在日常膳食中，人们会因过量摄入食物而导致血清中胆固醇含量异常，进而增大心脑血管疾病的患病率[1]。乳酸菌具有降胆固醇的功能特性[2-4]，其中乳酸菌所产的胆盐水解酶(bile salt hydrolase, BSH)在降解机制中发挥着至关重要的作用[5]。BSH能水解胃肠道中的结合态胆盐(甘氨胆酸盐)，将其转变成氨基酸和游离态胆酸，游离态胆酸能与胆固醇共同沉淀，以粪便的形式排出体外，从而降低血清中的胆固醇含量[6]。此现象亦称“共沉淀现象”[7]，是目前较认可的降解机制[8-9]。
本试验对产BSH的乳酸菌进行筛选与鉴定，以BSH酶解甘胆酸钠后的甘氨酸生成量作为BSH活性判定指标，旨在研究产BSH的乳酸菌在不同条件下产BSH酶的活性及氨基酸生成量的变化规律，为进一步优化BSH水解反应条件和深入探讨乳酸菌降解胆固醇机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鲜牛奶，湖南省畜牧场牛奶贮藏罐；植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum WCFS1)，湖南农业大学食品科技学院实验室提供。
1.1.1 试剂
MRS肉汤固(液)体培养基，广东环凯微生物科技有限公司；牛胆酸钠，北京索莱宝科技有限公司；甘胆酸钠，上海麦克林生化科技有限公司；脱脂奶粉，澳优乳业股份有限公司；CaCO3、NaOH、HCl、NaCl、葡萄糖、柠檬酸、柠檬酸三钠、甘油、茚三酮、乙醇、甘氨酸、三氯乙酸(分析纯试剂)，国药集团化学试剂有限公司；革兰氏染色液，广东环凯微生物科技有限公司。
茚三酮显色液：12.5 mL 10 g/L茚三酮柠檬酸溶液(称取0.5 g茚三酮溶解于50 mL pH 5 0.5 mol/L柠檬酸盐缓冲液中)+32.5 mL体积分数30%甘油+5 mL 0.5 mol/L柠檬酸盐缓冲液
1.2 仪器与设备
HX-20G恒温金属浴锅，上海泸析实业有限公司；HH-601超级恒温水浴，常州市万丰仪器制造有限公司；Bante920 pH计，上海般特仪器制造有限公司；XW-80A漩涡混匀仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；1510全波长酶标仪，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；TG16-WS台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；BH-2光学显微镜，日本Olympus公司。
1.3 实验方法
1.3.1 乳酸菌的分离与纯化
取25 mL牛奶置于盛有225 mL无菌生理盐水的锥形瓶中(瓶中预置适量的无菌玻璃珠)，充分混匀得10-1的样品匀液，再稀释成10-2、10-3、10-4的样品。分别吸取稀释液0.1 mL于含10 g/L CaCO3的MRS固体培养基平板上，涂布分离，37 ℃下培养24～48 h[10]。乳酸菌代谢产生的乳酸可溶解CaCO3，在培养基上形成透明的溶钙圈[11]，挑取有明显溶钙圈，且革兰氏染色为阳性的菌落，于MRS固体培养基上3代划线纯化后，编号并保存备用。
1.3.2 产胆盐水解酶菌株的筛选
依据乳酸菌降胆固醇的机理[7]：乳酸菌产生的BSH使胆盐共轭活性增强，将结合态胆盐水解为游离态胆酸，游离态胆酸与胆固醇共同沉淀。若菌株能够产BSH，则菌落在含胆盐培养基中形成乳白色沉淀圈。
将分离纯化得到的乳酸菌接种于MRS液体培养基中活化2代，参照王玉文等[12]的牛津杯法将菌悬液接种至含3 g/L牛磺胆盐的MRS固体培养基上，接种量为0.15 mL，37 ℃培养72 h后，观察菌落周围是否出现乳白色沉淀圈。挑取沉淀，于蒸馏水中完全溶解，旋涡振荡后滴加茚三酮显色液，溶液变蓝紫色则初步确认存在胆盐水解酶[13]。
植物乳杆菌WCFS1含4个胆盐水解酶活性基因[14]，具有高胆盐水解酶活性，因此以WCFS1作为阳性对照菌株，在筛选及不同条件下BSH的活性测定的试验中作参比对照。
