红曲色素是红曲菌代谢过程中形成的聚酮类化合物[1]，主要有黄、橙、红3种色调[2]，具有抗氧化[3]、抗肥胖[4]、增强免疫力、调节血脂[5]以及抑制阿尔茨海默病[6]的功效，在食品、酿酒、保健品等行业均有广泛应用。其中红色素的生产工艺已十分成熟，而橙、黄色素因其良好的感官性能，来源天然以及不受季节、地域性限制等优点，具有良好的发展潜力和经济潜能，因此成为天然色素产品开发的新方向。

然而在红曲菌的发酵过程中，桔霉素常常伴随红曲色素的合成而产生。桔霉素有损害肝脏代谢、致畸[7]、致癌和致突变的作用[8]，并可能对中枢神经系统产生抑制[9]，这使得红曲产品的食用安全性受到挑战，限制了它的应用。目前，降低桔霉素含量主要是通过筛选菌株、基因工程及控制发酵条件3种方法[10]。已有学者通过菌株筛选获得了低产桔霉素的红曲菌株[11]。此外，通过优化发酵条件也能够控制红曲的生长情况[12]，以及利用低频磁场能够抑制桔霉素的产生[13]。本研究通过改变红曲菌液态发酵条件(如培养基成分、培养条件)，研究红曲色素和桔霉素在红曲菌中的积累规律[14]，通过外部调控选择安全有效的培养方式，为红曲色素的安全应用提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株

红曲菌株(Monascus purpureus ZH2)，由江南大学固态发酵研究室提供。

1.1.2 试剂

葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、蔗糖、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、MnSO4,国药集团化学试剂有限公司；玉米浆干粉、酵母膏,南京茂捷微生物科技有限公司；马铃薯、大米粉、糯米粉,市售；桔霉素(标准品),上海源叶生物科技有限公司产品；甲醇、磷酸,天津风船化学试剂科技有限公司；乙腈,上海星可高纯溶剂有限公司。

1.1.3 主要仪器设备

RXZ-288A人工气候箱，宁波江南仪器厂；LS-30立式压力蒸汽灭菌器，上海东亚压力容器制造有限公司；QYC-2102全温培养摇床，宁波市科技园区新江南仪器有限公司；T9CS双光束紫外可见光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；1260高效液相色谱仪,安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基与培养条件

将红曲菌接种于PDA斜面，放置于28 ℃恒温培养箱中静置培养7 d，4 ℃保藏。

制备孢子悬浮液：用无菌水洗下PDA斜面上的红曲菌孢子，然后用玻璃珠将菌团打散后过滤，血球计数板计数，使孢子数达到1×(107～108)个/mL。

种子培养基(g/L)：葡萄糖60，大豆水解液60，蛋白胨10，NaNO3 1.0，MgSO4·7H2O 2.0，KH2PO4 5.0，ZnSO4 0.02，pH自然。在28 ℃、180 r/min的条件下培养48 h。

初始发酵培养基(g/L)：葡萄糖60，蛋白胨10，NaNO3 3.0，初始pH自然。

所有培养基均在121 ℃下灭菌20 min。

1.2.2 实验方法

1.2.2.1 不同碳源对红曲菌生长的影响

采用葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、蔗糖、大米粉、糯米粉，分别设置40、50、60 g/L三个梯度，氮源统一为蛋白胨，无机盐为KH2PO4和K2HPO4，pH自然。250 mL三角瓶装液50 mL，经121 ℃灭菌20 min，接种10%种子培养基，每组样品做3个平行，在28 ℃，180 r/min下振荡培养5 d。

1.2.2.2 不同氮源对红曲菌生长的影响

可溶性淀粉作为碳源，添加量为60 g/L，(NH4)2SO4、NH4Cl、蛋白胨、玉米浆干粉、酵母膏、NaNO3为氮源，分别设置10、20、30 g/L 3个梯度，无机盐及培养条件同上。

1.2.2.3 不同无机盐对红曲菌生长的影响

可溶性淀粉添加量为60 g/L，(NH4)2SO4添加量为10 g/L，向发酵培养基中分别添加KH2PO4、K2HPO4、MgSO4(1.0、2.0、3.0 g /L)、ZnSO4(0.05、0.1、0.15 g/L)、MnSO4(0.1、0.2、0.3 g /L)。培养条件同上。

1.2.2.4 复合添加无机盐对红曲菌生长的影响

以添加K2HPO4的发酵培养基为对照，在此基础上分别将MgSO4、MnSO4、ZnSO4设计成不同的添加组合，各种无机盐的添加量与1.2.2.3优化出的单因素添加量一致。培养条件同上。

