维生素D是固醇类衍生物，主要包括维生素D2(麦角钙化醇)和维生素D3(胆钙化醇)，对哺乳动物具有促进钙磷代谢，抗佝偻病的作用[1-2]，但维生素D摄入过大，也会引起高钙血症。因此在婴幼儿配方奶粉、米粉中，维生素D的添加量需要在一合理的范围内。但维生素D化学性质不稳定，温度、光照等条件的变化会导致其氧化分解，在婴幼儿配方奶粉、米粉等基质中干扰物质较多，维生素D是经包埋后再添加到食品基质中，因此对其准确定量具有较大难度。传统的分析方法需要皂化破壁、有机溶剂萃取、浓缩、色谱净化、正相分离、质谱检测等较多步骤，操作过程较为繁琐、耗时久，回收率不稳定，导致测定结果重现性不好[3]。
二维液相色谱具有峰容量大、自动化程度高、能够显著降低复杂样品的基质效应等特点，已成为生物复杂样品的高效分离分析手段，在食品和药物分析中已得到广泛的应用[4-12]。张艳海等[13-16]、林玉宙等[3]、戚绿叶等[17-20]采用在线二维液相色谱法同时测定婴幼儿和成人配方营养品中的维生素A、D3和E，已得到较好的应用，但在进入二维色谱之前需要将皂化液与石油醚进行液液萃取，还需要将有机溶剂进行浓缩后才能分析，前处理较为麻烦。本文采用在线固相萃取结合二维色谱快速测定婴幼儿配方奶粉、米粉中的维生素D，简化了前处理的操作步骤，提高了方法的准确性和样品的处理效率。
1 实验部分
1.1 仪器、试剂和材料
Agilent 1260液相色谱仪，配置SPE泵、一维泵、二维泵、自动进样器、紫外检测器、DAD检测器(配大流通池)、柱温箱、2个六通阀。SPE柱，一维色谱柱：Aglient Poroshell 120 EC-C8(4.6 mm×100 mm，4 μm)，二维色谱柱：Aglient Eclipse PAH(2.1 mm×100 mm，3.5 μm)。磁力搅拌器，上海硕光电子科技有限公司。
维生素D2、维生素D3：纯度>98%，Dr.Ehrenstorfer。KOH、95%乙醇、抗坏血酸、BHT均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、乙腈、甲醇均为色谱纯，美国Fisher公司；去离子水(18.2 MΩ·cm),Mil-lipore 纯水机制得。
1.2 样品预处理
奶粉样品：称取5 g样品于250 mL圆底烧瓶中，加入10 mL温水，涡旋1 min，使样品充分溶解，加入1 g抗坏血酸、0.1 g BHT，25 mL无水乙醇和5 mL 500 g/L KOH水溶液，80 ℃皂化30 min，冷却后，转移至50 mL容量瓶中，用体积分数为50%乙醇水溶液定容。过0.22 μm滤膜后待测。
米粉样品：称取5 g样品于250 mL圆底烧瓶中，加入10 mL温水，涡旋1 min，加入0.5 g淀粉酶，60 ℃酶解30 min，余下步骤参照奶粉样品操作。
1.3 标准溶液配制
准确称取适量维生素 D2、D3标准品，以无水乙醇溶解并定容至25 mL，使其质量浓度约为100 μg/mL，临用前，参照GB 5009.82—2016[21]方法对储备液进行校正，分别吸取1 mL维生素 D2、D3标准储备液至100 mL棕色容量瓶中，以无水乙醇定容至刻度，混匀。分别用1 cm石英比色皿，以无水乙醇为空白参比，在264 nm波长下测定其吸光度(A)，按公式(1)计算其校正后的浓度(X)，维生素D2、D3的1%比色光系数E分别485和462。
(1)
取上述校准后标准品储备溶液适量，分别加体积分数为50%乙醇水溶液进行稀释，制成各标准工作溶液: 0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.20 μg/mL。
1.4 仪器条件
柱温30 ℃, 进样量100 μL。SPE泵流动相：A为水B为乙醇，一维分析泵的流动相: A为水,B为乙腈;流速为1.50 mL/min二维分析泵的流动相: A 为乙腈，B为甲醇，流速为0.40 mL/min; 检测波长: 264 nm; 系统管路如图1所示。梯度洗脱程序见表1,阀切换时间见表2。
图1 在线固相萃取二维柱切换系统流路示意图
Fig.1 Flow scheme of fully-automated online two-dimensional column switching system
