我国是以面制食品为主食的国家，小麦粉是最重要的食品原料之一。由于受气候、土壤、种植及储存环境影响，小麦易受到微生物的污染，受污染严重时小麦粉会影响食品的安全品质。我国规定小麦粉中致病菌以蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus，B.cereus)、大肠杆菌等作为参考菌群，食品中的B.cereus超过103 CFU/g就会产生致呕吐型毒素和致腹泻型毒素[1]，因此B.cereus的超标常导致食源性疾病爆发。根据对中国食源性疾病爆发的监测资料分析，由B.cereus引起的疾病占所有微生物食源性病例的8.6%，排在第4位。B.cereus是一种革兰氏阳性细菌，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道。它产生的芽孢生命力强，可耐低温，耐高温，耐强酸强碱[2-4]。2018年，我国山东省某面粉生产厂家因小麦粉中B.cereus含量高达105CFU/g，严重超标，对企业造成巨大损失。目前，我国国家标准还未对小麦粉中的B.cereus进行限定，但许多企业标准和地方标准已有相关规定，如香港微生物含量指引中指出：B.cereus数小于103CFU/g为满意等级；有报告显示[5]：在欧洲小麦粉中B.cereus数大于102CFU/g为不合格。
国内外关于食品中B.cereus的杀灭技术有电子束辐照，脉冲电场，超高压[6]，紫外，微波辐照等。微波灭菌技术具有杀菌速度快，杀菌效果好，不污染食品和环境等优点[7]。郭全友等、KIM 等[8-9]的研究发现微波处理可以有效杀灭B.cereus，另外有许多研究将微波技术应用于干燥[10]、杀虫[11]、保鲜[12]、毒素脱除[13]等方面，但将微波技术应用于小麦或小麦粉灭菌的研究较少。采用微波灭菌技术对小麦进行灭菌需要较大功率和较长时间，小麦表皮极易焦糊，而且会在小麦制粉时造成二次污染。本文将以小麦粉作为灭菌对象，利用微波技术对小麦粉进行处理以降低小麦粉中B.cereus含量。通过正交试验对微波杀菌条件进行优化。探究微波处理对小麦粉中B.cereus的杀菌效果，为提高食品安全，解决由于小麦微生物感染而导致的面制食品安全问题提供理论基础。
4种不同产地的小麦(临沭县、郯城县、相邸镇、壮岗镇)，山东玉皇粮油食品有限公司；甘露醇卵黄多粘菌素琼脂基础(MYP)、多粘菌素B、50%卵黄液、营养琼脂基础、胰酪胨大豆羊血琼脂、溶菌酶营养肉汤、硫酸锰营养琼脂基础，北京奥博星生物技术有限公司；NaCl、H2O2，天津市凯通化学试剂有限公司。
P70F23P-G5(S0)微波炉，格兰仕微波炉电器制造有限公司；SW-CJ-2D，净化工作台，上海苏净实业有限公司；DY04-13-44-00立式压力蒸汽灭菌器，上海东亚压力容器制造有限公司；SPX-100 B-Z生化培养箱，上海迅博实业有限公司医疗设备厂；SHZ-B水浴恒温振荡器，上海迅博实医疗生物仪器股份有限公司；BXS-1显微镜，上海炳宇光学仪器有限公司。
1.3.1 选择研究对象
采用粉碎机对4种小麦进行粉碎后，测定样品菌落总数及B.cereus含量。其中产自临沭县的小麦样品微生物水平最高，故以此作为研究对象。
1.3.2 样品制备
将选定的小麦样品按照AACC26-21方法进行制粉，出粉率为69.8%，B.cereus初始含量为1.6×104CFU/g，将小麦粉放入冷柜短暂储藏，及时进行处理、检测。
1.3.3 小麦粉水分调节
将小麦粉样品放置于恒温恒湿箱，温度(30±1)℃，湿度60 %，平衡水分24 h。将原始小麦粉与调节水分后的小麦粉混配得到水分为13%、14%、15%、16%、17%的小麦粉样品。
1.3.4 B.cereus计数
按照GB 4789.14—2014《食品微生物学检验蜡样芽孢杆菌的检验》平板计数法计数。
1.3.5 微波处理小麦粉方法
将40 g不同水分含量的小麦粉平铺于20 cm×20 cm的专用托盘，设置微波功率和微波时间进行处理。
1.3.6 杀灭率的计算
分别对处理后小麦粉中B.cereus进行计数，计算杀灭率，计算如公式(1)，并以杀灭率作为灭菌效果的评价标准。
(1)
