标的变化以及ε-聚赖氨酸对鲜榨血橙汁中优势腐败菌群的抑菌效果。以ε-聚赖氨酸的防腐保鲜功能为基础，为日后鲜榨果汁的规模化贮藏提供一些理论研究。以ε-聚赖氨酸在人体内可以被分解为赖氨酸的保健功能为依据，为改善当前国内果汁产品结构提供一种新思路。
血橙，湖北宜昌；ε-聚赖氨酸(99.5%)，河南郑州拜纳佛生物工程股份有限公司；0.1 mol/L NaOH标准溶液，上海麦克林生化科技有限公司；YPD固体培养基、LB液体培养基，国药集团化学试剂有限公司；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)，大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，源自于实验室保藏菌种。
BAM培养基：CaCl2 0.25 g，MgSO4 0.50 g，(NH4)2SO4 0.20 g，酵母粉 2.00 g，葡萄糖 5.00 g，KH2PO4 3.00 g，蒸馏水1 000 mL，pH 4.0。
原汁榨汁机，德国贝尔斯顿；实验室pH计，梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司；阿贝折光仪，上海精密科学仪器有限公司；高精度分光测色仪，美国Hunterlab公司；气相色谱质谱联用仪，日本岛津公司；Agilent 1100高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司。
1.3.1 样品制备
鲜榨血橙汁实验室制备工艺流程：
1.3.2 微生物指标测定
1.3.2.1 不同ε-聚赖氨酸添加量对鲜榨血橙汁的抑菌效果
实验室自制鲜榨血橙汁与家庭自制鲜榨血橙汁洁净程度相当，为提高鲜榨血橙汁的卫生质量，向鲜榨血橙汁中加入25、50、100、200、400 μg/mL的ε-聚赖氨酸，以不加ε-聚赖氨酸的鲜榨血橙汁为对照组。按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》(GB 4789.2—2016)[7]中给出的方法进行测定。
1.3.2.2 ε-聚赖氨酸对鲜榨血橙汁中优势腐败菌的最小抑菌浓度及生长曲线的影响
参照贾振宇等[8]的试验方法，将酸土脂环酸芽孢杆菌、酿酒酵母分别在45、30 ℃下培养至生长对数期的菌悬液经4 000 r/min，离心10 min，并弃掉上清液。用生理盐水重复洗涤2次，最后用生理盐水重悬菌体，使重悬菌液浓度在106CFU/mL左右。采用二倍梯度稀释法配制一系列浓度梯度的ε-聚赖氨酸溶液，并参照SU等[9]的实验方法进行MIC测定。并结合1.3.2.1中抑菌效果来确定鲜榨血橙汁中ε-聚赖氨酸的最适添加量。
按照上述前处理步骤处理菌悬液，选取1/2×MIC、MIC、2×MIC、4×MIC的ε-聚赖氨酸溶液，与培养基及菌悬液混合。24 h内，每隔2 h取样1次，用酶标仪测定OD600下的吸光度，并绘制生长曲线。
1.3.2.3 鲜榨血橙汁在贮藏期内酵母菌、霉菌及菌落总数的变化
参照1.3.2.1中菌落总数测定方法以及《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》(GB 4789.15—2016)[10]，在平板计数琼脂培养基以及马铃薯葡萄糖琼脂培养基上涂布、计数。
1.3.3 鲜榨血橙汁在贮藏期内色值及呈味物质测定
参照张梦月[11]及郭莉等[2]的试验方法并稍加改动测定鲜榨血橙汁的色差值(ΔE)和呈味物质。吸取20 mL样品加入比色池，用高精度分光测色仪进行色差值测定。取2 mL样品，2 g NaCl，4 mL蒸馏水于固相微萃取专用样品中，采用顶空-固相微萃取-气质联用技术(HS-SPME-GC-MS)进行呈味物质测定。
1.3.4 理化指标测定
1.3.4.1 鲜榨血橙汁在贮藏期内可滴定酸、pH、可溶性固形物的测定
参照《柑桔鲜果检验方法》(GB/T8210—2011)[12]和张梦月[11]的试验方法，测定鲜榨血橙汁的可滴定酸(titratable acid，TA)、pH、可溶性固形物(soluble solid,SS)。
