不同生态环境对羊肚菌挥发性物质的影响

摘要分析不同生态环境下羊肚菌挥发性物质，探讨其生态环境的影响。采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法对不同生态环境的羊肚菌挥发性物质进行定性定量分析，并通过统计分析进行聚类。结果表明，不同生态环境羊肚菌样共鉴定出33种挥发性物质，包括了7类物质，其中醛类化合物比例最高，酯、醇、烃化合物、含硫化合物含量其次，酮、呋喃含量最低；不同生态环境样品在挥发性物质种类、含量及主体挥发性香气成分存在一定差异，某些挥发性香气成分具有一定生境特异性；通过主成分和聚类分析将样品分为3个类群，相同生境驯化栽培样品聚为一类。该研究结果可为羊肚菌驯化栽培和后期生产加工提供理论依据。

关键词羊肚菌；生态环境；挥发性物质；主成分分析；聚类分析

引用格式:谢丽源,许瀛引,彭卫红，等.不同生态环境对羊肚菌挥发性物质的影响[J].食品与发酵工业,2020,46(6):95-100.XIE Liyuan, XU Yingyin, PENG Weihong, et al. Effect of differential ecological environments on the composition of volatile substances in Morchella[J].Food and Fermentation Industries,2020,46(6):95-100.

第一作者：博士，副研究员(甘炳成研究员为通讯作者，E-mail：1003919790@qq.com)

基金项目：四川省科技计划重点计划(2017NZ0006)；国家现代实用产业技术体系项目(CARS-20)

Effect of differential ecological environments on the composition of volatile substances in Morchella

(Institute of Soil and Fertilizer, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China)

ABSTRACT The impact of ecological environment on Morchella was explored by analyzing volatile substances extracted from Morchella grown in different habitats by headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry. Principal component analysis and cluster analysis were subsequently used for the identification and isolation of these volatile components. Thirty-three volatile substances, classified into seven types, were identified from these samples. Among these, the proportion of aldehydes was the highest, followed by ester, alcohols, hydrocarbons, and sulfides, while that of ketones and furans was the lowest. There were some differences in the type, content, and chemical nature of principal volatile aroma compounds among samples collected from different ecological environments; and some of the volatile substances exhibited specificity to certain habitats. Through principal component analysis and cluster analysis, the samples could be divided into three groups, with samples domesticated and cultivated in the same habitat classified into a single group. These results could provide a theoretical basis for the domestication, cultivation, and processing of Morchella.

Key words Morchella; ecological environment; volatile substances; principal component analysis; cluster analysis

羊肚菌(Morchella spp.)，隶属子囊菌门(Ascomycota)、盘菌纲(Pezizomycetes)、羊肚菌科(Morchellaceae)，羊肚菌属(Morchella)[1]，是一种珍稀名贵食(药)用菌，由于其菌盖表面有不规则多面凹陷皱褶似羊肚而得名。羊肚菌味道鲜美、营养丰富，含有多糖、生物酶类、钙、锌、铁等多种矿物质[2-3]，具有调节机体免疫力、抗疲劳、抑制肿瘤、抗菌、抗病毒、降血脂、抗氧化等多种功效[4-12]。随着羊肚菌驯化栽培技术的日趋成熟，羊肚菌种植区域越来越广，而不同的生态条件、种植方式，以及不同的基因型品种等都是影响羊肚菌挥发性香气成分的关键因素[13]，不同生态条件对挥发性香气物质的影响在食用菌尤其羊肚菌中研究甚少。本研究采用顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)-气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)的方法检测同一遗传背景、相同配套栽培方式，在四川不同生态环境驯化栽培的羊肚菌样品，分析不同产地羊肚菌挥发性物质组成种类和含量，并通过主成分分析和聚类分析表征生态环境对羊肚菌挥发性物质差异，旨在为不同产区样品的辨别和评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

分别采集不同生态环境、相同遗传背景以及相同栽培基质和培养条件的驯化栽培羊肚菌，来源如表1所示。羊肚菌采集后经过挑选、烘干，粉碎后密封待用。

1.2 仪器与设备

7890-5975气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)，配有电子轰击电离源(EI),美国Agilent公司；65 μmPDMS/DVB萃取纤维头,美国Supelco公司；Teledyne Tekmar Atomx动态顶空自动进样器,美国。