式中：I，小麦粉初始B.cereus含量，CFU/g；T，小麦粉经微波处理后B.cereus含量，CFU/g；K，杀灭率，%。
1.3.7 微波处理后小麦粉中B.cereus生长趋势的评价
将处理后各样品置于(25±1) ℃下储存，分别在第0、2、4、8、12天对各样品中B.cereus进行计数，观察不同条件下微波处理对小麦粉中B.cereus生长趋势的影响。
1.3.8 数据处理
采用Origin 8.6进行图表绘制，采用SPSS软件对数据进行正交优化、方差分析和多重比较。实验数据均重复3次，采用平均值±标准差表示。
根据微波处理设备设置微波处理功率。经过分析样品厚度对灭菌率的影响，发现厚度越小杀灭率越高，故在此研究中将样品厚度固定为0.1 g/cm2。在此基础上，分别探讨处理时间、微波功率、样品水分含量对小麦粉中B.cereus杀灭率及生长趋势的影响，优化灭菌条件。
2.1.1 样品水分含量对B.cereus杀灭率的影响
分别将含水质量分数为13 %～17 % 的小麦粉均匀平铺于托盘，料层厚度0.1 g/cm2，设置处理时间6.5 min，微波功率700 W进行微波处理。小麦粉的水分含量显著影响其介电常数[14-15]，且介电常数越大，微波对食品产生的热效应及非热效应越强。由图1可知，随样品水分含量增加，处理后的小麦粉中B.cereus含量先降低后增加，杀灭率先升高后降低。样品水分含量15%时，B.cereus含量低于1×102CFU/g，杀菌率最高，达到96.81%。
防样品水分含量升高，小麦粉中B.cereus含量先降低后升高的原因是样品水分含量增加改善了小麦粉的介电性质，提高了微波灭菌效率，造成B.cereus含量降低。另一方面，B.cereus常以营养细胞和芽孢的形式存在，芽孢能在80 ℃左右的高温和适宜湿度下活化萌发[16-18]。因此，高水分含量的样品与含水质量分数为14%、15%的小麦粉相比B.cereus含量略有升高，微波灭菌效率降低。
图1 水分含量对B.cereus杀灭率的影响
Fig.1 The effect of moisture content on the
sterilization rate of B.cereus
注：图中不同小写字母代表差异显著(P<0.05)(下同)
2.1.2 微波功率对B.cereus杀灭率的影响
将含水质量分数为12 %的小麦粉均匀平铺于托盘，料层厚度固定为0.1 g/cm2，固定处理时间7.5 min分别设置微波功率120、280、462、581、700 W进行微波处理。当功率低于462 W时，微波处理会造成小麦粉中B.cereus含量显著(P<0.05)高于原始含量，B.cereus杀灭率为负值，如图2所示。当功率高于462 W时，B.cereus含量显著降低，杀灭率随微波功率增加大幅度提高。微波功率700 W时，微波对B.cereus的杀灭率能够达到99%以上。
低功率处理后B.cereus含量高于原始含量是由于温和的微波处理能够促进B.cereus芽孢的萌发，导致小麦粉中B.cereus含量增加。VALERO、SONI、陈未等[19-22]的研究发现,B.cereus的芽孢在高温、紫外等条件下能够被迫萌发；并且萌发后的芽孢会失去休眠芽孢的极端抗性，相对容易被杀死，对常规灭菌方法的抵抗力明显降低。而高功率的微波处理能使芽孢提前完成萌发并失去抗性，在相同的处理时间内大幅降低小麦粉中B.cereus含量。这对工业微波灭菌参数的选择有重要价值。
图2 微波功率对B.cereus杀灭率的影响
Fig.2 The effect of microwave power on the sterilization
rate of B.cereus
2.1.3 处理时间对B.cereus杀灭率的影响
将含水质量分数为12%的小麦粉均匀平铺于托盘，料层厚度0.1 g/cm2，设置微波功率700 W，分别处理3.5、4.5、5.5、6.5、7.5 min。随处理时间增加，B.cereus含量逐渐降低，杀菌率逐渐提高，如图3所示,经短时间微波处理的小麦粉中B.cereus含量缓慢下降，差异不显著，处理时间5.5 min时小麦粉中B.cereus含量急剧下降，杀菌率大幅提升。7.5 min时灭菌率最高，达到99 %以上。