1.2.2.5 不同温度对红曲菌生长的影响

可溶性淀粉添加量为60 g/L，(NH4)2SO4添加量为10 g/L，K2HPO4添加量为2 g/L，接种量为8%，将接种好的摇瓶分别放置在18、23、28、33 ℃的条件下培养5 d。

1.2.2.6 不同装液量对红曲菌生长的影响

可溶性淀粉添加量为60 g/L，(NH4)2SO4添加量为10 g/L，K2HPO4添加量为2 g/L，接种量为8%，分别向250 mL锥形瓶中添加50、60、70、80、90、100、110、120 mL发酵培养基，在28 ℃条件下培养5 d。

1.2.2.7 不同pH对红曲菌生长的影响

可溶性淀粉添加量为60 g/L，(NH4)2SO4添加量为10 g/L，K2HPO4添加量为2 g/L，接种量为8%，装液量为50 mL/250 mL，初始pH用HCl和NaOH调至2、3、4、5、6、7、8，在28 ℃条件下培养5 d。

1.2.2.8 不同转速对红曲菌生长的影响

可溶性淀粉添加量为60 g/L，(NH4)2SO4添加量为10 g/L，K2HPO4添加量为2 g/L，接种量为8%，装液量为50 mL/250 mL，初始pH为3，将摇床转速分别设置为160、180、200、220 r/min，在28 ℃条件下培养5 d。

1.3 测定方法

1.3.1 测定色价

将发酵液研磨破碎后取1 mL于25 mL比色管中，用体积分数为70%的乙醇定容至25 mL，颠倒混匀，置于60 ℃恒温水浴中浸提40 min。浸提结束后，取出冷却至室温，用乙醇稀释适当倍数，并以70%乙醇为空白对照，在全波长扫描下找出橙、黄色素的最大吸收峰，得到黄、橙色素的OD值。通过公式(1)、(2)计算色价：

黄色价/(U·mL-1)=OD410×总稀释倍数

(1)

橙色价/(U·mL-1)=OD470×总稀释倍数

(2)

1.3.2 测定菌体干重

将滤纸烘干至恒重，精确称量滤纸的质量。充分混合后精确量取30 mL发酵液进行抽滤，滤渣用蒸馏水充分洗涤数遍后，55 ℃烘干至恒重，精确称量滤渣及滤纸的总质量。

1.3.3 桔霉素含量测定

将发酵液经破碎后取5 mL置于15 mL比色管中，并用同体积的甲醇定容至10 mL，超声萃取30 min后于8 000 r/min下离心10 min，然后将提取液微滤后用HPLC分析检测桔霉素含量。

HPLC色谱条件：流动相，V(0.1%磷酸水)∶V(乙腈)=66∶34；VWD检测器λ=330 nm；色谱柱5 μm，Agilent XDB Reversed-phase C18；柱长及柱径250 mm×4.6 mm；体积流量1.0 mL/min；温度30 ℃；标准样及样品进样量均为20 μL。

1.4 数据统计分析

显著性差异分析使用非参数秩和检验的方法(IBM SPSS Statistics 20，NY，USA)。数据作图使用Origin 8.5(Originlab corporation，Inc.MA，USA)。

2 结果与分析

2.1 300～600 nm内的波长扫描

按照1.3.1方法对发酵提取液进行可见光波长范围内扫描，确定橙、黄色素所在的波长范围，结果如图1所示。可以看出，在410 nm和470 nm附近有明显的吸收峰，分别为黄色素和橙色素。

2.2 碳源对红曲菌生长的影响

由表1可知，葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉促进红曲菌ZH2色素生长的效果相对明显。可溶性淀粉作为碳源时，红曲菌在代谢过程中产生淀粉酶和糖化酶将淀粉缓慢分解，从而使发酵液中的单糖浓度维持在一定水平，不会造成菌体快速地大量生长，有利于红曲色素的产生和积累。而高浓度的葡萄糖作为碳源时，会产生乙醇，从而抑制菌体的生长和色素的合成[15]。当蔗糖作为碳源时，菌体成大块团状，与培养基接触面积过小，导致菌体缺乏营养，不利于色素的积累。麦芽糖和葡萄糖为碳源时，桔霉素质量浓度最高达到7.15、8.35 μg/mL，可溶性淀粉质量浓度为60 g/L时，桔霉素含量最低，为5.91 μg/mL，所以选择60 g/L可溶性淀粉为红曲菌ZH2发酵的碳源。