1.3.3 菌株N1、N12的细胞形态观察及分子生物学鉴定
对N1和N12进行革兰氏染色，并在光学显微镜下观察细胞形态。参照吴诗敏等[15]的分子生物学鉴定方法，将液体培养基中的菌株纯化得到PCR产物，随即送至上海生工生物工程有限公司进行测序并构建系统发育树。
1.3.4 不同条件下胆盐水解酶的活性测定
BSH是一类由肠道微生物合成的胞内酶，能水解结合型胆盐从而增强菌体对胆盐毒性的抵御能力，延长菌体在肠道中的生存时间[16]。BSH特异性识别底物甘胆酸钠，将其水解生成甘氨酸，试验中以测定甘氨酸的生成量为判定BSH水解活性的指标。甘氨酸与茚三酮作用生成蓝紫色物质[17]，记录其在570 nm处的吸光值。
1.3.4.1 酶活力的测定及标准曲线的绘制
参照姜金康[18]测定酶活力的部分方法作修改。将培养24 h的发酵液、空白组加入体积分数15%三氯乙酸，添加量为体积分数为30%，混匀静置15 min，8 000 r/min离心10 min，吸取1 mL上清液，加入0.5 mL茚三酮显色液，旋涡振荡，密封沸水浴15 min，迅速冰浴3 min，再加入0.5 mL体积分数95%的乙醇，混匀静置5 min后测定在570 nm处的吸光度。
配制1 mmol/L甘氨酸标准溶液，准确吸取上述溶液0、200、400、600、800、1 000 μL至离心管中，用蒸馏水补足体积为1 mL，再分别加入0.5 mL显色液，旋涡振荡后密封沸水浴15 min，迅速冰浴冷却3 min，加入0.5 mL体积分数95%的乙醇混匀，静置5 min，在570 nm下测定吸光度。以吸光度为纵坐标，甘氨酸标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。
1.3.4.2 pH对胆盐水解酶活性的影响
制备7组不同pH的脱脂牛奶培养基(含3 g/L甘氨胆酸钠的12%脱脂牛奶)，用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH将每组培养基pH调节至1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0，N1、N12、WCFS1活化2代后，以10%接种于上述培养基中。每组设置空白对照，于37 ℃培养24 h，测定胆盐水解酶的活性。
1.3.4.3 紫外照射时间对胆盐水解酶活性的影响
N1、N12、WCFS1活化2代后，以10%接种于脱脂牛奶培养基(含3 g/L甘氨胆酸钠的体积分数12%脱脂牛奶)中，并分为7组。紫外光(30 W)照射上述培养基0、5、10、15、20、25、30 min，每组设置空白对照，于37 ℃培养24 h，测定胆盐水解酶活性。
1.3.4.4 温度对胆盐水解酶活性的影响
活化2代后的N1、N12、WCFS1以10%接种于脱脂牛奶培养基(含3 g/L甘氨胆酸钠的12%脱脂牛奶)中，制备5组实验组于26、37、48、59、70℃下处理30 min，每组设置空白对照，于37 ℃培养24 h，测定胆盐水解酶活性。
1.3.4.5 糖浓度对胆盐水解酶活性的影响
制备7组不同葡萄糖浓度的脱脂牛奶培养基(含3 g/L甘氨胆酸钠的12%脱脂牛奶)，葡萄糖添加量为：1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%。N1、N12、WCFS1活化2代后，以10%接种于以上7组中。每组设置空白对照，于37 ℃培养24 h，测定胆盐水解酶活性。
1.3.4.6 盐浓度胆盐水解酶活性的影响
制备7组脱脂牛奶培养基(含3 g/L甘氨胆酸钠的12%脱脂牛奶)，NaCl添加量为：1%、4%、7%、10%、13%、16%、19%，N1、N12、WCFS1活化2代后，以10%接种于上述培养基中。每组设置空白对照，于37 ℃培养24 h，测定胆盐水解酶活性。
2 结果与分析
2.1 乳酸菌分离与纯化的结果
