红鱼，学名红笛鲷(Lutjanus sanguinaus)，主要盛产于我国南海北部湾，具有高蛋白、低脂肪的品质特性。红鱼经低盐腌制而成红鱼干，因味道鲜美独特而成为享誉盛名的中国传统美食[1-2]。但是低盐无法形成高渗透压来抑制微生物生长，红鱼干极易因潮湿环境而霉变和脂肪氧化[3]。鱼干在加工和贮藏过程中脂肪会因微生物、湿度和温度等因素而发生过度氧化，产生不愉快的哈喇味，并且出现变黄和发黏现象[4]。研究发现，水产干制品中主要的优势真菌有曲霉属、镰孢菌属和青霉属[5]，而镰孢菌有逆境生长的特性，不利的生长环境使镰孢菌的产毒能力提升[6-7]。王小博等[8]调查湛江39批次的霉变水产品，T-2毒素检出率17.95%，而T-2毒素由镰孢菌产生[9]，因此对鱼干进行防霉有利于控制T-2毒素。目前食品防霉的方法有物理、生物、化学防治和天然植物防霉剂，而食品中应用最广的是化学防治，其不当使用损害人体健康，因而人的目光投向更安全有效的天然植物防霉剂[10-11]。
五味子是我国重要的药食两用资源，且放置多年不霉变[12]。研究表明，五味子提取物可显著降低豆酱中肠球菌数量[13]，对面制食品中的毛霉、金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于常用化学防腐剂[12]。五味子醇提物的抗氧化效果强[14]。因此五味子具有开发为天然防腐剂的巨大潜力，而五味子对真菌的抑菌效果的报道较少，其是否具有开发为天然防霉剂的潜力还有待研究，且五味子提取液(Schisandra chinensis extract, SCE)应用于水产干制品的报道较少。本试验旨在通过乙醇法提取五味子的活性成分，测定SCE抗氧化和抗优势镰孢菌效果，并探究其对红鱼干基本特性的影响，为五味子应用于红鱼干的加工、贮藏提供方向，也为其开发为天然食品防霉防腐剂提供理论依据和技术支持。
鲜活红鱼，购于广东省麻章区湖光市场；北五味子，购于白山市岚昕特产贸易有限公司；产毒尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)(FO1)、厚垣镰孢菌(Fusarium chlamydosporum)(FO2)和镰孢菌(Fusarium spp.)(FO3)，源于霉变鱼干优势镰孢菌分离株；其他试剂均为分析纯。
84-1A磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司；722S可见光分光光度计，上海棱光仪器有限公司；Varioskan全自动酶标仪、RC6 Plus离心机、AquaLab Se水分活度仪，赛默飞世尔科技公司；MF-1200C高温箱式炉，安徽贝意克设备技术有限公司；HX204卤素水分测定仪，瑞士梅特勒-托利多；VAPT450全自动凯氏定氮仪，德国格哈特公司；PUS-3E酸度计，上海雷磁厂。
1.3.1 SCE的制备
参考崔敬爱等[15]的方法，五味子干燥、粉碎，取粉末50.0 g，加500 mL 85%乙醇，磁力搅拌浸提4 h，过滤，重复1次，合并滤液，离心，取上清液蒸发浓缩，制成1 g/mL不含乙醇的SCE，于4 ℃保存。
1.3.2 SCE抗氧化效果的测定
1.3.2.1 SCE对DPPH自由基的清除能力
参照SHIMADA等[16]的方法，取1.0 mL SCE(0.4、1、2、3、4 mg/mL)和1.0 mL 0.4 mg/mL DPPH溶液于试管中，混匀，避光静置30 min，离心，取上清液测定OD517。平行3次，取平均值。DPPH清除率按公式(1)计算。以IC50值评价SCE的抗氧化效果。以 SCE浓度为横坐标，清除率为纵坐标，清除率为50%时对应的 SCE的浓度即为IC50。
(1)
式中：OD1，1.0 mL蒸馏水+1.0 mL DPPH溶液的吸光度值；OD2，1.0 mL样品上清液+1.0 mL DPPH溶液的吸光度值；OD3，1.0 mL样品上清液+1.0 mL无水乙醇的吸光度值。