1.3.4.2 鲜榨血橙汁在贮藏期内可溶性糖的测定
参照李申[13]的试验方法，吸取3 mL样品加入7 mL 95%乙醇进行4 000 r/min，10 min离心后，取上清液，0.22 μm水系微孔滤膜处理后，采用高效液相色谱法测定0 d、15 d蔗糖、葡萄糖、果糖的含量变化。
1.3.4.3 鲜榨血橙汁在贮藏期内游离氨基酸的测定
参照李申[13]的试验方法，取1 mL样品用10 g/100mL三氯乙酸对样品进行等体积稀释，经双层滤纸过滤，在通过15 000 r/min，30 min离心，取上清液，经过0.22 μm水膜在过滤，最后装400 μL上清液于液相专用样品瓶，采用高效液相色谱法测定0、5、10、15 d游离氨基酸的含量变化。
1.3.5 数据统计与分析
每次试验重复3次,且每组有3次平行实验，用Excel初步记录与统计数据。利用Origin 2019与SPSS 23数据处理软件进行作图及单因素方差分析进行显著性差异分析(P<0.05)。
2.1.1 不同ε-聚赖氨酸添加量对鲜榨血橙汁的抑菌效果
据不完全统计，我国每年被其他国家扣留不准入境的果蔬制品主要原因是微生物污染。鲜榨果汁微生物污染多发生于在原料处理阶段、加工制作阶段。有研究表明,因为加工制作环境不同导致市售鲜榨橙汁菌落总数、霉菌及酵母菌计数是家庭自制鲜榨橙汁的几十倍到几百倍[14]。鲜榨血橙汁饮料只有微生物指标符合相关标准，才能有效避免由于微生物所引起的食源性中毒。由图1可知：在6 d贮藏期内，当ε-聚赖氨酸添加量为200 μg/mL及400 μg/mL的鲜榨血橙汁菌落总数符合《食品安全国家标准 饮料》(GB 7101—2015)[15]所给出≤ 104 CFU/mL的微生物限量。根据《食品添加剂使用标准》[6]中给出ε-聚赖氨酸的200 μg/mL的添加限量及实验结果，建议本实验中ε-聚赖氨酸的最适添加量为200 μg/mL。
图1 不同ε-聚赖氨酸添加量的鲜榨血橙汁在冷藏过程中
的菌落总数
Fig.1 The total number of colonies in freshly squeezed blood
orange juice with different ε-PL addition during cold storage
2.1.2 ε-聚赖氨酸对鲜榨血橙汁中优势腐败菌的最小抑菌浓度及生长曲线的影响
橙汁中常出现的微生物主要有嗜酸耐热菌(酸土脂环酸芽孢杆菌)[16]、酵母菌(酿酒酵母)[17]等。如表1所示,ε-聚赖氨酸对酿酒酵母、酸土脂环酸芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌都有良好的抑制作用。ε-聚赖氨酸对4株实验菌的MIC分别为200、128、128、8 μg/mL。由于酸土脂环酸芽孢杆菌、酿酒酵母是鲜榨血橙汁中的主要优势腐败微生物，所以本文选择酸土脂环酸芽孢杆菌、酿酒酵母进行后续实验。由图2可知,ε-聚赖氨酸使酸土脂环酸芽孢杆菌、酿酒酵母的生长速率减小，表现为生长对数期菌悬液吸光度值增长速度减缓。高浓度的ε-聚赖氨酸可以完全抑制酸土脂环酸芽孢杆菌、酿酒酵母24 h内的生长。根据不同ε-聚赖氨酸添加量对鲜榨血橙汁抑菌效果及对优势腐败菌的最小抑菌浓度结果，可以认为ε-聚赖氨酸最适添加量为200 μg/mL。
表1 ε-聚赖氨酸对鲜榨血橙汁中优势腐败菌的最小抑菌浓度 单位：μg/mL
Table 1 Minimum inhibitory concentration of ε-PL on
dominant spoilage bacteria in freshly squeezed blood
orange juice
优势腐败菌ε-聚赖氨酸酿酒酵母 200 大肠杆菌 128 金黄色葡萄球菌 128 酸土脂环酸芽孢杆菌8
2.1.3 鲜榨血橙汁在贮藏期间酵母菌、霉菌及菌落总数变化