2.3 氮源对红曲菌生长的影响

以60 g/L可溶性淀粉作为碳源，分析氮源对红曲菌生长的影响。由表2可知，不同种类及浓度的氮源对红曲菌ZH2的橙黄色素产量、菌丝干重、桔霉素的含量影响差异较大，表现出无机氮源整体优于有机氮源。(NH4)2SO4等无机氮源更适合橙黄色素生长，这可能是因为铵盐作为氮源被消耗时，降低了发酵液pH值，使发酵体系处于酸性环境中，影响相关代谢酶活性，抑制桔霉素生成或加速其作为中间代谢产物的分解，促进红曲黄色素生物合成[16]。

注：大写字母、小写a、a1、a2等字母分别代表各种类间黄色价、橙色价、菌丝干重、桔霉素含量的显著性差异(P<0.05)(下同)

当有机氮源作为红曲菌的氮源时，会被红曲菌在代谢过程中产生的蛋白酶分解成多种氨基酸，从而与红曲橙色素发生反应，将橙色素转变成水溶性红色素。而无机氮源中不含氨基酸类物质，所以不会出现上述现象。当(NH4)2SO4质量浓度为10 g/L时，黄色素含量最高，菌体生长状况良好，且桔霉素含量为7.011 μg/mL，处于较低水平。结合显著性差异分析，选择(NH4)2SO4 10 g/L作为红曲菌ZH2发酵的最佳氮源及添加量。通过氮源的优化选择，发酵液由之前的棕红色变成了明显的橙黄色。

2.4 外加无机盐对红曲菌生长的影响

以可溶性淀粉及(NH4)2SO4作为发酵培养基的碳、氮源，添加不同的无机盐到发酵培养基中，产生的色素色价各有不同，其中 KH2PO4和K2HPO4比其他几种无机盐发酵产生的橙、黄色素优势明显，这是因为KH2PO4和K2HPO4能够作为培养基的缓冲体系，维持并稳定培养基在红曲菌代谢过程中的pH。由表3可知，添加K2HPO4比KH2PO4产生的桔霉素含量要少，在质量浓度为2.0 g/L时，橙、黄色价分别达到113.51 U/mL，79.63 U/mL，桔霉素含量为6.82 μg/mL。从原材料的来源及贮存等方面考虑，选用K2HPO4为红曲菌ZH2发酵的无机盐。

磷酸盐在微生物生长和代谢调节中，具有重要的生理功能，但在合成产物的过程中还需要一些无机离子的参与[17]。以添加K2HPO4的发酵培养基为对照，在此基础上分别添加MgSO4、MnSO4、ZnSO4、MnSO4+ZnSO4、MgSO4+ZnSO4、MgSO4+MnSO4、MgSO4+MnSO4+ZnSO4等不同无机盐组合，考察复合无机盐对红曲生长的影响。由表3可知，添加了2 g/L的MgSO4和0.02 g/L的ZnSO4组合生产色素的能力最高，橙、黄色素色价分别达到119.28 U/mL，94.38 U/mL，相对应的桔霉素含量为7.10 μg/mL。综上所述，将2.0 g/L K2HPO4、2.0 g/L MgSO4及0.02 g/L ZnSO4作为红曲菌ZH2的外加无机盐。

注：后7组中无机盐的添加量(g/L)分别为MgSO4 2；MnSO4 0.04；ZnSO4 0.02；MnSO4 0.04+ZnSO4 0.02；MgSO4 2+ZnSO4 0.02；MgSO4 2+MnSO4 0.04；MgSO4 2+MnSO4 0.04+ZnSO4 0.02

2.5 温度对红曲菌生长的影响

由图2可知，在18～28 ℃的温度范围下，随着温度升高，橙、黄色素色价升高。当培养温度为28 ℃时，发酵液的色价最大，橙、黄色素色价分别为59.06 U/mL，38.56 U/mL；温度超过30 ℃，发酵液的色价明显降低，原因可能是因为温度对微生物细胞生长、产物合成及代谢的影响是多方面的，不仅可以改变培养基的性质，而且会影响细胞代谢过程中各种关键酶的活性[18]。过高或过低的温度，不利于菌体的生长和色素的积累，从桔霉素含量可以看出，在28 ℃下桔霉素含量最低，达到5.70 μg/mL，故选择28 ℃为培养的最适温度。

2.6 装液量对红曲菌生长的影响

从图3可以看出，随着装液量的增加，橙、黄色素产量逐渐降低，菌丝干重逐渐减少，说明装液量越大，越不利于红曲菌的生长[19]。这是因为红曲菌是好氧菌，在营养充足的情况下，装液量越少其通气量越大，溶氧量越多，有利于菌体生长以及产生色素等代谢产物。同时装液量不同，桔霉素的含量差别较大，在50～100 mL时，桔霉素逐渐增加，直到装液量为110 mL时，桔霉素含量随有所降低，但仍高于50 mL时的桔霉素含量。装液量为50 mL时，橙、黄色素分别达到85.50 U/mL，83.63 U/mL，菌丝干重更多，说明该条件下更有利于菌体的生长，对应的桔霉素含量最低，仅为5.73 μg/mL，故选择50 mL为最佳装液量。

