腊鱼独特的品质与其在发酵过程中脂肪的水解、氧化密不可分[1-2]。脂肪酶是水解脂肪的关键酶类，其水解脂肪后生成的游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)是脂肪氧化的基础。脂肪氧化形成的过氧化物再经一系列复杂反应，生成了大量的风味物质，形成了发酵腊鱼特有的风味，同时也改变了产品的营养、色泽[3-4]。腊鱼发酵，脂肪酶的来源主要有两条途径，内源酶和微生物产酶[5-6]。由于内源酶和微生物产酶的数量有限，可以考虑在腊鱼发酵过程中适当添加外源脂肪酶，以达到改善品质的目的。
外源脂肪酶在加速发酵肉制品成熟、改善产品品质方面得到了应用并取得了较好的效果：LIU等[7]研究发现外源脂肪酶可显著增加发酵香肠中FFA含量，加速发酵进程，改善产品品质；甘春生等[8]向猪后腿注射脂肪酶，生产具有金华火腿风味的火腿片；吴若娜[9]在腊鸭腿的制作过程加入脂肪酶，不仅缩短了成熟时间，还产生了更多风味物质。目前，有关外源脂肪酶调控腊鱼发酵进程，改善发酵腊鱼品质的研究尚鲜有报道。本研究以期为人工发酵腊鱼的品质改善提供参考。
鲜活白鲢(1.25±0.25) kg、生姜、八角、花椒等，购于雅安市苍坪山农贸市场；LVK-F100脂肪酶(22 000 U)，深圳市绿微康生物工程有限公司；试剂(三氯甲烷、甲醇、石油醚等)，成都科隆化学品有限公司。
HHWS-Ⅱ-200恒温恒湿培养箱，上海跃进医疗器械有限公司；TA. XTPIus物性分析仪，Stable Micro System公司；NR10QC手持式色差仪，深圳市三恩驰科技有限公司； pHS-3C型精密pH计，北京赛多利斯仪器系统有限公司。
1.3.1 菌种制备
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum, Lp-145)、木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus， Sx-135)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae， Sc-31)，均从中国传统的发酵酸鱼中分离得到，由江南大学食品学院惠赠。将培养好的菌种经离心(8 000 r/min、4 ℃、15 min)，生理盐水(0.9%)悬浮洗菌后，调整菌液浓度至107～108 CFU/mL备用。
1.3.2 腊鱼的制作工艺
将鲢鱼前处理后切成长、宽、厚为(5±0.2)cm×(5±0.2)cm×(2±0.2)cm的鱼块；以鱼肉质量为基准，食盐3.5%、葡萄糖3%、生姜片12%、花椒1.2%、八角0.12%、三氯蔗糖0.02%、水200%煮制发酵液；鱼肉与发酵液装坛后接入发酵剂，接入量为1%，接入比例为1∶1∶1[10]；发酵期间加入外源脂肪酶，发酵3 d；发酵结束后清水清洗鱼肉并在鱼肉表面涂抹与发酵阶段相同的菌种，30 ℃鼓风干燥3 h后，在15 ℃、湿度70%的条件下成熟5 d。
1.3.3 单因素及响应面优化试验
以发酵后鱼肉FFA含量和pH，成熟后产品白度、质构和感官为指标，考察发酵温度(14、17、20、23、26 ℃)、脂肪酶添加量(0.00%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.1%)、脂肪酶添加时间(0、12、24、36、48 h)3个因素对腊鱼品质的影响。
在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken模型，以感官评价为响应值优化工艺条件。
1.3.4 FFA含量测定
参考GB 5009.229—2016测定[11]。
1.3.5 鱼肉pH值的测定
精确称取 5 g 鱼肉于器皿中，加 50 mL 蒸馏水，高速均质 1 min后用 pH计测定。
1.3.6 白度值测定
色差仪测定，利用公式(1)计算产品白度。
白度=100-[(100-L*)2+(a*)2+(b*)2]1/2
(1)
式中：L*，亮度；a*，红度；b*，黄度。
1.3.7 质构测定
TA-XT2i型质构仪，P/5圆柱形探头，选取鱼中线以上距头部6 cm处，发酵、成熟后表面平整的鱼块，切成2 cm×2 cm×2 cm的形状，鱼皮侧紧挨载物台放置，进行测定。测定条件：测试模式TPA；测前速度1 mm/s，测试速度1 mm/s，测后速度1 mm/s，压缩程度为40%，停留间隔5 s，负重5 g[12]。
