冠突散囊菌(Eurotium cristatum)是主要存在于茯砖茶中的一种益生真菌，可产生金黄色闭囊壳，即“金花”[1]，该菌是影响茯砖茶品质的重要因素，不仅可以降低茶的涩味，其菌花香及产生的色素都可增强茶的品质[2]。该菌的代谢产物具有降脂、抗肿瘤细胞活性、促消化等多种功效，菌丝体营养丰富且对人体无毒害[3-7]，常见应用于黑茶[8]的发酵，目前也见中草药[9-10]、食品[11-12]发酵。
小叶苦丁茶是由木犀科女贞属粗壮女贞(Ligustrum robustum)的鲜叶经杀青、脱水解块、揉捻、粗烘、二次揉捻、干燥、精制而成，具有多种保健功能[13]，本研究借鉴茯砖茶“散茶发花”[14]技术，通过接种冠突散囊菌发酵苦丁茶，赋予其“菌花香”，减少其苦味和粗青气，为苦丁茶新产品开发提供新思路。
小叶苦丁茶，由四川省筠连县冬青御品科技有限公司提供。冠突散囊菌(CICC 2422)，购于中国工业微生物保藏中心。CZG培养基(g/L)：蔗糖40，NaCl 50，K2HPO4 1，NH3NO3 3，MgSO4·7H2O 0.5。
1.2.1 液体菌种条件优化
以CZG液体培养基为基准培养基，装液量300 mL/L，28 ℃，120 r/min，培养5 d为基准条件，菌丝干重、菌丝球大小及有性孢子量为评估指标，对蔗糖质量分数(6%、4%、2%)、NaCl质量分数(6%、4%、2%)、pH(4.5、5.5、6.5)采用IBM SPSS Statistics19软件设计正交实验。菌丝干重计量方法、菌丝球大小测量方法分别参照文献[15-16]，有性孢子评估方法为以肉眼评判菌液黄色深浅。
在优化后的CZG培养基(蔗糖60 g/L、NaCl 40 g/L、pH 6.5)中，以28 ℃、培养5 d为基础条件，评估指标同上，围绕转速(140、120、100 r/min)、接种量(12%、10%、8%)、装液量(300、250、200 mL/L)采用上述软件设计正交实验，优化培养条件。
1.2.2 冠突散囊菌发酵工艺
小叶苦丁茶中加入一定量的无菌水后，70 ℃汽蒸20 min，自然冷却后取100 g于1 L锥形瓶中，接种10 mL液体菌种，发酵12 d(前8 d 28 ℃，后4 d 30 ℃)，70 ℃干燥90 min。肉眼评判的菌丝覆盖度为评估指标，单因子试验方法先后探究了接种菌龄、茶叶含水量(mL/g)对发酵的影响。菌龄设定分别为2、3、4、6、8、10 d(含水量为30%)；含水量(质量分数)分别设定为20%、 25%、 30%、 35%。
1.2.3 挥发性物质检测
前处理：0.4 g原叶，发酵10、12 d的苦丁茶，0.6 g NaCl于20 mL顶空瓶中，加入2 mL沸蒸馏水密封。60 ℃水浴15 min，使用65 μm PDMS/DVB固相微萃取头顶空吸附60 min，230℃解析5 min进样，采用气相色谱-质谱联用仪(7890A-5975C，Agilent)检测其挥发性成分。
色谱柱条件：HP-5MS弹性石英毛细管柱(300 mm×0.25 mm×0.25 μm)分析样品挥发性成分，载气为高纯He，流速0.8 mL/min，柱温40 ℃，保持2 min，以2 ℃/min升至110 ℃，保持2 min，以3 ℃/min升温至170 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至260 ℃，保持5 min；进样温度300 ℃，接口温度250 ℃，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃；EI电子能量70 eV，扫描范围45～350 amu。
1.2.4 茶叶感官审评
组织12位经专业培训的人员，根据GB/T 23776—2018，采用轻松感官分析系统，对样品进行定量描述分析和成对偏爱调查。
培养基成分含量和培养条件对冠突散囊菌生长的影响如表1和表2所示。