从湖南省畜牧场牛奶中分离得到27株乳酸菌，分离纯化后按照挑选顺序编号为N1～N27，用40%甘油于-20 ℃冷冻保藏。
2.2 产胆盐水解酶菌株的筛选
27株乳酸菌中仅有2株产BSH，为菌株N1和N12。图1是3株菌(包含阳性对照菌WCFS1)在含牛磺胆盐的培养基上呈现的乳白色沉淀圈，且3株菌刮下的沉淀溶于蒸馏水后滴加茚三酮显色剂，均呈蓝紫色。
图1 沉淀圈现象
Fig.1 Sediment circle phenomenon
2.3 菌株N1、N12的细胞形态观察与分子生物学鉴定
由图2可知，菌株N1、N12细胞均成杆状或圆柱形，菌体有平直状、弯曲状，细胞两端呈弧状，单生、成对、成链排列，无芽孢，革兰氏染色结果为阳性。因此，初步判定2株菌为乳杆菌属(Lactobacillus)。
图2 菌株N1和N12的细胞形态
Fig.2 Cell morphology of strain N1 and N12
经测序获得菌株N1、N12的16S rRNA 基因序列，基因序列大小分别为1 449、1 437 bp。测序结果通过BLAST序列对比后，构建菌种系统发育树，如图3所示。N1、N12与L.plantarum MG5204、L.plantarum TSGB1272聚于一支。因此，菌株N1和N12为植物乳杆菌(L.plantarum)，结合菌株细胞形态的观察而进一步确认2株菌均为植物乳杆菌(L.plantarum)。
图3 基于16S rDNA基因序列菌株N1和N12的系统发育树
Fig.3 Phylogenetic tree of strain N1 and N12 based on 16S rDNA gene sequences
2.4 不同条件下胆盐水解酶的活性测定
2.4.1 甘氨酸标准曲线的绘制
甘氨酸含量测定标准曲线方程为y=2.685 5x-0.497 5，R2=0.999 2，其中x代表甘氨酸浓度，y代表在570 nm下的吸光值。
2.4.2 pH对胆盐水解酶活性的影响
为了探究pH对BSH活性影响，本试验对N1和N12的BSH酶解后的生成物含量(甘氨酸)进行分析，结果如图4所示。
图4 pH对酶活性的影响
Fig.4 Effect of pH on enzyme activity
3株菌(N1、N12和WCFS1)培养上清液中的甘氨酸含量随着pH值的上升，先增加后减少，则胆盐水解酶的活性随pH值的增加呈现先增高后降低的变化趋势。N1、N12和WCFS1的酶活性变化趋势符合，均在pH为7.0时，其酶活性最强，当pH超过7.0时，酶活性受到抑制作用。同时，pH对胆盐水解酶活性有极显著影响(P<0.01)，分析以上现象，在培养环境过酸、过碱时，会导致BSH化学变性而引起空间结构的改变，可能影响与底物结合的活性位点，导致水解效率降低。
2.4.3 紫外照射时间对胆盐水解酶活性的影响
菌株经不同紫外照射时间处理后的BSH活性变化趋势如图5所示。
图5 紫外照射时间对酶活性影响
Fig.5 Effect of UV irradiation time on enzyme activity
紫外照射时间与上清液甘氨酸浓度不成线性关系，随时间的延长，甘氨酸浓度波动无规律。N12与WCFS1经一定时间的紫外照射后，其水解生成的甘氨酸浓度较低，均低于在相同处理条件下N1的甘氨酸生成量，因此猜测N1菌株对紫外的耐性比N12、WCFS1强。由此现象可知，3株菌在紫外照射30 min内，其酶活性紊乱不定，水解生成的甘氨酸浓度呈波动变化，无法判断此条件对酶活力是否产生明显的促进作用或抑制作用。
2.4.4 温度对胆盐水解酶活性的影响
菌株经不同温度处理后的BSH活性变化趋势如图6所示。
图6 温度对酶活性影响
Fig.6 Effect of temperature on enzyme activity