1.3 实验方法

1.3.1 顶空固相微萃取

将粉碎后的样品混合均匀，称取2.00 g试样放置在10 mL样品瓶中，加入1.5 g NaCl和6 mL经过煮沸冷却的蒸馏水，摇匀，然后将溶液置于15 mL顶空瓶中，将老化后的萃取头插入样品瓶顶空部分，于50 ℃吸附30 min，吸附后的萃取头取出后插入气相色谱进样口，于250 ℃解吸3 min，用于GC-MS分析检测。

色谱柱DB-WAX 60 m×0.25 mm×0.50 μm；载气为高纯氦气；载气流速(恒流模式)1.0 mL/min；进样口温度230 ℃；进样方式为分流进样；分流比10 ∶1；升温程序为35 ℃，以5 ℃/min速率升温至220℃，保持10 min；离子源温度230 ℃；扫描模式为scan扫描模式；扫描范围为45～350 m/z；接口温度230 ℃；

1.3.3 主体挥发性香气成分评定方法

采用相对气味活度值(relative odor activity value, ROVE)评价各挥发性物质对样品总体风味的贡献[14-16]，定义对样品风味贡献最大的组分的ROAV=100，则其他挥发性成分的ROAV<100，其计算如公式(1)所示：

式中：Ci、Ti分别为挥发性成分的相对含量(%)和气味阈值(μg/kg);Ct、Tt分别为对样品整体风味贡献最大组分的相对含量(%)和气味阈值(μg/kg)。

ROAV≥1，说明该物质为样品的主体风味成分，且在一定范围内，ROAV越大说明该物质对总体风味贡献越大； 0.1≤ROAV<1，说明该物质对整体风味有修饰作用[17-18]。

1.4 数据处理

采用IBM SPSS Statistics 22.0进行主成分分析和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 不同生态环境羊肚菌干品GC-MS分析

通过GC-MS分析，挥发性物质组成及相对含量如表2所示。12个样品共鉴定出33种挥发性物质，其中有10种醛类，8种酯类，5种醇类，6种烃类，2种酮类，1种呋喃，1种含硫化合物。从含量分析， 2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、2-甲基丙醛、乙酸乙酯、正己醛相对含量较高；从组成分析，各样品挥发性物质数量和含量有一定差异，其中共有物质13个，包括2-甲基丙醛、乙酸乙酯、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、正己醛、2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、正己醇、己酸乙酯、苯甲醛、3,6-二甲基癸烷、萘、莰烷。研究还发现，有些挥发性物质具有一定生境特异性。如仅丘陵地区样品含有硫化物；仅川西高原样品含有二十烷；仅成都平原样品含有1-辛烯-3-醇。

2.2 羊肚菌挥发性成分种类分析

由表3可知，不同生态环境样品在挥发性物质种类和相对含量没有明显相关性，差异较大。醛类种类数量最多，相对含量占比最高，在37.95%～82.25%；酯、醇、烃、含硫化合物居第2大类，分别为7.31%～15.00%、3.72%～25.82%、4.08%～9.46%和9.48%～13.99%；酮、呋喃属第3大类，分别为0.6%～1.62%和0.71%～3.29%。

2.3 羊肚菌挥发性香气成分分析

不同生态环境羊肚菌挥发性香气成分的ROAV，如表4所示。12个样品主体挥发香气成分(ROAV≥1)相似，都包含有2-甲基丙醛、乙酸乙酯、2-甲基丁醛、正己醛、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯，而其中风味贡献的最大的组分为2-甲基丁醛。2-甲基丙醛具有巧克力，蜜桃味；乙酸乙酯具有果香及葡萄、樱桃香；正己醛具有叶香、果香味；2-甲基丁醛具有果香、可可味；己酸乙酯具有强烈的甜的果香、菠萝、香蕉香气和酒香，这些香气组成了羊肚菌特有的香气。除此之外，不同生态环境样品有特异性，如PY7、PY8和PY9主体挥发香气成分还含有具有蘑菇香气、青香、蔬菜香以及油腻的气息的1-辛烯-3-醇， Q10、QL11和QL12含有具有蔬菜香的二甲基二硫化物。对整体风味起重要修饰作用的成分有一定差异。CX1、CX2、CX3、CD4、CD5、PY8对整体风味起重要修饰作用的成分(0.1≤ROAV<1)为萘，CD6和PY7对整体起重要修饰作用成分是萘、2-戊基呋喃和正戊醛，萘、2-戊基呋喃和丙酸乙酯对PY9的整体风味起修饰作用，QL10和QL11起修饰作用成分为萘、2-戊基呋喃、丙酸乙酯和正戊醛，QL12起修饰作用成分为萘、2-戊基呋喃、正戊醛、戊酸乙酯和正壬醛。