鲜榨血橙汁是一种具有原料血橙的典型感官特征的水果原汁，由于其pH值一般在2.4～4.2，大部分微生物在这种条件下无法生长，因此酸性橙汁具有天然防腐之效。但随着贮藏期的延长，耐高酸的微生物仍会滋生。其中，酸土脂环酸芽孢杆菌会使橙汁出现异味、变酸和浑浊等不良感官体验；酵母菌可以在高酸、高糖的条件下发酵橙汁使其出现产气涨瓶等现象；部分霉菌则需要在有氧条件下生长，橙汁长霉主要表现为包装容器瓶口发黑发霉。如图3所示,在15 d内，对照组的菌落总数、霉菌数在第6天、第9天时分别达到2×104CFU/mL、80 CFU/mL；虽酵母菌数≤20 CFU/mL，但此时对照组已经不符合国家所给出的卫生标准；而实验组的菌落总数≤ 104CFU/mL、酵母菌及霉菌≤ 20 CFU/mL[15]。第18天时，实验组的菌落总数、酵母菌均未超过规定微生物限量；但霉菌数已经超过微生物限量。而对照组的菌落总数急剧增加主要原因是明串珠菌及乳酸菌发酵糖类所引起，使鲜榨血橙汁出现黏稠变质的现象[18]。综上所述：本实验以15 d为最佳贮藏期，后续实验均在15 d内测定鲜榨血橙汁相关指标。
a-酿酒酵母；b-酸土脂环酸芽孢杆菌
图2 酿酒酵母、 酸土脂环酸芽孢杆菌在含有不同
ε-聚赖氨酸添加量YPD、BAM中的生长曲线
Fig.2 Growth curves of Saccharomyces cerevisiae、
Alicyclobacillus acidoterrestris cultured in YPD、BAM
with various addition amount of ε-PL
a-霉菌；b-酵母菌；c-菌落总数
图3 鲜榨血橙汁在贮藏期内酵母菌、霉菌、菌落总数检测结果
Fig.3 The total number of freshly squeezed blood orange juice yeast, mold and colonies during storage
2.2.1 鲜榨血橙汁在贮藏期内理化指标及色值变化
pH、可滴定酸、可溶性固形物、色差值是鲜榨血橙汁最基本的理化及感官指标。贮藏期内上述指标检测结果如表2所示。在贮藏期内，对照组和实验组的鲜榨血橙汁pH和可滴定酸含量均无显著性差异(P>0.05)。这说明ε-聚赖氨酸并不会导致鲜榨血橙汁pH、可滴定酸的变化。对照组的可溶性固形物含量在贮藏期内呈现下降趋势，而实验组的鲜榨血橙汁基本维持在正常塔罗科血橙汁的10%～12%的可溶性固形物。由于添加ε-聚赖氨酸的血橙汁，出现了不同程度的微小颗粒。原因在于ε-聚赖氨酸为阳离子聚合物能和带负电的果胶、蛋白质结合，破坏整体的稳定结构，导致颗粒形成[19-21]，而细小颗粒引起的浑浊使折光率升高，使得可溶性固形物含量的测定值随着升高[22]，而这也是实验组的可溶性固形物含量测定值相对稳定的原因。此外，色差值为最直观的评定方法之一，表中ΔE为色差值(其中对照组为蒸馏水)，对照组的色差值在15 d时已经发生肉眼可见的明显变化(P<0.05)，但实验组的色差值则无明显变化(P>0.05)，说明ε-聚赖氨酸对鲜榨血橙汁的色泽保护有一定作用[23]。
表2 鲜榨血橙汁贮藏期内pH、可滴定酸、可溶性固形物、色值的变化
Table 2 Changes in pH, TA, SS and ΔE of freshly squeezed blood orange juice during storage
贮藏时间/d对照组实验组pHTA/[g·(100 mL)-1]SS/%ΔEpHTA/[g·(100 