等[3]通过向海藻酸钠-钙离子体系中分别添加4种植物胶制备咖啡因凝胶球珠，结果发现使用车前子胶所得到的咖啡因包埋效率最高，但其粒径达到2 mm且硬度也较大。纳米乳液包埋法所得到的包埋物虽然粒径较小，但是制备条件苛刻，成本高，难以产业化，并且所得到的乳液存在不稳定等问题。BAGHERI等[4]通过先水解蛋白再通过酶交联制备咖啡因包埋物，其粒径均在100 nm左右，但其制备过程对条件要求较为苛刻，反应时间长达72 h。咖啡因(caffeine)是一种黄嘌呤生物碱，无嗅，味苦，具有驱除疲劳、兴奋神经等生理作用。近年来，咖啡因在食品工业中的应用虽日益广泛，但由于其强烈的苦味使其在食品中的应用受到一定的限制[1]，研究表明当咖啡因单次摄入量超过250 mg时可致失眠、心悸、头痛[2]。通过将咖啡因微胶囊化使其不良风味得到改善，且具有一定的缓释效果，对拓宽咖啡因的应用范围具有重要意义。
为改善咖啡因在食品应用中的不良风味和对人体副作用的影响，目前国内外学者主要采用水凝胶包埋法和纳米乳液包埋法。等[3]通过向海藻酸钠-钙离子体系中分别添加4种植物胶制备咖啡因凝胶球珠，结果发现使用车前子胶所得到的咖啡因包埋效率最高，但其粒径达到2 mm且硬度也较大。纳米乳液包埋法所得到的包埋物虽然粒径较小，但是制备条件苛刻，成本高，难以产业化，并且所得到的乳液存在不稳定等问题。BAGHERI等[4]通过先水解蛋白再通过酶交联制备咖啡因包埋物，其粒径均在100 nm左右，但其制备过程对条件要求较为苛刻，反应时间长达72 h。
膨胀淀粉是将淀粉颗粒在低于糊化温度的条件下进行水热处理，颗粒发生吸水膨胀，在其膨胀过程中可以与客体分子通过分子间相互作用或物理作用形成微胶囊。LI等[5]使用膨胀玉米淀粉包埋叶黄素，随着温度的升高，复合物中叶黄素含量逐渐升高，在反应温度为70 ℃时，叶黄素含量达到4.86 mg/g。多孔淀粉表面分布大量1 μm左右的孔洞，具有一定吸附客体分子的能力。LI等[6]使用多孔玉米淀粉吸附褪黑素，其载药量和包埋效率分别达到12.3%和70.2%。V型结晶淀粉可通过醇碱法制备，原淀粉在碱和乙醇处理下，直链淀粉与乙醇形成V型络合物，当乙醇被除去后，V型淀粉的疏水空腔可用于包埋小分子。使用淀粉作为包埋壁材，其来源广泛，形成的微胶囊具有壁材性质稳定、无毒副作用、不影响芯材的药理作用等特点，同时为淀粉的高值化应用提供了一条可行的途径。
玉米淀粉(食品级，直链淀粉含量24.1%)，长春大成公司;多孔玉米淀粉,宜瑞安食品配料有限公司；瓜拉纳提取物(咖啡因含量24.6%)，上海德乐食品饮品配料有限公司；咖啡因标品，美国Sigma-Aldrich公司；DMSO(分析纯)，国药集团上海化学试剂公司；NaOH(分析纯)，天津福晨化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。
HWS-24型恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；UV-1900型紫外分光光度计，日本岛津公司；JC303-AO型电热恒温鼓风干燥箱，上海申贤恒温设备厂；FW-100型高速万能粉碎机，天津市华鑫仪器厂；FA2204B型电子分析天平，苏州江东精密仪器有限公司；PHS-3C型酸度计，上海雷磁仪电科学仪器有限公司；DL-5-B型离心机，上海安亭科学仪器公司；RigakuD/Max-1200型X-射线衍射仪，美国Waters公司；EVO18型扫描电子显微镜，德国Zeiss公司。
