核黄素是一种与生物生长紧密相关的物质，参与细胞的氧化还原和新陈代谢，与核酸、蛋白质以及脂肪的代谢有关，维护细胞功能的正常运行[1-2]。在医药与饲料领域有着广泛的应用[3-7]。
常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma，ARTP) 诱变技术作为一种近年来新兴的高效诱变手段，具有突变谱广、安全性高、操作快速简单、成本低、环境友好等优点[8]。该方法在工业诱变育种中具有极大的应用潜力，ARTP诱变已经成功地应用于多种细菌和真菌，还应用在植物、藻类上，在促进细胞生长和细胞生物量的生产，提高酶活性，提高各种化学品产量等方面均有成功展示[9]。
诱变选育是提高核黄素产量的有效策略，但经过多轮突变和筛选后产量会达到瓶颈[10]。为了获得更具有工业竞争力的核黄素高产菌，除了人工诱变外，代谢工程选育高产菌株也是重要的发展方向。最近，SHI等[11]通过过表达核黄素操纵子，解调嘌呤合成途径转录水平和解除关键酶反馈抑制作用，改善嘌呤核苷酸的供应，得到了1株核黄素高产菌，产量较出发菌提升了3倍。BUEY等[12]通过过表达核苷酸生物合成的关键酶IMP脱氢酶，促进GTP的积累，使1株棉囊阿舒氏酵母菌的核黄素产量提升了40%。
本科研组前期通过随机诱变、基因组重排和代谢工程等手段构建了一系列核黄素突变菌株，但是突变株存在生长缓慢、菌体浓度低、遗传背景不清晰以及遗传操作困难等问题。WANG等对B. subtilis 24进行了全基因组测序和逆向代谢工程重构了1株遗传背景清晰的重构菌枯草芽孢杆菌BS120，核黄素产量达到(1.85±0.03) g/L[13]。本研究进一步对BS120进行ARTP等离子诱变，筛选遗传稳定的核黄素高产突变菌株，为探讨核黄素高产的调控机制奠定基础。
1.1.1 实验菌株或质粒
核黄素生产菌BS120、核黄素操纵子质粒pMX45，保藏于天津大学代谢工程与系统生物学实验室。
1.1.2 培养基
Spizizen基本培养基(g/L)：葡萄糖 8，(NH4)2SO4 0.2，KH2PO4 1.31，Na2HPO4 0.6，MgSO4·7H2O 0.2，柠檬酸三钠二水 0.25，谷氨酰胺 2，色氨酸 0.05，VB1溶液 0.01，1 000×微量元素溶液 1 mL。
LB液体培养基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母提取物 5和NaCl 10，pH 7.0。固体培养基加2%(质量分数)琼脂。
96深孔板筛选培养基(g/L)：葡萄糖 40，酵母粉 8，尿素 2，K2HPO4 0.5，KH2PO4 0.5，MgSO4 0.5，pH 7.0。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖 100，酵母粉 20，尿素 2，K2HPO4 0.5，KH2PO4 0.5，MgSO4 0.5，pH=7.0。
基本盐培养基(g/L)：葡萄糖40，(NH4)2SO4 2，KH2PO4 13.1，Na2HPO4 6，柠檬酸三钠二水1.2，MgSO4·7H2O 2.5，色氨酸0.05，1 000×微量元素500 μL。
1.1.3 主要试剂
酵母粉 YP601，安琪酵母股份有限公司；寡霉素、8-氮鸟嘌呤，大连美仑生物技术有限公司；D-(+)-葡萄糖，上海生工生物工程有限公司；胰蛋白胨、酵母抽提物、红霉素，BBI生命科学有限公司。
1.1.4 仪器与设备
ARTP-IIS诱变系统，北京思清源有限公司；TU-1901紫外分光光度计，北京谱析通用仪器公司；MULTIPLEX1R32R大型离心机，赛默飞世尔科技公司；SBA-40C生物传感分析仪，山东省科学院生物研究所；BIOMETRAPCR仪，Tpersonal。
1.2.1 ARTP诱变
挑取单菌落至基本盐液体培养基中，37 ℃、220 r/min条件下培养至OD600为2.0～3.0，离心收集菌体，用PBS缓冲液洗涤2次后，重悬菌体制成菌悬液备用。ARTP诱变条件为100 W、10 SLM、2 mm。吸取10 μL菌悬液均匀涂布至无菌载片上，诱变时间为20～60 s，诱变后的菌液加到4.99 mL PBS缓冲液的EP管中，振荡混匀，取100 μL菌液涂布于Spizizen培养基固体平板，37 ℃恒温培养至单菌落长出。绘制致死曲线，选择出合适的诱变时间。
致死率计算如公式(1)所示[14]为：
致死率
(1)
1.2.2 筛选拮抗物最小抑制浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)的测定
将出发菌株的菌悬液经适度稀释，取100 μL涂布在含有20～50 mg/L 8-氮鸟嘌呤或100～300 mg/L寡霉素的Spizizen基本盐培养基平板上，37 ℃倒置培养48～72 h，以不含筛选拮抗物平板上菌体的生长状况为对照，观察并记录未长出菌落的筛选拮抗物的最低浓度，即为该筛选拮抗物的MIC[15]，然后按MIC作为添加水平制作相应的筛选拮抗物筛选平板。
