表1 双孢蘑菇感官指标评价标准
Table 1 Standard of sensory properties
评分/分开伞色泽异味是否发黏质地8～10无色泽洁白无无有弹性6～8轻度开伞色泽洁白稍异味稍发黏稍软4～6明显开伞稍褐变明显异味明显发黏明显软烂<4开伞严重严重褐变异味严重严重发黏严重软烂
双孢菇因其味道好，营养高，已成为世界上最广泛栽培及食用的菌种[1]。但双孢菇呼吸作用强，菌体易腐败[2]。根据市场调研，双孢菇需要在不同地点收集后统一贮藏，由于地点不同，收集时间分散，经销商很有可能不方便对蘑菇进行入库前统一处理，因此探讨收入冷库后再处理的方式对蘑菇品质的影响，寻找替代入库前处理的方法具有现实操作意义。
目前对于双胞菇采后贮藏保鲜措施有气调保鲜[3]、臭氧处理[4]、辐照保鲜[5]、涂膜保鲜[6]以及化学药剂处理[7]等。乙醇作为植物天然代谢物[8]，无毒无害，不易残留，应用到果蔬中能够杀灭微生物[9]，抑制呼吸作用从而起到保鲜效果[10]。同时乙醇便宜易得，熏蒸操作简单，挥发后无残留，更安全、更容易为消费者接受。HAN等[11]用浓度为6 mL/kg乙醇处理西兰花，结果显示乙醇能有效抑制西兰花贮藏阶段失重率；WANG等[12]以乙醇蒸气熏蒸枇杷，发现乙醇能有效抑制真菌引起的炭疽病；刘洪丽[13]的研究证明乙醇能有效减弱鲜切荸荠呼吸强度；WANG等[14]以浓度为150～750 μL/L乙醇熏蒸鲜切菊芋，发现菊芋的呼吸强度、PAL酶活和总酚含量的上升趋势得到显著抑制。有研究表明，入库前乙醇处理菇类能够有效改善其采后品质[15]，但目前乙醇处理时间主要集中在入库前，有关乙醇处理时期的研究极为匮乏。所以本文研究乙醇处理的不同时期对双孢菇保鲜品质的影响，在经销商没有时间进行入库前处理的情况下，寻找一种补救措施以延长双孢菇的保鲜期。
从北碚种植户得到无病虫害和机械损伤的双孢蘑菇，要求种植户采后8 h内运送至实验室。
Headspace analyzer，Pac Check® Model 650EC，US MOCON)；色差仪，UltraScan® PRO，HunterLab,USA；UV 分光光度计 (UV-2450PC)，岛津制作所。
挑选尺寸接近，无病害，无机械损伤，处于闭伞阶段的双孢菇进行处理，试验共有4组，每组3个平行。
A组：入库前对A组进行乙醇熏蒸处理(乙醇浓度400 μL/L，时间3 h)，熏蒸温度保持25 ℃。熏蒸完毕，通风半小时后保持温度在2～4 ℃预冷0.5 h，最后分装到统一体积PE袋(每袋100 g)，共21袋放入冷库(温度2～4 ℃，湿度95%)贮藏12 d，每隔1 d随机取3袋检测指标。
B组：入库后即分装至PE袋(每袋100 g)贮藏12 d，冷库温度2～4 ℃，湿度95%。贮藏第4天重复A组熏蒸处理，从入库开始每隔1 d随机取3袋检测指标。
C组：入库后即分装至PE袋(每袋100 g)贮藏12 d，冷库温度2～4 ℃，湿度95%。贮藏第8天重复A组熏蒸处理，从入库开始每隔1 d随机取3袋检测指标。
CK组：入库后即分装至PE袋(每袋100 g)贮藏12 d，冷库温度2～4 ℃，湿度95%。从入库开始每隔1 d随机取3袋检测指标。
1.4.1 呼吸强度
通过顶空分析仪静置法[16]测定。呼吸强度以每小时每千克双孢蘑菇在呼吸代谢过程中释放的CO2的质量表示。
1.4.2 PAL(phenylalamine ammonialyase)活性
参考曹健康等[17]方法。以每小时每克(鲜重)菇肉组织酶促反应体系吸光度值增加0.01为1个PAL活性单位(U)。
1.4.3 总酚含量
参照ZHOU等[18]方法。以每克(鲜重)菇肉组织在波长280 nm处吸光度值表示总酚含量(U)。
1.4.4 PPO(polyphenol oxidase)活性
参考OMS-OLIU等[19]方法并略做修改。以每克果蔬样品每分钟吸光度变化值增加0.01为一个活性单位。