由表1可知，pH 6.5、蔗糖6%(质量分数)、NaCl 4%(质量分数)的条件下菌丝体生物量最高，菌液颜色最深，菌丝蓬松，菌丝球大小与其他组合差异不大。由于菌液黄色深浅是有性孢子数量的直观呈现[17]，同时菌丝球大小影响菌种接种在物料上的分散度，从而影响发酵的均匀度，综合评估，确定该培养基组合为最佳，与其他研究者类似研究[17]结果相符。在pH 6.5的组合下，菌丝干重、菌液颜色的结果均优于其他组合，可见pH为菌丝体生物量和有性孢子量的主要影响因素。
由表2可知，组合2、4的条件下菌丝体生物量高，菌液颜色最深，菌丝球较小，菌丝状态与其他组合一致，但组合4装液量更少，确定组合2为最佳培养条件。9种组合中，转速相同时，装液量增加，菌丝球体积趋于增大；装液量相同时，转速增加，菌液颜色趋于加深，表明菌丝球大小、有性孢子量分别与装液量、转速呈一定的正相关关系。
表1 培养基成分对冠突散囊菌生长的影响
Table 1 The effects of medium composition on E. cristatum
组合培养基组分pH蔗糖质量分数/%NaCl质量分数/%菌丝状态菌丝球大小菌液颜色菌丝干重/g16.525蓬松颗粒状++黄1.82826.546蓬松颗粒状++深黄1.88636.564蓬松颗粒状++深黄2.12445.526蓬松颗粒状++微黄1.73955.544沉淀颗粒状+浅褐1.65365.565沉淀颗粒状++浅褐1.78774.524蓬松颗粒状+微黄1.38384.545蓬松颗粒状++黄1.54794.566沉淀颗粒状++浅褐1.658
注：菌丝球大小,“+”表示直径约1 mm；“++”表示直径约2 mm；以此类推(下同)
表2 培养条件对冠突散囊菌生长的影响
Table 2 The effects ofculture conditions on E. cristatum
组合培养条件转速/(r·min-1)接种量/%装液量/mL菌丝状态菌丝球大小菌液颜色菌丝干重/g114012200蓬松颗粒状+++++1.819214010250蓬松颗粒状++++++2.28731408300蓬松颗粒状++++++2.147412010200蓬松颗粒状++++++2.23551208250蓬松颗粒状+++++2.104612012300蓬松颗粒状+++++2.10371008200蓬松颗粒状+++++2.000810012250蓬松颗粒状++++++1.667910010300蓬松颗粒状+++++1.383
注：菌液颜色“+”表示不变黄;“++”表示微黄；“+++”表示黄；“++++”表示深黄
茶叶含水量和接种菌龄对冠突散囊菌菌丝生长的影响如图1和图2所示。
如图1所示，当含水质量分数为35%和30%时，延滞期最短，发酵4和8 d，菌丝覆盖度分别达到30%和80%以上，10 d即完全覆盖，周期最短。前者发酵4 d后，菌丝生长状况较后者略差，可确定30%含水质量分数为发酵最佳，低于茯砖茶发酵所需水分的10%[18]，也进一步说明30%(质量分数)左右的水分条件已达到冠突散囊菌生长需求，水含量过高或过低都会影响其生长。从菌丝生长的各阶段来看，延滞期最长8 d，最短3 d；进入指数期后，菌丝覆盖速率在含水质量分数最佳(30%)与最低(20%)的条件下可分别达到30%/d和10%/d，后者最终不能完全覆盖，可见水分含量对发酵的整个阶段均有显著影响。
图1 水分含量对冠突散囊菌生长的影响
Fig.1 The effects of water content on the growth of E.cristatum
如图2所示，菌龄为4 d的菌种，接种后延滞期最短，发酵4和8 d，菌丝覆盖度分别达到30%和90%，10 d完全覆盖，周期最短。可确定接种菌龄4 d最佳。不同菌龄间延滞期相差最多4 d；菌龄8、10 d的菌种虽最终不能完全覆盖，但进入指数期后，其菌丝覆盖速率在6～8 d略高于短菌龄菌种，可见菌龄主要影响延滞期与发酵周期。