因为短时间内微波灭菌还处于灭菌初期，尽管部分B.cereus被杀灭，但多数B.cereus芽孢正在萌发，故B.cereus含量没有显著降低，灭菌率没有显著提高。处理时间5.5 min时，B.cereus含量锐减是由于初期芽孢萌发完成，B.cereus较容易被杀灭。
图3 微波时间对B.cereus杀灭率的影响
Fig.3 Effect of microwave time on the sterilization
rate of B.cereus
2.2.1 样品水分含量对小麦粉中B.cereus生长趋势的影响
由图4可知，对不同水分含量的小麦粉进行微波处理后，小麦粉中B.cereus含量均随储存时间波动较大。含水质量分数15%的样品经微波处理后12 d内，B.cereus含量维持在较低水平下；随储存时间延长，含水质量分数14%的样品中B.cereus含量先有小幅度增加后降低，并且在第12天时B.cereus含量也能够达到较低水平；小麦粉含水质量分数为13%、16%、17%时，B.cereus含量较高，但均低于原始样品中B.cereus含量。
含水质量分数17%的小麦粉样品中B.cereus生长活力大，不属于衰亡期菌种，在储存期间B.cereus含量快速上升，这种情况会对食品安全造成极大隐患。而随着样品水分含量降低，微波处理后小麦粉中B.cereus的繁殖速度变缓，这一方面是由于样品中B.cereus初始含量降低，另一方面是由于B.cereus受到不同程度的损伤。
图4 水分含量对B.cereus生长趋势的影响
Fig.4 Effect of moisture content on the growth
trend of B.cereus
2.2.2 微波功率对小麦粉中B.cereus生长趋势的影响
在不同功率下对小麦粉进行微波处理后，小麦粉中B.cereus含量均随储存时间先升高后降低，并且在第8天时达到峰值，如图5所示。在储存12 d内，低功率120、280 W微波处理后小麦粉B.cereus含量均显著高于原粉，462 W微波处理后小麦粉B.cereus含量与原粉无显著差异；微波处理功率581 W、700 W的样品中B.cereus含量显著(P<0.05)低于原粉，并维持在较低水平下。
经低功率微波处理后，小麦粉中B.cereus显示出较高的繁殖能力，这说明低功率微波处理并不能对B.cereus造成严重损伤。700 W微波处理后，小麦粉中B.cereus含量在储存前期有明显升高，这由于700 W微波处理后，小麦粉中极少部分抗性较强的B.cereus存活，并具有较强繁殖能力，8 d后开始衰败。
图5 微波功率对B.cereus生长趋势的影响
Fig.5 Effect of microwave power on the growth
trend of B.cereus
2.2.3 处理时间对小麦粉中B.cereus生长趋势的影响
对小麦粉微波处理不同时间后，样品中B.cereus含量随储存时间变化较小，如图6所示。在储存时间12 d内，短时间微波处理后小麦粉中B.cereus含量与原粉中B.cereus含量无显著差异，均维持在较高水平下；微波处理时间5.5、6.5、7.5 min的样品中B.cereus含量显著低于原粉，均维持在较低水平下，并且小麦粉经微波处理时间越长，B.cereus含量越低。
图6 微波时间对B.cereus生长趋势的影响
Fig.6 The effect of microwave time on the growth
trend of B.cereus
在单因素试验的基础上，运用正交试验，考察样品水分含量、微波功率、微波时间对小麦粉中B.cereus杀灭率的影响，进行3因素3水平试验。3个因素分别以A、B、C表征，采用L9(33)正交试验，评选出最佳综合条件。表1为因素水平表。
表2极差分析结果和表3方差分析结果综合表明，3个因素对杀菌率的影响程度为微波功率>微波时间>水分含量(质量分数)，微波功率和微波时间对杀灭率影响极显著，而水分含量对杀灭率影响相对不显著。各因素最优水平组合为A3B3C2，即处理时