1.4.5 POD(perxidase)活性
参考MOERSCHBACHER等[20]方法并稍作修改。在470 nm处测吸光度值，以每克果蔬样品每分钟吸光度变化值增加0.01为1个过氧化物酶活性单位(U)，计算POD活性。
1.4.6 相对电导率
参考蒋冬花等[21]方法。以蘑菇的相对电导率值来表示其相对电导率。
1.4.7 菌落总数
参照GB/T 4789.2—2016[22] 测定菌落总数，结果以lgCFU/g表示。
1.4.8 硬度
参考JIANG等[23]方法。硬度用美国CT-3型质构仪测定，探头直径为5 mm，将双孢蘑菇去柄，菌盖上切掉2 mm厚的表皮，将切好的双孢蘑菇固定在操作台上，保持双孢蘑菇切面与探头接触面平行，探头以2 mm/s的穿刺速率进行下压，下压深度为6 mm，通过力与时间的作用曲线，以最大峰值(Nmax)为硬度指标。
1.4.9 白度
参考JAWORSKA等[24]方法，略有改动，L*值越大表示白度越大。
1.4.10 感官评价
由经过培训的6人对双孢蘑菇的色泽、质地、异味等感官指标进行评定。感官指标评定标准如表1所示。
表1 双孢蘑菇感官指标评价标准
Table 1 Standard of sensory properties
评分/分开伞色泽异味是否发黏质地8～10无色泽洁白无无有弹性6～8轻度开伞色泽洁白稍异味稍发黏稍软4～6明显开伞稍褐变明显异味明显发黏明显软烂<4开伞严重严重褐变异味严重严重发黏严重软烂
采用Microsoft Excel 2010 进行数据整理，用SPSS 13.0、LSD法对各项指标进行显著性分析，显著性水平为0.05。Origin 2016对数据进行图像处理。
双孢菇作为呼吸跃变型园艺产品，采摘后得不到能量补充，只能通过呼吸作用消耗自身有机物以获得能量。呼吸作用产生大量水汽和呼吸热滋生细菌，影响双孢蘑菇商品性和耐贮性。根据图1，处理组和对照组双孢菇呼吸强度均上升到第2天后下降。A组双孢菇的呼吸峰值显著低于CK组(P<0.05)。B组在第4天处理后呼吸强度短暂上升至第6天，这可能是B组熏蒸处理时从冷柜中转移出来，温度上升，也可能是重新包装后新包装内高氧气促进了双孢菇的呼吸强度。
B组呼吸强度从第6天开始迅速减少，并在第10天与CK组有极明显差异(P<0.05)，呼吸强度明显低于A组(P<0.05)，这可能是由于乙醇对部分细菌有即时杀灭作用，从而抑制菇上微生物呼吸作用，也可能是因为乙醇使呼吸作用酶失活[25]。同时有研究表明，乙醇能降低乙烯合成相关酶活性以减弱双胞菇呼吸作用[26]。B组处理时间居中，乙醇在贮藏末期残留较A组多，故而维持呼吸作用酶较低活性的效果优于A组。C组与CK组在整个贮藏过程中没有差异，或许是因为后期乙醇熏蒸对双孢菇作用不大。综上，A、B组处理后均能有效减弱呼吸作用，C组则作用不大。
图1 不同时期乙醇处理对双孢菇呼吸强度的影响
Fig.1 Effect of ethanol treatment used at different times
during storage on respiration rate of Agaricus bisporus
PAL酶催化L-苯丙氨酸并同时生成酚类物质从而导致双孢菇褐变[27]，失去商品价值。根据图2，各组PAL活性贮藏前2天持续增强，也许是样品去根导致了逆境胁迫[28]。从第4天开始，A组PAL酶活明显降低、并与CK组之间存在极显著差异(P<0.01)直到贮藏结束，这可能是由于乙醇能够迅速抑制PAL的mRNA合成，从而降低其活性。乙醇处理莴苣[29]也得出相似结论。
与CK组相比，B组从第8天开始，C组从第12天开始能极显著抑制PAL的活性(P<0.01)，但二者效果不如A组(P<0.05)。C组从第10天开始与B组没有显著差异(P>0.05)。总之，A组能很好的抑制PAL活性(P<0.01)，B组、C组也能很好的抑制后期PAL活性，但不能达到A组的效果。