2.4 羊肚菌挥发性物质的PCA

由表5可知，特征值大于1的共7个主成分，总方差95.381%，其方差贡献率依次为44.971%、18.388%、9.331%、7.106%、6.376%、5.650%、3.558%，说明7个主成分反映了原始变量的绝大部分信息，成功达到了降维目的。

羊肚菌非挥发性物质的主成分载荷得分图如图1所示。

第一主成分(PC1)中载荷较高的挥发性物质有2-戊基呋喃、2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、正己醛、正己醇、己酸乙酯、正戊醛、戊酸乙酯、壬醛等。主成分1差异主要集中在青香、果香的挥发性物质。

第二主成分(PC2)中载荷较高的挥发性物质有二甲基丁酸乙酯和2-甲基-1-丁醇等。主成分2的差异主要集中在水果香、无香型的挥发性物质。

第三主成分(PC3)中载荷较高的挥发性物质有1-辛烯-3-醇和香叶基丙酮等。主成分3的差异主要集中在水果香、蔬菜香的挥发性物质。

如图2所示，12个羊肚菌样品可区分为三类，其中样品Q10、Q11、Q12归为1个集群，样品PY7、PY8、PY9归为1个集群，样品CX1、CX2、CX3、CD4、CD5、CD6归为1个集群。同一个集群样品的挥发性物质相似，有相似的香气成分。

2.5 羊肚菌挥发性物质的CA

采用系统聚类分析法，以33个羊肚菌挥发性物质作为变量进行聚类分析。由图3可知，当刻度为10时，12个羊肚菌样品可分为2个集群，样品QL10、QL11、QL12聚为1个集群，剩下的9个样品归为1个集群；刻度为5时，9个样品又可分为2个集群，样品PY8、PY9、PY7为1个集群，样品CX1、CX2、CD4、CD6、CX3、CD5归为1个集群。CA与PCA在刻度为5时的结果一致，说明二者均可对羊肚菌样品进行分类。通过分类结果可见，相同生境驯化栽培的样品聚为一类，如成都平原样品和丘陵地区样品分别聚为一类，川西高原和川东山区样品较为相似，聚为一类。该研究结果可为后期的样品采集提供理论依据，从而指导后期生产加工。

3 讨论

生态环境是决定样品代谢特征的重要因素，而挥发性香气成分是蘑菇致香物质的主体，是影响食用菌风味的主要因素之一[23-28]。目前羊肚菌种植区域范围广，各产地气候、土壤等生态环境差异大，使得香气风格特征表现形式多样化，体现在香气成分主要组成的含量和比例不尽相同，尤其是某些挥发性物质具有一定的生境特异性，如川西高原样品CX1、CX2、CX3含有二十烷；成都平原样品PY7、PY8、PY9含有1-辛烯-3-醇；丘陵地区样品QL10、QL11、QL12含二硫化合物。这是由于在遗传背景一致情况下，气候、土壤、水质等环境条件会影响挥发性物质的初级和次级代谢，使得积累的代谢产物在种类和含量存在一定差异。

挥发性化合物对香气的贡献是由含量和气味阈值共同决定，相对含量高的化合物不一定对香气的贡献就高。不同生态环境羊肚菌样品主体挥发性物质2-甲基丙醛、乙酸乙酯、2-甲基丁醛、正己醛、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯相同情况下，不同生境条件样品有特异性香气，PY7、PY8、PY9因含有1-辛烯-3-醇，具有蘑菇香气，Q10、QL11和QL12因含有二硫化合物而具有蔬菜香。除此之外，对整体风味起重要修饰作用的成分主要集中在萘、2-戊基呋喃、正戊醛、丙酸乙酯、戊酸乙酯和正壬醛，但不同生境间存在一定差异。由此可知，栽培环境条件不仅影响初级和次级代谢产物种类和含量，还会在一定程度上影响主体挥发香气成分和对整体风味起重要修饰的成分，从而影响样品整体风味。

从挥发性香气成分的种类含量和主体香气成分分析，不同生境羊肚菌样品存在一定差异，但是无法直接通过这些数据对相似样品进行判定、区分和聚集。进一步通过PCA和CA统计分析发现，相同生境驯化栽培样品可以聚为1类，聚集一起的样品香气相似。由此说明PCA和CA可用于表征不同生境栽培驯化样品挥发性香气成分的差异，且2种方法可以相互检验。该研究结果为羊肚菌品种选育、质量评估及后期生产加工提供理论依据。

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