图2 菌龄对苦丁茶发酵的影响
Fig.2 The effects of inoculating age on the fermentation of L. robustum
苦丁茶发酵过程中挥发性物质种类的变化如图3，表3～表5所示。
由图3可知，3个阶段的样品共检测出58种物质，其中苦丁茶原叶26种，发酵10 d的样品31种，发酵12 d的样品32种。3个样品共有相同物质11种(具体物质见表4)，原叶中的8种物质消失(具体物质见表3)；发酵10、12 d的样品分别新增15、18种物质，而且这些物质仅有3种在2阶段同时存在(具体物质见表4)；反，顺-2,6-壬二烯醛、5-甲基呋喃醛、香叶基丙酮、1-乙酰环己烯、甲基庚烯酮5种物质在原叶、发酵10 d的样品中检出；萜品烯、2,4-二叔丁基苯酚2种物质在原叶、发酵12 d的样品中检出。说明苦丁茶接种“金花”菌发酵及发酵的过程中挥发性物质发生了复杂而显著的变化。
图3 苦丁茶原叶、发酵10 d、发酵12 d的苦丁茶挥发性物质种类
Fig.3 Volatile substances of the original leaves of L. robustum、fermented for 10 d and 12 d
表3 原叶中消失的物质
Table 3 Substance disappeared from the original leaves
序号成分CAS 序号相对含量/%1邻伞花烃000527-84-42.032马鞭草烯酮001196-01-61.6233,5,5-三甲基 - 2-环戊烯-1-酮024156-95-41.174α-蒎烯007785-70-80.5652,3-二氢-2-甲氧苯并呋喃001746-11-80.4563-乙烯-1,2-二甲基-1,4-环己二烯062338-57-20.187十五烷000629-62-90.178α-异松油烯000586-63-00.13
由表4可知，发酵10和12 d新增两阶段新增物质交叉少、基数小、种类多，而且仅分别有3、4种物质从茯砖茶中被检出[19-23]，表明随着发酵的进行，物质变化在持续，物质成分与茯砖茶有较大的差异。
由表5可知，发酵10 d的样品中柠檬醛、香叶醛为含量最多的2种物质，占到了54.05%，相对苦丁茶原叶共增加了24.45%，但在发酵12 d的样品中含量则下降为12.55%。发酵12 d的样品中桉叶油醇、芳樟醇含量最多，占到了45.21%，相对原叶和发酵10 d的样品分别共增加了22.34%和37.91%。这些显示不同发酵阶段样品中挥发性主体物质也发生了巨大的变化。
芳樟醇和癸醛是所有物质中随着发酵的进行其含量持续上升的物质，其中芳樟醇的变化趋势与在茯茶发酵研究[19]的结果是一致的。甲基庚烯酮在原叶中含量高(7.97%)，在发酵10 d的样品中仅为0.93%。从芳樟醇、甲基庚烯酮变化规律来看，这2种物质具备成为生产监控指标物质的可能性，但需进一步验证。
表4 发酵10、12 d新增物质
Table 4 New substances for 10、12 d fermentation
序号成分CAS序号相对含量/%发酵10 d发酵12 d1正己酸乙酯000123-66-01.751.902棕榈酸乙酯∗000628-97-70.760.543伞花烃000099-87-60.200.6241-辛烯-3-醇∗003391-86-42.52—5D-柠檬烯005989-27-51.84—6β-环柠檬醛∗000432-25-71.09—72-丙基苯酚000644-35-90.57—82,6,6-三甲基-1-环己烯基乙醛000472-66-20.54—9亚麻三烯002153-66-40.40—10(3E,5E)-2,6-二甲基-1,3,5,7-辛四烯000460-01-50.39—11大茴香醚000104