mL)-1]SS/%ΔE04.02±0.02a0.32±0.02a12.33±0.31a92.54±0.42a3.93±0.02a0.34±0.02a11.73±0.31a92.65±0.19a33.96±0.01a0.33±0.01a12.03±0.15a91.92±0.66a3.92±0.05a0.33±0.02a12.43±0.32a92.27±0.12a63.84±0.03a0.32±0.01a10.60±0.46b92.20±0.39a3.69±0.02a0.32±0.03a11.80±0.10a92.57±0.15a93.83±0.02a0.36±0.01a9.37±0.21c92.38±0.38a3.72±0.05a0.35±0.01a11.23±0.15a92.44±0.15a123.74±0.03a0.35±0.02a9.07±0.12c92.41±0.69a3.75±0.02a0.33±0.01a11.07±0.12a92.65±0.48a153.84±0.02a0.33±0.01a9.20±0.20c78.11±0.50b4.04±0.03a0.34±0.00a11.40±0.20a92.35±0.27a
注：不同小写字母表示显著
2.2.2 鲜榨血橙汁在贮藏期内呈味物质的结果分析
用HS-SPME-GC-MS法分析得到鲜榨血橙汁呈味物质的总离子流色谱图，呈味物质组分及相对含量见图4和表3。塔罗科血橙汁主要呈香物质是柠檬烯、脂类与烯烃类。对照组和实验组的鲜榨血橙汁均有检出丁酸乙酯、己酸甲酯、己酸乙酯、己酸戊酯、香樟醇、5-十一烯等水果香气物质[24-25]。表3中40种呈味物质中柠檬烯相对含量最高，并远远高于其他呈味组分，可见将血橙榨成汁后，柠檬烯仍为主要的呈味成分。酮类和萘类对鲜榨血橙汁的呈味物质有一定影响，其中环戊酮和萘分别呈薄荷香气、香樟木气味。在添加200 μg/mL ε-聚赖氨酸后，鲜榨血橙汁中的主要呈味物质种类和含量并无明显变化，但在一定程度上减少了环戊酮的相对含量，说明添加ε-聚赖氨酸不会造成鲜榨血橙汁风味的异常变化并可以很好地保留鲜榨血橙汁的风味。
a-原液0 d；b-ε-聚赖氨酸0 d；c-原液15 d；d-ε-聚赖氨酸15 d
图4 鲜榨血橙汁呈味物质总离子流色谱图
Fig.4 Chromatogram of total ion chromatogram of freshly squeezed blood orange juice
2.2.3 鲜榨血橙汁在贮藏期内可溶性糖的结果分析
鲜榨血橙汁中含有丰富的葡萄糖、果糖和蔗糖。由图5可知，对照组在贮藏15 d时，蔗糖、葡萄糖、果糖的损失率分别为58.69%、56.60%、55.14%。鲜榨血橙汁含有的大量营养成分会加快微生物的生长，正如图3所示菌落总数达到2×104CFU/mL，霉菌计数达到50 CFU/mL以上，微生物的大量滋生导致可溶性糖迅速降解[26]。而实验组在贮藏15 d时，蔗糖、葡萄糖、果糖的损失率分别为18.73%、3.05%、1.28%，相较于对照组可溶性糖的损失量明显减少，说明添加ε-聚赖氨酸可以很好地降低可溶性糖的损失。这可能是因为鲜榨血橙汁中的阴离子型果胶和阳离子型ε-聚赖氨酸形成静电复合物进而改变体系的聚集稳定性、溶解度等[27]。实验结果表明，ε-聚赖氨酸与果胶静电复合物不仅能够保持ε-聚赖氨酸的抑菌活性[28-29]，而且能很好地抑制鲜榨血橙汁中的微生物生长，减少可溶性糖类的损失。利用葡萄糖等单糖作为碳源的微生物数量远高于利用蔗糖作为碳源的微生物，ε-聚赖氨酸的广谱抑菌性使得大部分微生物无法正常生长，表现为葡萄糖，果糖的损失量无显著差异(P>0.05)。
表3 鲜榨血橙汁40种呈味物质
Table 3 Freshly squeezed blood orange juice
40 kinds of taste substances
物质名称保留时间/min峰面积占比/%环戊醇2.3930.16丁酸乙酯3.820.5顺-2-己烯-1-醇5.6170.092-甲基环戊酮6.10326.965-己酸甲酯6.4570.24乙酸戊酯6.630.19己酸甲酯6.8570.42左旋-alpha-蒎烯7.0430.344-己烯-1-醇戊酸酯7.870.69水化梨松烯8.190.173-辛酮8.610.09β-蒎烯8.7972.73戊酸丙酯8.9170.27己酸乙酯9.010.193-蒈烯9.290.15-乙基-6-十一烷酮9.5372.84D-柠檬烯10.27727.3乙酸环己酯10.250.25双(环己氧基)乙基-硼烷10.830.261,4-二氧硅[4.5]癸烷10.9430.135-十一烯