1.3.8 感官评定
感官评定由10名食品专业人员组成的感官评定小组完成，具体评分标准见表1。
采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面试验设计与分析，运用SPSS 19.0 软件Duncan法进行显著性分析，图表中不同的上标字母表示差异显著(P<0.05)。
表1 发酵腊鱼感官品质评分标准
Table 1 Sensory quality scoring standards for fermented cured fish
项目(权重)评分标准颜色(10%)有光泽,黄色(9～10分)光泽度低,较黄(6～8分)无光泽,颜色较暗(0～5分)香气(30%)腊香气浓郁,无鱼腥味(21～30分)腊香气一般,轻微鱼腥味(11～20分)腊香味淡,鱼腥味较重(0～10分)滋味(40%)腌腊滋味明显,鲜香可口,无异味(32～40分)腌腊滋味一般,无其他异味,稍有苦味(21～31分)腌腊滋味淡,有其他异味,苦味重(0～20分)口感(20%)肉质紧密,熟制后不易散咀嚼肉质细腻(16～20分)肉质较紧密,熟制后易散咀嚼,肉质较细腻(11～15分)肉质疏松,熟制后易散,咀嚼肉制粗糙(0～10分)
2.1.1 发酵温度对腊鱼品质的影响
发酵温度过高，菌种生长过快容易使产品发酵过度，同时pH迅速下降也会抑制外源脂肪酶的活性；温度过低，不仅微生物生长缓慢，外源脂肪酶的活性也被抑制。如图1-A所示，在14～23 ℃，腊鱼中的FFA含量随温度升高显著增加，pH下降；而23～26 ℃时，腊鱼FFA含量仅略微增加，pH上升，其原因可能是发酵温度过高，菌种前期快速繁殖，消耗发酵液中大量营养成分，而后期营养成分减少、发酵副产物增多，影响发酵菌种的生长速度，此外，发酵后期产生的含氮碱性物质也会中和乳酸。此结果与王鹤霖等[13]对鲁氏酵母发酵香肠加工工艺的研究结论基本一致。许多学者提出，对于发酵鱼制品，pH在降至4.6以下时可保证产品的安全性[14-16]，本研究中，20 ℃和23 ℃发酵均能达到这一要求。腊鱼在成熟过程中，FFA氧化和鱼肉本身的非酶促褐变会导致鱼体表面颜色由白色向金黄色转变，白度降低[17-18]，发酵过程中脂肪和蛋白质的分解会影响产品的质构[19]。如图1-B所示，发酵腊鱼的白度随温度的升高显著降低，质构也发生了明显变化(表2)。整体感官评分随发酵温度的升高呈先上升后下降的趋势20 ℃条件下发酵的腊鱼感官评分最高(图1-C)，此时产品肌肉表层为淡腊黄色、肌肉内部呈白色，腊香气柔和浓郁，腌腊滋味明显，肉质紧实。
A-FFA及pH； B-白度； C-感官评分
图1 发酵温度对发酵腊鱼游离脂肪酸含量、pH、白度和感官评分的影响
Fig.1 Effect of fermentation temperature on free fatty acid content, pH, whiteness, and sensory score of fermented cured fish
表2 发酵温度对发酵腊鱼质构的影响
Table 2 Effect of fermentation temperature on texture of fermented cured fish
参数样品14 ℃17 ℃20 ℃23 ℃26 ℃硬度2 481±274.8a2 781±397.2a2 964±161.6ab3 561±335.1b4 144±339.2c弹性0.89±0.02a0.86±0.02b0.84±0.02bc0.83±0.01bc0.81±0.03c咀嚼性1 382±238.3a2 146±531a2 093±835a1 924±594.7a1 996±410.3a回复性0.25±0.02a0.26±0.01a0.29±0.04a0.29±0.01a0.29±0.05a
注：同行不同字母表示差异显著(P<0.05)(下同)
2.1.2 外源脂肪酶加入量对腊鱼品质的影响
外源脂肪酶加入量低，腊鱼品质改善不明显，加入量过高，鱼肉脂肪水解速度快，后期容易氧化过度。如图2-A所示，随着脂肪酶加入量的递增，发酵后鱼肉中的FFA含量先增加后减少，pH值呈先下降后上升的趋势。酶添加量超过0.04%，腊鱼的FFA下降，其原因可能是：底物浓度不变的情况下，酶量的增加对脂肪水解程度提升是有限的[20]，而如果酶添加量过高，水解脂肪生成FFA的速度过快，FFA参与脂肪氧化的速度也越快，大量的FFA参与到脂肪氧化进程中，生成醛、酮和酯类等物质而被消耗，因此含量降低。腊鱼产品的白度随脂肪酶加入量的增加整体呈下降趋势(图2-B)，质构变化不明显(表3)。加入脂肪酶后产品的香气和滋味均发生改变，当酶的加入量为0.04%时产品的感官总评分显著高于其他组(图2-C)，此时产品为淡腊黄色，腊香味特征明显，口感浓郁。