表1 正交试验因素水平表
Table 1 Table of factors of orthogonal test
水平因素A(微波时间)/minB(微波功率)/WC(水分含量)/%15.54621426.55811537.570016
间7.5 min，微波功率700 W，样品含水质量分数15%。在正交试验的9个处理中，灭菌率最高的处理组合为A3B3C1，即处理时间7.5 min，微波功率700 W，样品含水质量分数14%。对这两个组合进行验证试验，结果表明两组合之间没有显著性差异。
表2 正交试验结果分析表
Table 2 Analysis table of orthogonal test results
试验号ABCB.cereus杀灭率/%111121.31212342.42313284.85421223.23522169.70623387.88731336.36832288.89933198.99K1148.5980.91190.00K2180.81201.01196.97K3224.24271.72166.67k149.5326.9763.33k260.2767.0065.66k374.7590.5755.56R25.2263.6010.10因素主次B>A>C最优工艺A3B3C2
表3 正交试验结果方差分析
Table 3 Anova table of orthogonal test results
因素偏差平方和自由度均方F值PA0.192.000.1016.240.001B1.262.000.63105.390.000C0.042.000.022.960.094误差0.0711.000.01
改变微波条件进行单因素试验可以发现，面粉初始水分含量过低或过高都会降低微波处理对B.cereus的杀灭效率；低功率的微波处理能够使小麦粉中B.cereus孢子活化萌发，微波功率达581 W以上，能够显著降低小麦粉中B.cereus含量，提高杀灭率；随处理时间延长，B.cereus含量降低，杀灭率升高。不同的微波处理条件导致B.cereus生长趋势不同，较优的微波灭菌条件能使B.cereus含量维持在较低水平。微波处理对B.cereus的最优杀灭工艺为：微波时间7.5 min、微波处理功率700 W、样品水分含量15%。
微波技术已经广泛应用于食品灭菌，只有把握微波处理后微生物的生长趋势，才能正确选择灭菌条件。然而，许多研究也表明，对小麦粉进行过度的微波处理会导致其面筋、粉质、糊化等特性改变[23-24]，面制品品质降低，因此需要在保证食品原料品质的基础上尽可能地达到微波处理的目的
[1] AGATA N, OHTA M, YOKOYAMA K. Production of Bacillus cereus emetic toxin (cereulide) in various foods[J]. International Journal of Food Microbiology, 2002, 73: 23-27.
[2] PEI XIaoyan, YANG Shuruan, ZHAN Li, et al. Prevalence of Bacillus cereus in powdered infant and powdered follow-up formula in China[J]. Food Control, 2018, 93: 101-105.
[3] 柳增善.食品病原微生物学[M].北京:中国轻工业出版社,2007:72-73.
[4] 刘慧.现代食品微生物学[M].北京:中国轻工业出版社, 2011:130-137.
[5] OSIMANI A, AQUILANTI L. Clementi Bacillus cereus foodborne outbreaks in mass catering[J]. International Journal of Hospitality Management, 2018, 72: 145-153.
[6] 张林玉,郭艳明,伍晓聪,等.超高压处理对腌渍红椒灭菌效果及品质的影响[J].食品与发酵工业,2017,43(8):190-196.