1.3.1 颗粒态 V型结晶玉米淀粉的制备
参考SHI等[7]制备颗粒态V型结晶淀粉的方法。称取普通玉米淀粉20 g(干基)置于烧杯中，加入一定量的40%的乙醇水溶液调成淀粉乳，于35 ℃水浴保温并不断搅拌，将一定量的3 mol/L的NaOH水溶液以4 g/min的速度匀速滴加到淀粉乳中，继续搅拌20 min，接着向淀粉乳中倒入适量40%乙醇使淀粉沉淀完全，然后将淀粉乳离心并用40%的乙醇水溶液洗涤2次，再用2 mol/L的乙醇盐酸中和至pH为7.0左右。将所得淀粉乳进行离心，先用95%乙醇洗涤1次，再用无水乙醇洗1次。最后在80 ℃的温度下干燥、研磨、过筛即得样品。
1.3.2 膨胀玉米淀粉的制备
参考LI等[5]制备膨胀淀粉的方法。称取5.0 g(干基)的普通玉米淀粉，用蒸馏水配制成5%的淀粉浆液，分别置于25、50、55、60 ℃恒温水浴下搅拌1 h，使淀粉颗粒充分膨胀，直链淀粉溢出，形成膨胀淀粉。
1.3.3 微胶囊的制备方法
在膨胀玉米淀粉中缓慢滴加2%的瓜拉纳提取物水溶液，继续保温搅拌1 h，得到咖啡因-膨胀玉米淀粉样品。分别称取5.0 g(干基) 多孔玉米淀粉、V型结晶玉米淀粉于烧杯中，用蒸馏水配制成5%的淀粉浆液，分别置于25、50、55、60 ℃恒温水浴下，再向各温度下淀粉浆液中缓慢滴加2%的瓜拉纳提取物水溶液，继续保温搅拌1 h，得到咖啡因-多孔玉米淀粉和咖啡因-V型结晶玉米淀粉样品。将上述所得样品冷却至室温，离心、用蒸馏水洗涤3次，在45 ℃下鼓风干燥后得到淡褐色粉末状产品，研磨、过筛即得咖啡因-淀粉微胶囊。
1.3.4 微胶囊中咖啡因含量的测定
1.3.4.1 标准曲线的绘制
精密称取一定量的咖啡因标品，用二甲基亚砜(DMSO)作溶剂，配制成浓度为：0、5、10、15、20、25、30、35、40、45 μg/mL 的系列标准溶液，在260～360 nm进行扫描测定，最大吸收峰在276.1 nm处。以吸光度(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标，计算回归方程，A=0.041 2C-0.003，相关系数为0.999 4。
1.3.4.2 咖啡因含量测定
精密称取0.03 g微胶囊，分散在6 mL的DMSO中，剧烈漩涡后在276.1 nm下测定吸光值，用DMSO-淀粉溶液作为对照。根据所测样品的吸光值，可从标准曲线上按照公式(1)计算出咖啡因的含量：
(1)
式中：X，每克微胶囊中咖啡因的含量，mg/g；C1，根据标准曲线计算得出的咖啡因浓度，μg/mL。
1.3.5 微胶囊中咖啡因包埋效率的计算
微胶囊中咖啡因包埋效率按公式(2)计算：
(2)
式中：Y，咖啡因包埋效率，%；M1，微胶囊的质量，g；X，每克微胶囊中咖啡因的含量，mg/g；M2，反应时加入的咖啡因的质量，g。
1.3.6 扫描电镜
用导电双面胶把各样品依次固定在样品托盘上，吹扫多余样品后用小药匙轻压样品，使部分样品进入胶基，然后用刀片轻轻刮各样品表面，在操作电压为20 kV时，通过扫描电镜在放大倍数为100/1 000/5000下观测样品的微观形貌。