A-FFA及pH； B-白度； C-感官评分
图2 脂肪酶添加量对发酵腊鱼游离脂肪酸含量、pH、白度和感官评分的影响
Fig.2 Effect of lipase addition on free fatty acid content, pH, whiteness, and sensory score of fermented cured fish
表3 脂肪酶添加量对发酵腊鱼质构的影响
Table 3 Effect of lipase addition on texture of fermented cured fish
参数样品00.02%0.04%0.06%0.08%0.10%硬度2 790±179a2 840±362a2 863±312a 2 534±312a2 566±188a2 706±204a弹性 0.75±0.03a 0.80±0.03ab 0.84±0.02ab 0.86±0.12b 0.77±0.06ab 0.83±0.02ab咀嚼性1 249±193a1 368±381a1 440±224a1 400±13a 1 198±110a1 915±68b 回复性0.23±0.02b0.23±0.02bc0.26±0.02bc0.20±0.01a0.26±0.01c0.24±0.01bc
2.1.3 脂肪酶加入时间对腊鱼的影响
在接入发酵剂后的0～48 h选择不同时间加入脂肪酶，探究脂肪酶的加入时间对腊鱼品质的影响。将发酵剂和脂肪酶同时接入(0 h)，此时乳酸菌还未大量繁殖，鱼肉pH相对较高，适宜脂肪酶的活动，且脂肪酶作用于整个发酵过程，作用时间长，生成的FFA多，pH低；随着加酶时间的不断滞后，前期加入的乳酸菌产酸导致发酵体系pH降低，抑制了脂肪酶活性，加之酶作用时间缩短，因此发酵腊鱼中的FFA含量逐渐降低，pH逐渐升高(图3-A)。虽然加入脂肪酶的目的是加速脂肪水解，为脂肪的氧化及风味物质的合成提供物质基础[21]，但脂肪的过度水解会导致产品酸价过高，氧化过度而影响产品品质，甚至可能带来食品安全问题[22-23]，因此FFA的生成量应适度。脂肪酶的加入时间对发酵腊鱼的质构影响并不显著(表4)。脂肪酶的作用时间越长，腊鱼的白度越低(图3-B)。一般来讲，颜色越深，说明氧化程度越高[24]，过高会影响产品的口感。感官评价的结果证实了这一点，发酵0 h加入脂肪酶的产品口感不佳，哈喇味明显，评价者认为发酵24 h后再加入脂肪酶感官最好(图3-C)。
A-FFA及pH； B-白度； C-感官评分
图3 脂肪酶加入时间对发酵腊鱼游离脂肪酸含量、pH、白度和感官评分的影响
Fig.3 Effect of lipase addition time on free fatty acid content, pH, whiteness, and sensory score of fermented cured fish
表4 脂肪酶加入时间对发酵腊鱼质构的影响
Table 4 Effect of lipase addition time on texture of fermented cured fish
参数样品0 h12 h24 h36 h48 h硬度2 786±457a2 142±519a3 040±597a2 159±687a2 736±916a弹性0.8±0.02a0.78±0.04a0.83±0.06a0.85±0.06a 0.81±0.03a咀嚼性1 289±175a1 028±187a1 590±258a1 263±286a1 703±766a回复性0.22±0.01a0.18±0.04a0.2±0.04a0.16±0.04a 0.21±0.01a
2.2.1 模型检验方差分析
对发酵温度、脂肪酶添加量及脂肪酶添加时间的响应面优化结果如表5所示，方差分析结果如表6所示。
表5 Box-Behnken试验设计与结果
Table 5 Box-Behnken test design and results