1.3.2.2 SCE对ABTS自由基的清除能力
参照KETNAWA等[17]的方法，配制7 mol/L ABTS溶液，2.45 mmol/L过H2SO4溶液，等体积混合，避光静置16 h，测定OD734，用蒸馏水稀释至吸光度为0.70±0.02。加0.5 mL样品溶液于试管中，随后各加4 mL ABTS自由基溶液，避光静置30 min，测OD734。平行3次，取平均值。ABTS自由基清除率按公式(2)计算。以IC50值评价SCE的抗氧化效果。
(2)
式中：OD0，4 mL ABTS溶液+ 0.5 mL蒸馏水的吸光度; ODi，4 mL ABTS溶液+ 0.5 mL样品溶液的吸光度。
1.3.2.3 SCE总还原力的测定
参照刘长姣等[18]的方法，加2.5 mL磷酸盐缓冲液(pH 6.6，0.2 mol/L)、1.0 mL SCE(10、20、40、60、80、100 mg/mL)和2.5 mL 1%铁氰化钾溶液于离心管中，50 ℃水浴20 min。加2.5 mL体积分数为10%三氯乙酸终止液，混匀，取2.5 mL于试管中，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 1 g/L FeCl3溶液，充分振荡后静置10 min，测定反应体系的OD700。平行3次，取平均值。
1.3.3 SCE抗镰孢菌效果的测定
分别取1 mL SCE(10、100、1 000 mg/mL)和10 mL PDA培养基注入培养皿，迅速混匀。用无菌打孔器取3种鱼干优势菌(FO1、FO2、FO3)的菌饼，接种于PDA培养基的边缘，以正常PDA培养基作空白对照。将平板置于28 ℃恒温恒湿培养箱中培养8 d，测量菌落半径，平行2次，取平均值。抑菌率按照公式(3)计算：
(3)
1.3.4 红鱼干样品的制备
取4条约1 kg的鲜活红鱼，宰杀后去除腮、鳞、内脏，清洗、沥干。将鱼体质量15%(质量分数)的盐均匀涂抹于鱼表面，其中2条鱼用鱼体质量10%的SCE(1.3.1制备)涂抹，腌制8 h，于阴凉通风处干制3 d。测定鱼干常规营养成分、加工过程pH和过氧化值。
1.3.4.1 红鱼干常规营养成分、pH值和过氧化值
按GB 5009.5—2016中的凯氏定氮法测定粗蛋白含量；按GB 5009.6—2016中的索氏抽提法测定粗脂肪含量；按GB 5009.4—2016中的第一法测定灰分含量；按GB 5009.3—2016中的直接干燥法测定水分含量；按GB 5009.238—2016中的水分活度仪扩散法测定水分活度；按GB 5009.237—2016使用酸度计测定pH值；按GB 5009.227—2016中的滴定法测定过氧化值；按GB 4789.2—2016中的方法测定细菌菌落总数，按GB 4789.15—2016中的第一法测定真菌菌落总数。
1.3.5 数据分析
实验结果采用Microsoft Excel 和Origin2016统计处理和作图；SPSS统计分析软件进行差异显著性分析，显著差异由P<0.05表示；不同小写字母、“*”均表示组内或者组间差异；JMP统计学软件进行进行IC50的计算。
2.1.1 SCE对DPPH自由基的清除能力
如图1所示，随着SCE质量浓度的增加，对DPPH自由基的清除能力也增加，呈现一定的量效关系。在0.4～2 mg/mL时，其对DPPH自由基清除能力增长(P<0.05)较快；在2～4 mg/mL时，其对DPPH自由基清除能力增长(P<0.05)较慢。SCE清除DPPH自由基IC50为1.22 mg/mL。研究发现，野葛、粉葛和姜黄醇提取物清除DPPH自由基的IC50值分别为2.63、12.46和 7.78 mg/mL[19-20]，野葛、粉葛和姜黄均是公认的具有抗氧化作用的食物[21-22]，而SCE清除DPPH自由基的IC50比它们低，说明SCE清除DPPH自由基的能力较好。