1.2.3 诱变菌株的初筛和复筛
取100 μL诱变后菌液涂布于含有相应筛选拮抗物MIC浓度的筛选平板，37 ℃恒温培养12～16 h。挑取诱变的单菌落，对点到Spizizen基本盐固体平板上，37 ℃，24～48 h。初筛后，挑取核黄素产量显著提高的突变单菌落接种到5 mL液体LB试管中，37 ℃静置过夜培养。取1 mL菌液接种至50 mL LB液体培养基的250 mL三角瓶中，220 r/min、37 ℃振荡培养12 h，获得一级种子。吸取适量的一级种子接种至100 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，初始OD为0.05，41 ℃、220 r/min振荡培养96～120 h，测定核黄素的产量、残糖，筛选出核黄素高产突变菌株。
1.2.4 发酵产物测定
1.2.4.1 核黄素浓度的测定
本实验中核黄素浓度测定是通过紫外分光光度计测量OD444，有效范围为0.3～0.8。使用0.5 mol/L NaOH溶液进行溶解稀释，再用乙酸-乙酸钠溶液稀释并中和NaOH溶液，13000 r/min离心2 min沉淀固体杂质，测量上清液吸光度。
核黄素质量浓度核算[16]如公式(2)所示：
核黄素质量浓度/(mg·L-1)=稀释倍数
(2)
1.2.4.2 残糖的测定
发酵过程中葡萄糖是利用生物传感分析仪进行测定[16]。
1.2.5 核黄素操纵子质粒转化
本实验使用化学转化法，即枯草芽孢杆菌的Spizizen转化法[16]向枯草芽孢杆菌BSG3中转化核黄素操纵子质粒pMX45。
1.2.6 遗传稳定性分析
挑取单菌落至5 mL LB液体培养基，37 ℃培养12 h后，取100 μL菌液至另一支4.9 mL LB液体培养基试管，相同条件下重复转接20次。根据公式计算代时得到一次转接为6代，对第0、30、60、90、120代进行摇瓶发酵，测定核黄素浓度。
1.2.7 数据处理
实验结果为3次独立实验的平均值，用平均值和标准偏差表示。采用单因素方差分析法进行统计学分析，用Origin 8.1软件进行作图。
在诱变处理时，对出发菌株BS120进行20、30、40、50、60 s诱变处理，并绘制致死率曲线(图1-A)。当照射时间为30 s时，致死率达到45.02%; 照射时间为40 s时，致死率达到了91.30%。进一步测定35～40 s诱变后的致死率，对出发菌株BS120进行35、36、37、38、39 s诱变处理，并绘制致死率曲线(图1-B)。诱变的致死率约为90%时，筛选到目标突变菌株的可能性最大[17]，所以选择37s作为诱变时间。
A-诱变处理时间0、20、30、40、50、60 s；
B-诱变处理时间35、36、37、38、39 s
图1 枯草芽孢杆菌致死曲线
Fig.1 Lethal curve of Bacillus subtilis
2.2.1 8-氮鸟嘌呤为拮抗物的突变株筛选
8-氮鸟嘌呤(8-azaguanine)作为核黄素合成途径中核黄素前体物鸟三磷(guanosinetriposophate,GTP)的结构类似物可以阻断磷酸核糖焦磷酸合成酶(pho-sphoribosyl-pyrophosphate synthetase,PRPS)对GTP的反馈抑制作用[18-19]，从而大量积累GTP进而有效促进核黄素的合成，增加核黄素的产量[20-21]。
为了测定8-氮鸟嘌呤对出发菌株BS120的MIC，将BS120菌悬液稀释至菌体浓度为1×105个/mL涂布在添加了8-氮鸟嘌呤的Spizizen培养基中，37 ℃培养24 h，对平板上生长的菌落进行计数(表1)。
由表1可知， 8-氮鸟嘌呤的MIC为40 mg/L。将对BS120经ARTP诱变37 s后的菌液涂布于添加了40 mg/L 8-氮鸟嘌呤筛选平板，37 ℃，24～48 h，经过96孔板初筛后对产量较高的9株菌株进行摇瓶复筛(图2)。其中编号为1-3-28的菌株摇瓶发酵96 h核黄素产量为(2 996.68±30.66) mg/L，得率为(30.52±1.18) mg/g葡萄糖，较BS120分别提高61.60%和58.12%，命名为BSG1。
表1 出发菌株BS120对8-氮鸟嘌呤敏感性
Table 1 8-azaguanine resistance of BS120
8-氮鸟嘌呤/(mg·L-1)20253035404550菌株生长情况++++++++++++++---
注： “+++++”代表每板菌落数目超过104；“++++”代表菌落数目在103～104；“+++”代表菌落数目在102～103；“++”代表菌落数目在10～100；“+”代表菌落数目稀少，在10以内；“-”代表无菌落生长(下同)
图2 8-氮鸟嘌呤为拮抗物的突变株摇瓶复筛结果
Fig.2 Screening results of 8-azaguanine mutant strains