图2 不同时期乙醇处理对双孢菇PAL活性的影响
Fig.2 Effect of ethanol treatment used at different times
during storage on PAL activity of Agaricus bisporus
酚类物质是酶促褐变的底物之一[30]，过高的总酚含量会使双孢菇易褐变。如图3所示，处理组和对照组总酚含量均先增加后降低，也许是外源乙醇减弱PAL酶活，即减少酚类产生。这与王慧倩等对鲜切西兰花进行乙醇熏蒸处理得到的趋势类似[31]。各组前2 d酚类含量的上升可能是因为去根胁迫诱导了PAL活性提高[32]。第2天以后，各组总酚含量持续下降，可能是由于PPO活性一直存在导致总酚不断消耗，也可能是因为是总酚作为氢供体参与了自由基清除[33]。在整个贮藏期间A组能够显著降低总酚含量(P<0.01)。B组总酚从第4天开始迅速降低，第6天开始与CK组存在显著差异(P<0.05)，这时B组PPO、POD活性并未上升，总酚含量迅速下降的原因可能是本实验中PAL活性的下降。B组第10天、C组第12天开始与CK组存在极显著差异(P<0.01)，但与A组差异不大(P>0.05)。总之，A、B、C组都能降低总酚含量，但3个处理组之间没有显著差异。
图3 不同时期乙醇处理对双孢菇总酚含量的影响
Fig.3 Effect of ethanol treatment used at different
times during storage on total polyphenols content of
Agaricus bisporus
PPO是一种导致蘑菇采后褐变的重要蛋白酶[34]。PPO酶能催化酚类形成醌类[35]，从而使得双孢菇产生褐变降低商品价值。根据图4，各组PPO活性在贮藏前2 d上升很快，可能是因为去根处理导致膜结构遭到破坏，PPO活性增强以催化木质素及其他酚类物质氧化产物的生成，对伤口形成屏障[36]。A组第6天，B组第8天，C组第10天开始与CK组有明显区别(P<0.05)，这可能是因为乙醇熏蒸处理抑制了PAL酶活，也就抑制了酚类物质的合成，减少了PPO作用底物故而抑制其活性，也有可能是因为乙醇分子和PPO作用底物有类似化学解离特性的羟基，通过与底物共同争夺酶活性中心基团以降低PPO活性[37]，但是A、B组之间一直并不存在显著性差异(P>0.05)，可能是因为贮藏前4 d 各组PPO活性均上升，掩盖了部分乙醇熏蒸的效果。贮藏结束时，所有处理组与对照组都存在极显著差异(P<0.01)，B组抑制PPO效果较A组稍差但差异不大，C组效果最差(P<0.05)。总之，3个处理组均可减弱PPO活性并且A，B组效果相当。
图4 不同时期乙醇处理对双孢菇PPO活性的影响
Fig.4 Effect of ethanol treatment used at different
times during storage on PPO activity of Agaricus bisporus
POD酶在有过氧化氢存在时可以氧化酚类成醌类，导致双孢菇褐变[38]。各组POD活性总体呈上升趋势，但存在波动。A组在贮藏前4 d未能显著抑制抑制双孢菇POD酶活性(P>0.05)，可能是因为处理时操作破坏了细胞组织膜结构，细胞中游离态POD增加。与CK相比，A组第6天开始能显著抑制POD活性(P<0.05)，第8天开始A组达到了极显著水平(P<0.01)。
和CK相比，B组从第8天开始能显著抑制POD活性(P<0.05)，在整个贮藏期间效果与A组相当。C组第8天后POD活性急速减弱。贮藏结束，C组POD活性明显低于CK组(P<0.05)，但仍高于A组和B组，3个处理组都能抑制双孢菇POD的活性，可能是因为乙醇熏蒸抑制