2 结果与讨论
2.1 色谱条件的优化
应用二维色谱测定乳制品中的脂溶性维生素已得到一定的应用[2-3,13-20]，其关键技术在于系统流路的构建和色谱条件的确定。林玉宙等[3]、张艳海等[13-16]、戚绿叶等[17-18]均采用二维液相色谱分离的中心切割法，通过一维色谱柱实现初步分离后，将含有维生素D的馏出物切割至二维色谱柱中进行进一步分离，达到净化的目的，为本文系统流路的构建和色谱条件的确定提供了参考。但其方法样品溶液在进入二维色谱之前需要先将皂化液与石油醚进行液液萃取，萃取后还需经水洗除杂、脱水、浓缩、定容等步骤才能分析，前处理较为繁琐，不便于批量操作，有一定的局限性。
表1 SPE、一维系统、二维系统洗脱程序
Table 1 Gradient programs of the SPE, 1D and 2D separation
SPE洗脱程序一维分离洗脱程序一维分离洗脱程序时间/minA/%B/%流速/(mL·min-1)时间/minA/%B/%时间/minA/%B/%0.0060401.000.0050500.0001004.0060400.202.0020806.00010020.0060401.006.0020808.00901016.00010022.00901019.00010019.105050
表2 阀切换时间和位置
Table 2 Valve switching time and positions
切换时间/min阀1阀2说明0.001～61～6阀1:淋洗SPE柱,去除杂质,淋洗液废液排出;阀2:流出液进入1维色谱检测器4.001～21～6阀1:洗脱液进入一维色谱柱;阀2:流出液进入1维色谱检测器11.351～21～2阀1:洗脱液进入一维色谱柱;阀2:流出液进入2维色谱色谱柱11.901～21～6阀1:洗脱液进入一维色谱柱;阀2:流出液进入1维色谱检测器20.001～61～6阀1:平衡SPESPE柱;阀2:流出液进入1维色谱检测器
本文采用在线固相萃取-二维色谱测定配方奶粉、米粉中维生素D的含量。样品经过皂化定容后，可直接进样分析，样品溶液经在线SPE柱净化后，通过六通阀转入在一维色谱柱中，在一维色谱柱实现初步分离后，将维生素D的馏出物转移至二维色谱柱中进行二次分离(如图1所示)。为了提高维生素D在SPE柱上的净化效果，本文考察了甲醇、乙腈和乙醇的淋洗效果，发现甲醇和乙腈对脂溶性物质溶解性更低，洗脱能力较弱，杂质在SPE柱上保留较强，使用甲醇和乙腈作为淋洗溶剂时，在一维色谱中发现杂质更多，最终确定乙醇水作为洗脱溶剂，通过梯度洗脱，先用高水相淋洗除去皂化液中的碱液和大部分水溶性杂质，再用高有机相将目标化合物洗脱下来，通过六通阀进入一维色谱。
一维色谱分离在色谱柱规格选择上，应选择高柱效色谱柱，有助于压缩谱峰，提高分离度，使得峰宽变窄，缩短阀切换时间窗口，减少一维色谱中杂质进入二维色谱。与C18柱相比C8柱出峰更快，因此一维色谱可以选择对脂溶性物质保留更弱的C8柱，流动相选用乙腈水，可将维生素D2和维生素D3压缩成一个峰，缩短阀切换时间窗口。为了确定一维色谱准确阀切换时间，可通过进高浓度标准品溶液，先测定维生素D在一维色谱中的出峰时间，为保证样品中维生素D全部切割至第2个六通阀的捕获柱中，将时间适当调宽，本实验通过连续进样，考察了保留时间波动范围，确定了最终的切换时间窗口为11.35～11.9 min，阀切换时间和位置见表2。
通过第二个六通阀的捕获柱可以减少进入二维色谱的溶剂量，避免峰过度展宽，在二维分离体系中应考虑流动相的兼容性，以及一维分离机理和二维分离机理的差异性。因此本文二维色谱采用 Agilent Eclipse PAH(2.1 mm×100 mm,3.5 μm)色谱柱，该色谱柱以优异的分离性能在生育酚、类胡萝卜素等脂溶性物质分离中有较好的应用。并以甲醇和乙腈作为流动相可以在短时间内较好分离杂质、维生素D2和维生素D3，满足检测要求(如图2所示)。
图2 标准品和样品色谱图
Fig.2 The chromatograms of standards and samples
2.2 方法的线性范围、仪器定量限、精密度考察