2.2.2 寡霉素筛选诱变菌株
寡霉素(oligomycin)作为细胞氧化磷酸化酶的抑制剂[22-23]。也可以促进呼吸链中黄素辅酶的需求量，进而促进核黄素的生物合成，提高胞内核黄素的含量[24]。为了测定寡霉素对出发菌株BSG1的MIC，将BSG1菌悬液稀释至菌体浓度为1×105个/mL涂布在含寡霉素的Spizizen培养基中，37 ℃，24 h，对平板上生长的菌落进行计数(表2)。
表2 出发菌株BSG1对寡霉素敏感性
Table 2 Oligomycin resistance of BSG1
寡霉素/(mg·L-1)100120150200250300菌株生长情况+++++++++++++++-
由表2可知，寡霉素的MIC为300 mg/L，将诱变的菌株涂布于含有300 mg/L寡霉素筛选平板，经过96孔板初筛后选取产量较高的11株菌株进行摇瓶复筛(图3)。其中编号为2-3-19的菌株摇瓶发酵96 h 核黄素产量为(3 403.76±55.96) mg/L，得率为(34.50±0.47) mg/g葡萄糖，较亲株BSG1分别提升13.58%和11.54%，命名为BSG3。
图3 寡霉素诱变菌株摇瓶复筛结果
Fig.3 Screening results of oligomycin mutant strains
核黄素操纵子过表达质粒pMX45是约28 kb的低拷贝数质粒，包含核黄素操纵子的EcoRI 酶切染色体片段(10 kb)和18 kb的载体两部分组成[25]。将其转入BSG3中以期为进一步提高核黄素产量，并同时对BSG5及BS120，BSG1，BSG3进行发酵验证(图4)。
图4 BS120，BSG1，BSG3和BSG5发酵验证
Fig.4 Validation fermentationof BS120, BSG1, BSG3
and BSG5
由图4可知，BSG5在摇瓶发酵120 h核黄素产量可达到(4 467.08±99.47) mg/L，得率为(42.56±1.25) mg/g葡萄糖，较BSG3提升分别为31.24%和23.36%。质粒pMX45的导入促进核黄素产量得到了显著提升。
分别检测了亲本菌株和3株突变株的生长情况(图5)。出发菌株BS120和BSG1，BSG3生长规律基本相同，而BSG5生长相对滞后。原因可能是导入的pMX45质粒较长，造成菌株生长代谢负担加重，菌株生长变慢。
图5 BS120，BSG1，BSG3和BSG5生长曲线图
Fig.5 Growth curve of BS120, BSG1, BSG3 and BSG5
随后，对4株菌分别进行发酵表征，每隔12 h测定核黄素及残糖(图6)。
图6 BS120， BSG1， BSG3和BSG5发酵表征对比图
Fig.6 Fermentation characterization of BS120, BSG1,
BSG3 and BSG5
由图6可知，在基本盐培养基中，发酵到60 h时，4株菌株均基本停止耗糖。BSG5核黄素产量和得率达到(258.76±1.25) mg/L和(10.97±1.01) mg/g葡萄糖，较出发菌株BS120提升分别为92.73%和133.26%，优于BS120((134.26±2.69) mg/L和(4.69±0.19) mg/g葡萄糖)、BSG1((178.91±1.25) mg/L和(6.68±0.83) mg/g葡萄糖)及BSG3((194. 07±1.86) mg/L和(7.60±0.59) mg/g葡萄糖)。
诱变菌株在不断传代的过程中可能出现退化现象，导致发酵性能下降，因此需要测试诱变菌株的遗传稳定性。由图7中知，BSG1、BSG3和BSG5产量基本稳定，具有良好的遗传稳定性。
图7 BS120，BSG1，BSG3和BSG5遗传稳定性测试
Fig.7 Genetic stability of BS120, BSG1, BSG3 and BSG5
本研究以BS120为出发菌株，依次使用8-氮鸟嘌呤和寡霉素作为筛选拮抗物，筛选到了核黄素产量显著提高的突变株，说明ARTP诱变与合适的拮抗物筛选技术，是人工合成诱变获得枯草芽孢杆菌高产突变株的有效手段。将来的工作可以围绕两方面进行展开：一方面，可以考虑选用其他与核黄素生产相关的结构类似物如玫瑰黄素、6-氯鸟嘌呤、别嘌呤[19]等作为筛选拮抗物进行诱变筛选，并结合具有更高筛选通量的的筛选技术，如流式细胞分选仪或者微流滴细胞分选仪[26]，以胞内核黄素荧光信号强度为分选标记，通过迭代诱变筛选，获得生产性状更加优越的诱变菌种；另一方面，可以通过对诱变菌株的基因组、转录组以及蛋白质组的分析，深入理解突变菌株高产核黄素的遗传调控机理，通过逆向代谢工程构建高产核黄素菌株，获得到产量较高且遗传背景清晰的核黄素高产菌，为进一步阐释枯草芽孢杆菌产核黄素遗传基础，探讨核黄素高产的调控机制奠定基础。
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