2.7 不同pH对红曲菌生长的影响

由图4可知，中性环境促进红曲菌产色素的能力不够突出；中性偏酸环境有利于红曲菌产色素，菌体得率也较高，过酸环境既不利于菌体的生长也不利于色素的生成；在碱性环境下菌体基本不生长，色价也很低[20]。综上，过酸或碱性环境都不利于色素的生长积累，当pH 3～4时，菌体生长良好，总色价较高，发酵液颜色较深，其中pH 3的效果最好，红曲菌产色素的最适pH应该最接近3[21]。pH为3时，橙、黄色素含量分别达到75.63 U/mL，107.00 U/mL，而且其相对应的桔霉素含量为6.43 μg/mL，低于产色素能力相近的pH 4所对应的桔霉素含量8.27 μg/mL，所以选择pH 3作为红曲菌ZH2发酵的初始pH。

2.8 不同转速对红曲菌生长的影响

由图5可知，随着转速的增加，橙、黄色素色价逐渐增大，在200～220 r/min时达到稳定状态。转速越大，通气量越大，红曲菌的溶氧就越大，从而越有利于菌体生长，但是转速过大，虽能增加溶氧量，但会因剪切力过大，对菌丝的生长产生影响，从而导致色素的生长能力降低[19]。由图5看出，在200 r/min和220 r/min条件下的色素产量相当，但后者的菌体生长量达到最大，且桔霉素含量低于200 r/min时，所以选择220 r/min作为培养的最佳转速。在此条件下，红曲菌ZH2的橙、黄色素色价分别达到152.96、108.38 U/mL，桔霉素含量为5.80 μg/mL。

3 结论

通过对红曲菌ZH2进行单因素优化实验，得到了在摇床水平下发酵红曲菌ZH2高产红曲色素、低产桔霉素的最佳培养基配方：碳源为可溶性淀粉60 g/L，氮源为(NH4)2SO4 10 g/L，无机盐K2PO4 2.0 g/L，MgSO4 2.0 g/L，ZnSO4 0.02 g/L；最适的发酵条件为温度28 ℃，装液量50 mL/250 mL，初始pH 3，转速220 r/min，发酵5 d。经过优化后，发酵液中橙、黄色素由最初的18.59 U/mL，24.54 U/mL分别提高到152.96 U/mL，108.38 U/mL，桔霉素含量由最初的8.35 μg/mL减少到5.80 μg/mL，降低了30%。

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Optimization of submerged fermentation for Monascus sp. producing high titer of orange and yellow pigments with less citrinin

ZHOU Ke1,2, YAN Pengcheng1,2, HU Yongdan1,2*

1(Faculty of Agriculture and Food, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China) 2(Yunnan Institute of Food Safety, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China)

ABSTRACT Monascus pigments, the secondary metabolites of Monascus sp., is a kind of natural pigments with a long application history and is widely used in food, medicine, cosmetics and other industries.However, biosafety should be regarded for some strains or fermentation process caused the products contained remarkable level of citrinin, a nephrotoxicity-genic compound.In this study, the medium components and culture conditions were optimized to improve the yield of Monascus pigments and to reduce the content of citrinin, taking pigment value, biomass and the content of citrinin as indicators.The results showed that the optimal medium for shaking flask fermentation were as follows: soluble starch 60 g/L ,(NH4)2SO4 10 g/L, K2HPO4 2 g/L, MgSO4 2 g/L and ZnSO4 0.02 g/L, and the optimal fermentation conditions were: broth content 50 mL/250 mL, initial pH 3.0, rotation speed 200 r/min, temperature 28 ℃ and duration 5 days.Under this condition, the yields of monascorubrin(orange)and monascin(yellow)were increased by 6 times and 4 times, respectively, and that of citrinin reduced by 30%.

Key words Monascus; orange pigment; yellow pigment; citrinin; optimization; submerged fermentation

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.022809

引用格式:周珂，严鹏程，胡永丹.高产橙黄色素低产桔霉素红曲菌的液态发酵条件优化[J].食品与发酵工业,2020,46(7):116-122.ZHOU Ke, YAN Pengcheng, HU Yongdan, et al.Optimization of submerged fermentation for Monascus sp.producing high titre of orange and yellow pigments with less citrinin[J].Food and Fermentation Industries,2020,46(7):116-122.

第一作者：硕士研究生(胡永丹讲师为通讯作者，E-mail：kunlan881221@126.com)

收稿日期：2019-11-14，改回日期：2019-12-31