形成速度[39]，减少了样品中过氧化氢占比，也有可能是乙醇熏蒸减弱了PAL酶活使POD反应底物总酚含量降低，从而抑制其活性。B组效果最佳，可能是因为B组乙醇处理时间居中，因此在贮藏结束时较之A组有更多的乙醇残留，较之C组则更早地对PAL酶活以及过氧化氢含量起到控制作用。
图5 不同时期乙醇处理对双孢菇POD活性的影响
Fig.5 Effect of ethanol treatment used at different
times during storage on POD activity of Agaricus bisporus
相对电导率可以表征细胞膜完整度，相对电导率越大，细胞完整度越低[40]。根据图6，各组相对电导率随时间总体上升，这可能是因为双胞菇贮藏期间组成细胞壁的果胶大量降解，导致细胞结构被破坏。A组从第6天开始显著抑制了双孢菇的相对电导率(P<0.05)到贮藏结束，而B组需要从第8天开始才能显著抑制相对电导率(P<0.05)，但与A组差异不大(P>0.05)。第12天，A、B组均可以极显著减弱相对电导率上升趋势(P<0.01)，A、B组之间无明显区别，也许是因为活性氧的产生受到了抑制，保护了细胞。C组也能显著抑制双孢菇相对电导率的上升(P>0.05)，但由于乙醇在第8天才处理，活性氧已经在相当长的时间内对细胞造成了伤害，故而效果不如A、B组。由此可见，A、B、C组都能很好地抑制双孢菇相对电导率的上升，并且B组和A组效果相当。
图6 不同时期乙醇处理对双孢菇相对电导率的影响
Fig.6 Effect of ethanol treatment used at different times
during storage on relative conductivity of Agaricus bisporus
双孢菇作为食用菌，其子实体营养丰富且无角质层，易滋生细菌。乙醇对微生物有致死作用，这是因为乙醇可以破坏菌体蛋白的肽键，使其变性，同时乙醇还具有溶菌作用[41-43]。根据图7，各组菌落总数在贮藏期间呈增加趋势。与CK组相比，A组第0 d菌落总数下降了1.19 lg CFU/g，并且在贮藏期间二者差异极显著(P<0.01)，这可能是因为乙醇熏蒸对双孢菇有直接的杀菌作用。B组经乙醇熏蒸处理后菌落总数立刻下降了1 lg CFU/g，从第4天开始到第12天与CK组存在非常明显差别(P<0.01),但与A组差异不大。C组第8天的菌落总数下降了1.14 lg CFU/g，与CK组存在极显著差异(P<0.01)直到贮藏结束。贮藏结束时，A组、B组、C组分别达到7.11、7.29、7.26 lg CFU/g，3个处理组之间没有显著差异(P>0.05)。由此可见，乙醇不同处理时间均可以有效抑制菌落生长(P<0.01)，且3个处理组之间差异不大(P>0.05)。
图7 不同时期乙醇处理对双孢菇菌落总数的影响
Fig.7 Effect of ethanol treatment used at different
times during storage on total bacterial counts of
Agaricus bisporus
硬度是果蔬贮藏质量的标志，对消费者购买欲有重要影响，乙醇通过抑制双孢菇的呼吸强度能够保持较好的硬度。根据图8可知，双孢菇硬度值随着时间延长不断下降，这可能是因为双孢菇呼吸消耗大量有机物。与CK组相比，A组从第2天开始显著抑制双孢菇硬度下降直到贮藏结束(P<0.05)，也许是因为A组从第2天开始呼吸作用受到抑制。B、C组经乙醇熏蒸后与CK组差异不大(P>0.05)甚至略有下降，可能是因为双孢菇乙醇熏蒸时从4 ℃环境转移到常温，温度上升引起硬度下降，这与郭禹等[39]对马铃薯的研究结果类似，也有可能是因为B组、C组经乙醇熏蒸后呼吸作用略有加剧导致硬度下降。第12天，A组与CK组存在显著差异(P<0.05)，但B、C两组与CK组差异不大(P>0.05)。A组能很好地抑制双孢菇硬度值的下降(P<0.05)，B组、C组则不能起到明显作用。