研究表明，五味子中主要有木脂素、多糖和挥发油等，而主要功效成分是木脂素，且木脂素含量在五味子中含量最高，最高可达质量分数8%[23-25]。后期研究使用LC-MS/MS测定本研究SCE中五味甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙和五味子酚的含量，发现5种木脂素的总量达7.86%(后续报道)，因此本研究的SCE具有明显的抗氧化能力，且其抗氧化活性可能是其中木脂素的功效。
图1 不同质量浓度五味子提取液对DPPH自由基的清除能力
Fig.1 Scavenging capacity of SCE on DPPH at different concentrations
2.1.2 SCE对ABTS自由基的清除能力
由图2可知，SCE对ABTS自由基的清除规律与DPPH的较为一致，呈现出较为显著的剂量依赖性。在0～25 mg/mL时，SCE对ABTS自由基的清除率上升(P<0.05)较快；在25～55 mg/mL时，其对ABTS自由基的清除率上升(P<0.05)较慢。SCE清除ABTS自由基的IC50是16.751 mg/mL。研究发现，藜麦富含具有显著抗氧化作用的黄酮类和酚类物质，其提取物清除ABTS自由基的IC50为27.91 mg/mL[26-27]，五味子提取液对ABTS清除率的IC50明显低于藜麦提取物，说明SCE清除ABTS自由基的能力较好，即具有较明显的抗氧化能力。
图2 不同质量浓度SCE对ABTS自由基的清除能力
Fig.2 Scavenging capacity of SCE on ABTS at different concentrations
2.1.3 SCE总还原力的测定
由图3可知，SCE质量浓度在0～100 mg/mL范围内，随着质量浓度增加，吸光度增加，表明还原力增强，抗氧化能力提高。这与李振等[28]对五味子提取物的体外抗氧化作用研究结果相一致，说明SCE具有一定的抗氧化效果。
图3 不同质量浓度SCE的总还原力
Fig.3 Total reducing power of SCE at different concentrations
由图4可知，SCE对3种镰孢菌均有明显的抑菌效果，随着SCE质量浓度增加，其对3种镰孢菌的抑菌率也显著(P<0.05)提高，呈现出显著的剂量依赖性。当SCE质量浓度为1 000 mg/mL时,抑菌效果十分明显，对FO1、FO2和FO3的抑制率分别高达91.67%、81.08%和88.24%。研究发现，南五味子提取物对金黄色葡萄球菌等8种食品常见腐败菌具有抑菌活性，且对蜡样芽孢杆菌的抑菌能力大于常用化学防腐剂[29]；而五味子中主要的抑菌成分有木脂素、挥发油和多糖，而木脂素的含量最高[30]。因此本研究的SCE对优势镰孢菌和常见的腐败菌均具有明显的抑菌效果，且其抑菌效果可能主要是由于其中的木脂素。
图4 不同质量浓度SCE对鱼干优势镰孢菌的抑菌效果
Fig.4 Antibacterial effects of SCE at different concentrations on dominant Fusarium from dried fish
2.3.1 SCE对红鱼干常规营养成分的影响
由表1可知，SCE组红鱼干蛋白质、脂肪、灰分、水分含量和水分活度等营养指标与CK组无明显差别，说明SCE对红鱼的基本营养成分影响不大，不会对红鱼品质造成不良影响。
表1 SCE对红鱼干加工第3天常规营养成分的影响
Table 1 Effects of SCE on conventional nutrients of dried Lutjanus sanguinaus on the 3rd day of processing