试验号发酵温度(A)/℃脂肪酶添加量(B)/%脂肪酶添加时机(C)/h感官评分/分11(23)0(0.04)1(36)77.4±10.621 0 -1(12) 70.8±15.430(20)0 0(24)85.8±3.941 1(0.06)0 65.1±14.75-1(17) 1 0 66.1±11.960 0 0 89.5±5.670 -1(0.02) 1 80.2±9.480 0 0 84.3±9.491 -1 0 63.4±12.110-1 0 -1 76.7±11.511-1 0 1 75.1±11.112-1 -1 0 83.6±9.1130 1 -1 71.9±13.7140 -1 -1 71.4±13.5150 1 1 74.7±11.6160 0 0 88.8±1.5170 0 0 87.4±1.8
表6 响应面回归模型方差分析
Table 6 Variance analysis of response surface regression model
方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型1 060.929117.8810.720.002 5∗∗发酵温度A76.88176.886.990.033 2∗加酶量B54.08154.084.920.062 1加酶时机C34.44134.443.130.120 1AB92.16192.168.380.023 2∗AC16.81116.811.530.256 2BC9.00 190.820.395 8A2309.961309.6628.180.001 1∗∗B2343.331343.3331.210.000 8∗∗C253.96153.964.910.062 3残差77.00 711失拟项58.75319.584.290.096 6不显著纯误差18.2544.56总离差1 137.9216
注：*表示差异显著(P<0.05)；**表示差异极显著(P<0.01)
通过Design-Expert.软件进行回归分析，得到发酵温度、加酶量和加酶时机3个因素对发酵腊鱼感官影响的二次多项回归方程：Y=+87.16-3.10A-2.60B+2.07C+4.80AB+2.05AC-1.50BC-8.58A2-9.03B2-3.58C2。从表6方差分析可知，该模型极显著(P=0.002 5<0.01)，修正相关系数平方R2=0.932 3， 
失拟项检验P=0.096 6，说明失拟项不显著。以上表明该二次方程模型拟合度好，实验误差小，能够准确地反映发酵温度、加酶量和加酶时机3个因素对发酵腊鱼感官的影响。由表6可看出，一次项A，交互项AB对响应值影响显著，二次项A2，B2对响应值影响极显著。比较各项F值可知各因素对响应值的影响大小为A>B>C，即发酵温度>加酶量>加酶时机。
2.2.2 响应面交互效应分析
由图4可知，当固定加酶时间取零点时，发酵温度和加酶量两者之间交互作用的等高线为椭圆形，交互作用显著，分别固定发酵温度和加酶量，感官评分随着加酶量和发酵温度均先增加后减小，说明控制好发酵温度与加酶量对产品的感官至关重要，这与回归方程的方差分析结果一致。
A-响应面图；B-等高线图
图4 发酵温度与加酶量对发酵腊鱼感官评分的响应面图和等高线图
Fig.4 Response surface and contour maps of fermentation temperature and lipase addition on sensory score of fermented cured fish
2.2.3 验证试验
根据响应面分析结果确定外源脂肪酶辅助发酵腊鱼的最佳工艺参数为发酵温度19.37 ℃，加酶量0.04%，加酶时间发酵后27.31 h，在该条件下发酵鲢鱼的感官评分可达到88.06±6.1。实际操作调整为发酵温度20 ℃，加酶量0.04%，加酶时间为发酵后27 h，验证实验得发酵腊鱼感官评分为88.9±6.6(图5)，与模型预测感官评分十分接近，说明用响应面法优选的条件可靠。
图5 验证试验感官评价结果
Fig.5 The sensory evaluation of verification test
鲢鱼接入发酵剂在20 ℃下发酵27 h后加入0.04%(以鱼肉计)的外源脂肪酶，继续在20 ℃下发酵45 h，之后经冲洗、烘干(30 ℃，3 h)、成熟(15 ℃，5 d)得到最终产品。加酶后，发酵腊鱼块的色泽、口感和风味与未加酶组相比均有明显改善，说明加入外源脂肪酶能有效改善发酵腊鱼的产品品质。
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