-93-80.37—13甘菊蓝000275-51-40.36—14α-愈创木烯003691-12-10.34—15Β-瑟林烯017066-67-00.32—16桧烯003387-41-5—4.46174-羟基丁酸乙酰酯000591-81-1—4.32182-蒎烯000080-56-8—3.8419水杨酸甲酯∗000119-36-8—2.1420壬醛∗000124-19-6—1.6721异辛醇000104-76-7—0.94224-乙基苯甲醛004748-78-1—0.8923E,E-2,6-二甲基-1,3,5,7-辛四烯000460-01-5—0.7524橙花醇000624-15-7—0.74254-甲氧基苯乙烯000637-69-4—0.5326十二烷000112-40-3—0.3427(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯酸甲酯001862-61-9—0.32281-乙基-4-乙烯基苯003454-07-7—0.25293-蒈烯013466-78-9—0.2430二十七烷∗000593-49-7—0.19
注：—表示未检测到相应物质；*表示茯砖茶中检出物质
表5 三个样品中相同的挥发性物质
Table 5 The same volatiles in the three samples.
序号成分CAS 序号相对含量/%原叶发酵10 d发酵12 d1桉叶油醇000470-82-619.120.8934.302柠檬醛005392-40-518.8324.809.233香叶醛000106-26-310.7729.253.324芳樟醇000078-70-63.756.4110.915α-松油醇010482-56-12.922.103.006香叶醇000106-24-12.562.612.497反式-2,4-庚二烯醛004313-03-51.641.102.1484-萜烯醇000562-74-31.600.900.319乙位紫罗兰酮000079-77-61.302.760.2510苯甲醛000100-52-70.920.973.5411癸醛000112-31-20.210.550.95
此外，发酵10、12 d的苦丁茶所呈现出的物质差异和感官特征差异均较明显，综合前述物质比较分析，发酵10 d可作为一个发酵节点，但还需结合茶汤感官特征、菌体色泽、生产周期确定发酵周期。
发酵后苦丁茶表面遍布金黄色培养物。从感官评价雷达图(图4)可知，发酵10 d后，感官风味变化明显，茶汤苦味消失，粗青气、植物香显著下降，有菌香和淡淡的甜香，汤色橙黄明亮，滋味醇和，有绵滑感；继续发酵2 d(发酵12 d)，茶汤感官变化不大。同时，75%的人更喜欢发酵后的苦丁茶。
综合发酵参数、感官特征和生产效率，确定优化后的工艺为蔗糖质量分数6%、NaCl质量分数4%、pH 6.5的CZG培养基(装液量1/4)，140 r/min、28 ℃振荡培养制备冠突散囊菌液体菌种，培养4 d后接种到70 ℃汽蒸20 min灭菌后的苦丁茶中，调整含水量为30%，28 ℃发酵8 d后升温至30 ℃，继续发酵2 d，70 ℃烘90 min。
图4 冠突散囊菌对苦丁茶感官风味的影响
Fig.4 The effects of E. cristatum on the sensory flavor of L. robustum
本文首次将冠突散囊菌应用于苦丁茶发酵，发酵工艺与茯砖茶相比，时间更短，工艺更简洁[24]；而物料含水量、发酵温度等发酵参数差异不大[14]，在一定程度上与茯砖茶发酵的实际工艺研究相吻合。
苦丁茶接种“金花”菌发酵后，感官特征明显改善；发酵过程中，挥发性物质持续变化，尤其是挥发性主体物质大幅度改变，酮类物质减少，酯类物质持续增加。
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