分别吸取适量校准好的维生素D2和D3储备液，至10 mL棕色量瓶中，制成维生素D系列混合标准品溶液; 结果显示，维生素D2在0.002～0.20 μg/mL范围内的相关系数R为0.999 7，维生素D3在0.002～0.20 μg/mL 范围内的相关系数r为0.999 9，表明各目标物线性关系良好。按S/N=10确定维生素D2和维生素D3的定量限浓度，推算出维生素D2的定量限为0.38 μg/100 g，维生素D3的定量限为0.40 μg/100 g。均小于GB 5009.82—2016[11]第三法中维生素D的定量限(维生素D2定量限3 μg/100 g、维生素D3定量限0.6 μg/100 g)。取 0.05 μg/mL维生素D2、D3的混合标准溶液连续进样10次，计算得到维生素D2和D3峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.88%和0.92%。结果表明该方法精密度良好。
2.3 回收率
准确称取 5 g婴幼儿配方奶粉和配方米粉，分别按5.0、10、20 μg/100 g三种水平添加标准溶液，按照上述实验方法进行操作，测定维生素D2和维生素D3的含量，计算回收率。表3结果显示，维生素 D2的加标回收率为91.3%～96.3%，RSD为1.9%～3.9%; 维生素 D3的加标回收率为91.6%～97.2%，RSD为1.6%～3.1%,表明该方法回收率高、稳定性较好。
表3 样品中维生素D 的含量及其加标回收率(n=6)
Table 3 Contents and spiked recoveries of vitamin D in samples
样品添加量/[μg·(100g)-1]维生素D2维生素D3本底[μg·(100g)-1]回收率/%RSD/%本底/[μg·(100g)-1]回收率/%RSD/%5.0ND92.92.49.0891.61.6奶粉10.0ND94.23.29.0892.82.320.0ND95.62.99.0897.23.15.0ND91.33.96.2592.62.5米粉10.0ND96.32.76.2594.81.820.0ND95.11.96.2596.92.0
注：“ND”表示未检出
表4 本方法与国标检测方法样品检测结果的偏差 单位：μg/100 g
Table 4 The bias of sample test results with GB method
序号奶粉米粉本方法国标方法本方法国标方法19.699.386.876.4628.688.555.555.88310.410.54.994.6249.099.227.026.71511.410.96.356.5269.459.625.645.2678.849.037.117.34810.810.56.386.6299.459.026.246.03109.939.366.776.22
2.4 实际样品测定及与标准方法比较
分别采用本法和我国现行标准分析方法(GB 5009.82—2016第三法)对10种婴幼儿配方奶粉和米粉中维生素D含量进行测定，结果见表4，分别对2组数据进行配对t检验，进行了统计学分析，结果表明奶粉样品t计=0.560，米粉样品t计=0.381，查T检验临界值表t表(9,0.05)=2.262，P>0.05。t检验表明差异无统计学意义，表明2种方法对奶粉和米粉中维生素D的测定结果无显著性差异。
3 结论
本文建立了在线固相萃取结合二维色谱快速测定婴幼儿配方奶粉、米粉中维生素D含量的方法。样品溶液皂化后定容，无需复杂操作，通过仪器自动净化分析检测，实现配方奶粉、米粉中维生素D的快速测定。通过本方法检测得到维生素D的加标回收率为91.3%～97.2%，RSD小于5%，方法定量限为0.40 μg/100 g，满足检测要求，并通过配对t检验法与标准方法测定结果进行比较分析，测定结果无显著性差异。本方法操作简便、快速，自动化程度高，重现性好，方法回收率高，可作为配方奶粉和米粉中维生素D的测定方法推广应用。在线固相萃取结合二维色谱的预处理模式净化效果好，操作简单，也可以为复杂基质中维生素B12、泛酸、生物素等其他低含量维生素的测定提供一种新的思路。
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