分组蛋白质/%脂肪/%灰分/%水分/%水分活度(Aw)CK组24.33±1.083.73±0.896.36±0.5762.09±1.020.9346±0.0064SCE组23.19±1.043.82±0.885.06±0.5961.64±0.900.9559±0.01
注：CK组，只添加鱼体质量15%(质量分数)的食盐腌制的红鱼；SCE组，添加鱼体质量15%(质量分数)食盐和10%五味子提取液腌制的红鱼
2.3.2 SCE对红鱼加工过程pH的影响
由图5可知，CK组红鱼在腌制过程中pH呈现先下降后上升的趋势，但是它们之间并没有显著性差异(P>0.05)。初期pH下降可能是鱼肉样品中CO2溶解，同时产生乳酸、H3PO4，pH的升高可能由于腐败微生物基础代谢引起的碱性挥发性胺类和自溶产生的挥发性基质[31]。在2～8 h内，SCE组红鱼的pH明显低于CK组(P<0.05)，这是由于五味子提取液的酸性影响。在8～72 h内，随着干制时间增加，SCE组红鱼的pH显著下降(P<0.05)，无上升趋势，这可能是由于五味子的抑菌成分抑制了微生物的生长代谢。
图5 SCE对红鱼干加工过程pH的影响
Fig.5 Effects of SCE on pH of dried Lutjanus sanguinaus during processing
2.3.3 SCE对红鱼加工过程过氧化值的影响
由图6可知，干燥0～3 d内，CK组的过氧化值不断升高，第3天时，过氧化值达到最大值(0.23 g/100 g)。在1～3 d内，相对于CK组，SCE组的过氧化值显著下降(P<0.05)，而且SCE组的过氧化值也远低于GB 10136—2015中规定的4 g/100 g，说明SCE在红鱼干加工过程中具有抗氧化作用，在一定程度上能防止红鱼干在加工中发生脂肪过度氧化。
图6 SCE对红鱼干加工过程过氧化值的影响
Fig.6 Effects of SCE on peroxide value of dried Lutjanus sanguinaus during processing
2.3.4 SCE对红鱼干微生物含量的影响
由图7可知，CK组的细菌和真菌菌落总数分别为3.44 lg(CFU/g)和1.74 lg(CFU/g)，SCE组红鱼干的细菌和真菌菌落总数分别为2.45 lg(CFU/g)和1.40 lg(CFU/g)，SCE组的细菌和真菌菌落总数均显著(P<0.05)低于CK组。研究表明五味子乙醇提取物在面制食品的贮存中具有明显的抑菌活性[11]，而本研究的红鱼干在加工第3天，SCE也表现出明显的抑菌活性，说明SCE在红鱼干加工过程中具有明显的抗菌效果。
图7 SCE对红鱼干加工第3天微生物含量的影响
Fig.7 Effects of SCE on microbial count of dried Lutjanus sanguinaus on the 3rd day during processing
本文通过制备SCE,测定其抗氧化和抗鱼干优势镰孢菌能力，并将SCE应用于红鱼干的加工。结果表明，SCE具有明显(P<0.05)的抗氧化和抗鱼干优势镰孢菌效果，对DPPH自由基和ABTS自由基具有较强的清除能力(IC50分别为1.216和16.75 mg/mL)，总还原能力较强,均在一定质量浓度范围内呈现剂量依赖性。将SCE应用于红鱼干的加工中，SCE有利于保持红鱼加工过程中的常规营养成分，能显著(P<0.05)降低红鱼干加工过程的pH值、过氧化值和微生物含量，说明SCE在红鱼干加工过程中具有明显的抗氧化和抗菌效果。因此，SCE是一种优良的天然抗氧化剂和抑菌剂，具有开发成安全高效的天然防霉防腐剂的潜力。本实验为将SCE的抗氧化和抑菌作用应用于红鱼干的保藏研究提供一定的理论基础。
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