N1、N12和WCFS1的酶活性随短时温度处理的度数增加，呈现先增强后减弱的变化趋势，3株菌均在59 ℃下处理30 min后，其水解生成的甘氨酸浓度最大，胆盐水解酶活性最强，耐热性能良好，但在70 ℃下处理30 min后，菌种几乎失活无法经过后期培养产生胆盐水解酶，且结果显示温度处理对胆盐水解酶活性有极显著影响(P<0.01)。此项试验意在探究短时温度处理能否起到激活酶活性的作用，分析此现象，菌种均在试验温度下处理30 min后于37 ℃培养24 h，并未在试验温度下直接培养24 h，因此猜测酶的空间结构并未全部破坏，短时间的高热处理，甚至可能使酶在保证原有活性的基础上暴露更多的酶活性位点，以提高酶水解能力。
2.4.5 葡萄糖浓度对胆盐水解酶活性的影响
菌株在不同糖浓度环境下培养后，其BSH活性变化趋势如图7所示。
图7 葡萄糖添加量对酶活性影响
Fig.7 Effect of glucose addition on enzyme activity
葡萄糖作为培养基中的重要碳源，碳源直接影响菌体的生长与代谢及水解酶的合成与作用。添加量过少，菌体生长缓慢导致水解酶合成量受限，添加量过多产生阻遏作用，抑制水解酶的合成。结果显示，随葡萄糖浓度的逐增，3株菌生成的甘氨酸先增后减，N12在葡萄糖重量百分比浓度为5%时，酶活性已达峰值，而N1与WCFS1峰值在浓度增至10%才出现峰值，N12糖浓度的耐受力弱于N1。当浓度由10%增至15%时，酶活性骤减，此后再增大糖浓度对酶活性的影响甚微。根据统计，糖添加量对BSH活性有极显著影响(P<0.01)，其葡萄糖质量百分比浓度在5～10%范围内，BSH持有较高酶活力。
2.4.6 NaCl浓度胆盐水解酶活性的影响
菌株在不同盐浓度环境下培养后，其BSH活性变化趋势如图8所示。
图8 NaCl添加量对酶活性影响
Fig.8 Effect of sodium chloride addition on enzyme activity
NaCl可调节细胞内外渗透压，在等渗环境下菌株正常生长，高渗环境下菌株失水抑制其生长。结果显示，甘氨酸浓度随NaCl量的增加呈先增后减的趋势。N12在NaCl质量分数为4%时，酶活力最强，此后活力骤减再趋于平稳，N1的耐盐能力强于N12，当质量分数增至7%时，酶活力最强，NaCl质量在7%～13%，酶活性骤减。根据统计，盐添加量对BSH活性有极显著影响(P<0.01)。
3 讨论与结论
本研究从生鲜牛奶中共计分离乳酸菌27株，其中产胆盐水解酶的乳酸菌共计2株，分别为N1、N12。通过细胞形态观察和分子生物学技术，N1与N12被鉴定为植物乳杆菌(L.plantaruma)。N1、N12与植物乳杆菌Lp529[18]的BSH活性相比，后者较强，但N1、N12的BSH活性又强于植物乳杆菌KLDS6.0330[19]。
根据单因素多水平试验，0～30 min的紫外照射处理对BSH活性影响甚微，不构成变化规律。但pH、温度、糖盐添加量对BSH活性有极显著影响，从而确定了N1、N12保持BSH高活性的最适pH为7，最适温度为59 ℃。其中N1的最适糖添加量为10%，最适盐添加量7%。N12对糖、盐的耐受力不及N1，其最适糖质量百分数为5%，最适盐质量百分数为4%。这与李婷婷等[20]研究的屎肠球菌90-1的胆盐水解酶的最适反应温度(37 ℃)与最适反应pH(6.0)均不一致，可能因为李婷婷的试验中仅仅在单因素条件下处理30 min，并未继续培养24 h，导致出现的菌种水解活性差异性较大，以及菌种之间的差异性导致结果不同。惠明等[21]研究发现BSH活性与还原糖的消耗速率有关，酶活性与消耗速率呈正相关，因此本试验中确定了菌株N1、N12最适的糖质量百分比浓度。要将此类乳酸菌开发应用于食品工业中并发挥良好降解胆固醇能力，食盐乃为食品工艺中最重要的调味品，其添加量过大对乳酸菌的抑制明显[22]，添加量过小影响食品风味与质构，因此确定了N1、N12的最佳盐质量百分比浓度，为后续的投入生产提供可靠的理论基础。不同的培养条件对乳酸菌降解胆固醇的效率影响显著[23]，对菌株N1和N12的培养条件等进行深入研究，为2株菌后续应用工业化生产奠定基础。
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