[7] ZENG Shaoxiao, CHEN Bingyan, ZENG Hongliang, et al. Effect of microwave irradiation on the physicochemical and digestive properties of Lotus seed starch[J]. Agricultural And Food Chemistry, 2016, 64: 2 442-2 449.
[8] 郭全友,王晓晋,姜朝军.微波杀灭虾源地衣芽孢杆菌孢子特性及效果[J].农业工程学报,2018,34(21):281-287.
[9] KIM J E, CHOI H S, LEE D U. Effects of processing parameters on the inactivation of Bacillus cereus spores on red pepper (Capsicum annum L.) flakes by microwave-combined cold plasma treatment[J]. International Journal of Food Microbiology, 2017, 263: 61-66.
[10] 张黎骅,张文.响应面法优化酒糟微波间歇干燥工艺[J].农业工程学报,2011,27(3):369-374.
[11] 周小伟,刘晓丽,吴克刚,等.面粉微波处理结合植物精油对鲜湿面保鲜品质的影响研究[J].粮食与油脂,2016,29(11):62-65.
[12] 邹忠义,孙建利,冯志,等.微波处理对脱氧雪腐镰刀菌烯醇T-2毒素的去除作用[J].食品工业,2017,38(5):32-35.
[13] 王胜录,万忠民,陈培栋.高功率微波对稻谷中储粮害虫致死效果研究[J].粮食科技与经济,2017,42(5):49-54.
[14] AUKSORNSRIA T, TANG Juming, TANG Zhongwei, et al. Dielectric properties of rice model food systems relevant to microwave sterilization process[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2018, 45: 98-105.
[15] 唐彬,靳苗苗,张洪翠,等.微波处理及其非热效应对麻辣鸡块品质的影响[J].食品与发酵工业,2018,44(12):200-207.
[16] MELIS V, BESTEN D, GROOT N, et al. Quantification of the impact of single and multiple mild stresses on outgrowth heterogeneity of Bacillus cereus spores[J]. International Journal of Food Microbiology, 2014, 177: 57-62.
[17] SONI A, OEY I, SILCOCK P, et al. Differential gene expression for investigation of the effect of germinants and heat activation to induce germination in Bacillus cereus spores[J]. Food Research International, 2019, 119: 462-468.
[18] RAJKOVIC A, KLJAJIC M, SMIGIC N, et al. Toxin producing Bacillus cereus persist in ready-to-reheat spaghetti Bolognese mainly in vegetative state[J]. International Journal of Food Microbiology, 2013, 167: 236-243.
[19] ABEE T, GROOT M N, TEMPELAARS M, et al. Germination and outgrowth of spores of Bacillus cereus group members: Diversity and role of germinant receptors[J]. Food Microbiology, 2011, 28: 199-208.
[20] VALERO M, LEONTIDIS S,FERNANDEZ P S, et al. Growth of Bacillus cereus in natural and acidified carrot substrates over the temperature range 5-30℃[J]. Food Microbiology, 2000, 17: 605-612.
[21] SONI A, OEY I, SILCOCK P, et al. Impact of temperature, nutrients, pH and cold storage on the germination, growth and resistance of Bacillus cereus spores in egg white[J]. Food Research International, 2018, 106: 394-403.
[22] 陈未,周伟伟,陈飞,等.蜡样芽孢杆菌芽孢萌发及其对常规灭菌方法抵抗力的研究[J].中国畜牧兽医, 2014,41(1):192-195.
[23] WANG Kaiqiang, LUO Shuizhong, ZHONG Xiyang, et al. Changes in chemical interactions and protein conformation during heat-induced wheat gluten gel formation[J]. Food Chemistry, 2017, 214: 393-399.
[24] LAMACCHIA C, LANDRISCINA L, D′AGNELLO P. Changes in wheat kernel proteins induced by microwave treatment [J]. Food Chemistry, 2016, 197: 634-640.