1.3.7 X-射线衍射(X-ray diffraction,XRD)分析
取样品粉末置于长方形铝片的孔中，随后压紧，测试条件为：入射波长0.154 2 nm，管压40 kV，管流40 mA，扫描范围5～35 °，扫描步长0.04 °，扫描速度0.1秒/步。
1.3.8 紫外全波长吸收
取咖啡因-膨胀淀粉和咖啡因-多孔淀粉制备的微胶囊各10 mg分散在2 mL的DMSO中，取咖啡因-V型淀粉制备的微胶囊10 mg分散在6 mL的DMSO中，用UV-1900紫外分光光度计在260～360 nm内扫描，设置扫描间距0.1 nm。
1.3.9 数据统计分析
用SPSS 17.0进行统计分析，用Origin 8软件进行作图，各组实验数据均为3次重复测定后的平均值。
3种淀粉壁材包埋的咖啡因微胶囊在不同温度下的咖啡因含量和包埋效率如图1所示。由图1可以看出，膨胀淀粉制备的微胶囊中咖啡因含量和包埋效率随温度升高而增加。普通玉米淀粉在25 ℃进行水热处理后，其咖啡因含量仅为0.56 mg/g，当温度升高至50 ℃时，其咖啡因含量达到2.82 mg/g。这是由于淀粉颗粒在50～60 ℃进行水热处理时，颗粒发生溶胀，溶胀后的淀粉颗粒有利于包埋咖啡因[8]。当温度升高至60 ℃时，微胶囊中的咖啡因含量和包埋效率达到最高，分别为10.30 mg/g和14.65%，随着加热温度提高，淀粉颗粒表面的直链淀粉溢出，有利于截留更多的咖啡因[9]。
多孔玉米淀粉制备的咖啡因微胶囊中，其咖啡因含量和包埋效率随加热温度升高呈现先升高后减小。在25 ℃下，多孔淀粉对咖啡因的包埋量为7.80 mg/g，显著高于同条件下原淀粉对咖啡因包埋量。原玉米淀粉颗粒表面具有一定的通道，对小分子具有一定的吸附能力[10]，而多孔淀粉由于在酶解过程产生许多由颗粒表面向中心延伸的直径为1 μm左右的孔洞，这种孔洞虽然不易截留咖啡因等水溶性小分子，但与原淀粉相比,其比表面积较大，与咖啡因接触面积较大，其多孔结构有利于对咖啡因的包埋[11]。随着加热温度提高，在50 ℃时微胶囊中的咖啡因含量和包埋效率最高，分别为13.39 mg/g和19.04%，继续提高加热温度,咖啡因含量和包埋效率反而降低。这可能是由于温度较低，咖啡因分子扩散缓慢，难以被多孔淀粉吸附至其多孔结构内；而在50～60 ℃时,随着温度的升高，一方面可能会改变多孔淀粉结构[12]，另一方面可能是由于该吸附过程放热[13]，提高加热温度导致咖啡因包埋量降低。
V型结晶玉米淀粉制备的咖啡因微胶囊中，其咖啡因含量和包埋效率随加热温度升高而增加。在25 ℃时，V型结晶淀粉包埋咖啡因为24.24 mg/g，当加热温度提高至60 ℃时，其咖啡因含量和包埋效率达到最高，分别为45.90 mg/g和65.27%。这是由于温度较低，直链淀粉和支链淀粉进入水相，发生部分糊化，溢出的淀粉分子可对体系中的咖啡因分子进行截留[14]，随着温度升高，体系中更多的淀粉分子溢出，有利于对咖啡因分子进行缠绕、包埋。
a-咖啡因-膨胀淀粉微胶囊；b-咖啡因-多孔淀粉微胶囊；c-咖啡因-V型结晶淀粉微胶囊
图1 三种微胶囊的咖啡因含量和包埋效率
Fig.1 Caffeine content and embedding efficiency of three microcapsules