图8 不同时期乙醇处理对双孢菇硬度的影响
Fig.8 Effect of ethanol treatment used at different
times during storage on firmness of Agaricus bisporus
白度是消费者购买双孢菇时重要的指标，当L*值小于80时，从外观上来说双孢菇丧失了商品价值[40]。根据图9，双孢菇的白度值在贮藏过程中不断下降。与CK组相比，A组从第4天开始显著抑制白度的下降(P<0.05)，并从第6天开始达到极显著效果(P<0.01)。B组从第6 d开始显著抑制白度的下降(P<0.05)，第10天开始达到极显著效果(P<0.01)，且B组与A组第6天后没有显著差异(P>0.05)，说明乙醇熏蒸能够即时起到保护双孢菇白度值的作用，也许是因为乙醇熏蒸能明显减弱PPO、POD酶活以及相对电导率、总酚上升速率。C组双孢菇白度值从第10天开始下降，但与CK组相差不大(P>0.05)。第8天乙醇熏蒸对白度作用较小，可能是C组样品呼吸强度已经无明显减弱。由此可见，A组在贮藏期间显著抑制双孢菇白度值的下降(P<0.05)，B组在贮藏中后期显著维持了白度值(P<0.05)并且在第12天略高于A组(P>0.05)，这与本实验中B组能在贮藏末期更好抑制PPO和POD酶活的结果保持一致。C组能在后期抑制双孢菇白度值的下降，但是与CK组没有显著差异(P>0.05)，这可能是因为C组后期未能有效抑制POD酶活以及相对电导率的上升。
图9 不同时期乙醇处理对双孢菇白度的影响
Fig.9 Effect of ethanol treatment used at different
times during storage on whiteness of Agaricus bisporus
根据图10，在贮藏期间双孢菇的感官评价分值不断下降。与CK组相比，A组从第4天开始显著抑制了感官品质的劣变(P<0.05)并在第6天达到极显著水平(P<0.01)。B组第6天开始显著抑制了感官品质的劣变(P<0.05)直到贮藏结束。第8天开始CK组和C组出现肉眼可见的褐变，气味改变，手感发黏而A、B气味和手感正常，可能是乙醇抑制了A、B组微生物的生长并维持PPO、POD较低活性。第10天，CK组得分仅5.5。C组略高于CK组。第12天，A、B两组得分分别为6.5、6.25分。综上，与CK组相比，A、B两组保持双孢菇感官评价效果较好(P<0.01)，且A、B作用相当(P>0.05)，而C组与CK组不存在显著性差异(P>0.05)。
图10 不同时期乙醇处理对双孢菇感官评价的影响
Fig.10 Effect of ethanol treatment used at different times
during storage on sensory properties of Agaricus bisporus
本研究表明，与入库前乙醇熏蒸处理相比，贮藏前期(第4天)对双孢菇进行乙醇熏蒸处理虽然在抑制PAL活性和维持硬度方面效果略差，但是仍然可以保持其较低的相对电导率、总酚含量和菌落总数，抑制PAL、PPO、POD的活性，维持较高的白度值和感官评价。贮藏前期处理(第4天)抑制双孢菇后期呼吸强度效果最好。而贮藏后期(第8天)处理虽能更好抑制贮藏后期PPO的活性，但在呼吸强度、白度、硬度、感官评价方面效果不好。综上所述，对于双胞菇来说乙醇入库前处理效果最好，贮藏前期处理(第4天)虽无法完全达到入库前处理的效果，但依然能保持很好的商品性。对于商家来说，即使不同采收时间，不同地域送来的双孢菇需要分批进入冷库，在其贮藏第4天才处理，效果依然会不错，但不建议在贮藏后期也就是第8天才进行处理。
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