11.7770.09芳樟醇12.0630.231-丁氧基-2-己烯12.490.253-羟基己酸乙酯12.911.09戊基环己烷13.074.8柠檬烯氧化物13.1830.12己酸戊酯17.4830.141-乙烯基-1-甲基-2,4-双(1-甲基乙烯基)-环己烷19.4170.17石竹烯19.9030.16别香橙烯20.2370.26蓝烯20.550.362-异丙烯基-二甲基-十八氢萘20.690.85二甲基-7-(1-甲基乙烯基)-萘20.8310.083,4-二氢-6-甲氧基-萘酮20.9430.585-三甲基-6-亚丁烯基-4-环乙烯21.610.26螺[4.5]DEC-7-羟基-6-酮21.7030.16石竹烯氧化物21.750.126-甲基-六氢萘22.1170.15β-新丁香22.4230.346-芹子烯-醇22.4970.13诺卡酮23.730.11
注：上表采用峰面积归一化法计算统计得出
图5 贮藏期内鲜榨血橙汁可溶性糖含量变化
Fig.5 Soluble sugar content of freshly squeezed
blood orange juice during storage
注：同一颜色下不同小写字母表示具有显著性差异(P<0.05)
2.2.4 鲜榨血橙汁在贮藏期内游离氨基酸的结果分析
人体内氨基酸的稳定和适量的摄入是健康的基础，任何一种氨基酸供应缺乏，都会影响机体的免疫系统和生理功能的运作及发挥，使机体变成更易遭受疾病的侵袭的亚健康状态。游离氨基酸可以被人体吸收利用，鲜榨果汁可以作为一种供给氨基酸的高氨基酸食品。对鲜榨血橙汁中游离氨基酸总量测定如图6所示，在0 d时，对照组和实验组的鲜榨血橙汁中游离氨基酸的含量均保持在300 mg/100 mL的正常范围。但随着贮藏时间的延长，对照组和实验组的鲜榨血橙汁在贮藏15 d时损失率分别达到30.15%、26.63%。相较于对照组，实验组的鲜榨血橙汁损失量相对较低。微生物生长受到ε-聚赖氨酸抑制是减少游离氨基酸损失的主要原因[30]。鲜榨血橙汁中游离氨基酸的种类及含量在图7中均有体现。其中，以脯氨酸为代表的中性氨基酸、天冬氨酸为代表的酸性氨基酸及以精氨酸为代表的碱性氨基酸在15 d贮藏期内呈现下降趋势。赖氨酸作为第一限制性氨基酸，在15 d贮藏期内对照组与实验组的鲜榨血橙汁赖氨酸的含量基本维持10 mg/100 mL左右，呈现基本不变的趋势。但实验组的鲜榨血橙汁中含有ε-聚赖氨酸，而ε-聚赖氨酸只有在被人体摄入后可以分解为赖氨酸，更多地提供人摄入ε-聚赖氨酸的渠道。
图6 鲜榨血橙汁在贮藏期内游离氨基酸总含量
Fig.6 Total free amino acid content of freshly
squeezed blood orange juice during storage
a-对照组与试验组贮藏0 d；b-对照组与实验组贮藏5 d；c-对照组与试验组贮藏10 d；d-对照组与试验组贮藏15 d
图7 鲜榨血橙汁在贮藏期内17种游离氨基酸含量
Fig.7 17 free amino acids content of freshly squeezed blood orange juice during storage
本文主要研究了4 ℃贮藏条件下，添加200 μg/mL ε-聚赖氨酸的鲜榨血橙汁的贮藏期以及贮藏期内色泽、风味物质、pH、可滴定酸、可溶性固形物、游离氨基酸、可溶性糖的变化。与未添加ε-聚赖氨酸相比，添加200 μg/mL ε-聚赖氨酸的鲜榨血橙汁具有更长的贮藏期及相对稳定的贮藏品质，主要原因是ε-聚赖氨酸通过抑制鲜榨血橙汁冷藏过程中的微生物生长，进而降低由于微生物导致的可溶性糖发酵、游离氨基酸降解等品质劣化[31]。ε-聚赖氨酸作为一种具有广谱抑菌性的天然微生物防腐剂被允许使用在果蔬汁制品中，且其对鲜榨血橙汁贮藏品质的稳定有着重要作用，表明ε-聚赖氨酸在鲜榨果汁中具有良好的应用前景。
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