注：不同小写字母表示具有显著性差异(P<0.05)
不同温度下制备的3种咖啡因微胶囊颗粒形态如图2所示。由图2可以看出，普通玉米淀粉颗粒呈现球形或多角形，表面较为光滑。咖啡因-膨胀淀粉微胶囊表面出现皱缩和破裂，并伴随着颗粒的团聚，这是淀粉颗粒在加热过程发生膨胀并在干燥后发生收缩的结果。在低于淀粉糊化温度下加热原淀粉包埋咖啡因后，淀粉颗粒形态没有显著差异。
a-普通玉米淀粉；b-多孔玉米淀粉；c-V型结晶玉米；
d-咖啡因-膨胀淀粉微胶囊；e-咖啡因-多孔淀粉微胶囊；
f-咖啡因-V型结晶淀粉微胶囊
图2 三种微胶囊的扫描电镜
Fig.2 Scanning electron microscopy of three microcapsules
多孔玉米淀粉颗粒呈蜂窝状的中空结构，孔径1 μm左右，由表面向中心深入。由图2可以看出，咖啡因-多孔淀粉微胶囊表面出现比膨胀淀粉更为明显的皱缩和破裂，这是因为在酶解过程中淀粉的结晶区和无定形区均遭到破坏，升温时颗粒更容易坍塌和崩解。在不同温度下所得到的微胶囊形态差异较小，表明多孔淀粉对咖啡因的吸附不改变多孔淀粉的颗粒形态。
V型结晶玉米淀粉呈颗粒状，由于醇碱法处理中，乙醇抑制了淀粉颗粒膨胀，颗粒内部的水分和乙醇在最后干燥时逸出，导致表面皱缩，出现凹陷，内部形成空穴[15]。由图2可以看出，V型结晶玉米淀粉进行水热处理后，常温下颗粒即发生溶解、破裂，直链淀粉和支链淀粉进入水相，冷却后呈不规则的块状并表现出更为致密的结构，这是淀粉重结晶的结果[16]。
淀粉微胶囊的X-射线衍射图谱如图3所示。由图3可以看出，随着温度升高，膨胀玉米淀粉制备的微胶囊结晶度略有降低，这是由于淀粉颗粒结晶部分主要是由支链淀粉分子构成，水热处理时，直链淀粉溶出，直链分子链与支链分子链间的相互作用增强，分子链的流动性增强，双螺旋的运动破坏淀粉微晶并改变微晶位向[17]，使结晶度略有降低，但结晶的完善度和稳定度提高[18]。且微胶囊在2θ为7.36 °、13.1 °和20.1 °的V型峰并无明显变化，说明咖啡因和膨胀玉米淀粉之间并未形成V型复合物，而是淀粉分子对咖啡因分子的物理截留[19]。
随着温度升高，多孔玉米淀粉制备的微胶囊也表现出结晶度略有降低，这和膨胀玉米淀粉较为相似。但在60 ℃时咖啡因-多孔玉米淀粉微胶囊结晶度(28.7%)仍高于咖啡因-膨胀玉米淀粉微胶囊(24.8%)，表明多孔玉米淀粉的结晶区在水热处理过程中破坏程度较低，这可能是由于酶解后的多孔淀粉无定形区遭到一定破坏[20]，相对结晶度提高；随着水分子的进入，淀粉链段的流动性增加，直链淀粉-直链淀粉、直链淀粉-支链淀粉和支链淀粉-支链淀粉之间的相互作用导致双螺旋的形成或优化，从而形成了新的结晶[21]。
随着温度升高，V型结晶玉米淀粉制备的微胶囊的结晶度升高。V型结晶淀粉在水热处理后，V型峰消失，其峰形与玉米淀粉的糊化峰相似。但不同的是，在不同温度下的咖啡因-V型结晶淀粉微胶囊均在11.9 °出现新的尖锐峰，为瓜拉纳提取物的衍射峰，微胶囊呈现一种新的物相[22]，表明咖啡因包埋成功。
a-咖啡因-膨胀淀粉微胶囊；b-咖啡因-多孔淀粉微胶囊；c-咖啡因-V型结晶淀粉微胶囊
图3 三种微胶囊的X-射线衍射图谱
Fig.3 X-ray diffraction of three microcapsules
紫外吸收光谱是探索包埋物形成的有效方法[23]。3种微胶囊的紫外吸收光谱如图4所示，由图4可以看出，膨胀淀粉和V型结晶淀粉制备的微胶囊，其吸光值随水热处理温度升高而逐步增加；多孔淀粉制备的微胶囊，其吸光值在常温下最小，继续提高加热温度，吸光值随水热处理温度升高而逐步减小。3种微胶囊最大吸收波长在275.5 nm左右，且与咖啡因含量趋势一致，咖啡因标品在276.1 nm处显示最大吸收峰，进一步说明咖啡因包埋成功。
a-咖啡因-膨胀淀粉微胶囊；b-咖啡因-多孔淀粉微胶囊；c-咖啡因-V型结晶淀粉微胶囊；d-咖啡因标品
图4 三种微胶囊的紫外吸收图谱
Fig.4 UV spectrum of three microcapsules
不同咖啡因-淀粉微胶囊的形成机理如图5所示。普通玉米淀粉在低于糊化温度下进行水热处理，颗粒保持基本形态，发生可逆溶胀，无定形区的淀粉分子可以移动、重组，直链淀粉溶出至颗粒表面，形成膨胀淀粉。温度在微胶囊的形成中起主导作用，其中X-衍射图谱中显示普通玉米淀粉仍保持其晶体结构；紫外吸收光谱中显示微胶囊的形成不涉及到化学相互作用，而咖啡因的含量随着温度的升高而增加，这是因为越来越多的直链淀粉分子浸出，导致无定形区具有更高的迁移速率。咖啡因分子一部分被浸出的直链淀粉截留，一部分迁移至淀粉颗粒的无定形区，待冷却至室温后，颗粒基本恢复至原玉米淀粉形态，而咖啡因分子被淀粉分子截留。
多孔玉米淀粉颗粒表面具有很多由表面向中心深入的孔洞，这种多孔结构相比原淀粉具有较大的比表面积，咖啡因分子可以通过这种多孔结构而被吸附。该吸附为动态过程，随着反应时间的进行，咖啡因最终达到吸附平衡。在常温下由于咖啡因扩散速率较缓慢，多孔淀粉对其吸附量较低，而在较高温度范围内，随着温度的升高，吸附量减少，是由于该吸附过程放热，低温下更有利于咖啡因的吸附。
V型结晶玉米淀粉在低于糊化温度下进行水热处理，颗粒迅速发生不可逆溶胀，直链淀粉溶出同时支链淀粉双螺旋发生解离，两者进入水相后，体系中的咖啡因分子被缠绕、束缚。X-衍射图谱显示,V型结晶玉米淀粉发生糊化而失去其晶体结构；紫外吸收光谱显示,微胶囊的形成不涉及到化学相互作用。当温度降低后，直链淀粉和支链淀粉分子又会通过氢键等作用力发生聚集，淀粉分子发生重结晶，形成更为稳定的结构，咖啡因分子被截留在淀粉分子重结晶过程中。
a-咖啡因-膨胀淀粉微胶囊；b-咖啡因-多孔淀粉微胶囊；
c-咖啡因-V型结晶淀粉微胶囊
图5 三种微胶囊的形成机理
Fig.5 Formation mechanism of three microcapsules
以膨胀淀粉、多孔淀粉和V型结晶淀粉为壁材，制备得到3种咖啡因-淀粉微胶囊，优化了最佳包埋温度。研究发现V型结晶淀粉微胶囊中咖啡因含量和包埋效率最高。咖啡因的包埋和吸附不改变包埋壁材的颗粒形态，且没有产生新的V型结晶峰，紫外光谱证实了咖啡因在淀粉分子中成功包埋。由于咖啡因和淀粉均为亲水性物质，以淀粉为壁材制备咖啡因微胶囊具有工艺简单、反应时间短、成本低等优势，在新型食品的研发中具有广阔的应用前景，研究结果对含咖啡因提神食品的开发具有重要的理论指导意义。
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