镇江香醋以其“色、香、酸、醇、浓”等特点，深受国内外消费者的青睐。陈酿是食醋生产的关键步骤，直接影响其风味物质的改变。镇江香醋通常会放置在有阳光、通风好的地方，经陶坛密封陈酿，在陈酿过程中受贮存环境的影响，发生一系列的物理化学变化，其风味特征也会产生不同程度的改变[1-4]。并且，国外发酵食品的研究中也明确了温度、氧气等环境因素对风味品质有明显的影响[5-6]。
在陈酿过程中温度和氧气是影响食醋风味品质的2个重要因素，然而，目前对于镇江香醋陈酿风味特征的研究中，关于贮存环境影响的研究较少。因此，本实验通过对食醋的模拟陈酿，采用固相萃取(solid-phase extraction, SPE)和顶空-顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction, HS-SPME)法结合气相色谱-质谱联用仪(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)对不同温度和氧气条件下食醋样品中挥发性风味物质进行检测，并通过主成分分析(principal component analysis, PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA)等多元统计分析方法[7-8]进行综合分析，明确温度和氧气对风味物质的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
食醋样品：由镇江恒顺醋业有限公司提供。
主要试剂：香气物质标准品(色谱纯)，百灵威试剂公司；C5-C30正构烷烃，Sigma-Aldrich(中国上海)公司；LiChrolutEN固相萃取小柱，德国Merck公司。
1.2 仪器与设备
恒温培养箱，上海森信实验仪器有限公司；超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；Thermo Fisher TRACE 1300气相色谱仪，配有 ISQ 质谱检测器，美国赛默飞世尔科技有限公司；2cm 50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头，美国Supelco公司；DF-101KS集热式恒温加热磁力搅拌器，郑州恒岩仪器有限公司；氮吹仪，上海安谱公司。
1.3 实验方法
1.3.1 模拟陈酿处理方法
温度影响：采用预先灭菌处理的50 mL样品瓶作为贮存容器，装样量35 mL。分别取15个食醋样品放置在25、40和55 ℃的恒温培养箱中，模拟陈酿5个月。所有样品不进行充氧操作，每组3个平行。
氧气影响：食醋样品在超净工作台中温和充氧30 s，使样品瓶剩余空间尽可能全部充满氧气，充氧方式是采用氧气罐，通过减压阀减压充氧。充氧处理共分3组：不充氧、每月充氧和半月充氧，每组15个食醋样品，全部放置在40 ℃条件下。每隔1个月进行取样检测分析。
1.3.2 预处理方法
SPE：根据文献[9]的报道方法略加改动。将食醋样品用超纯水稀释5倍，分别取10 mL稀释样品加入20 μL内标(4-甲基-2-戊醇乙醇溶液4.536 g/L)，过0.22 μm水系膜，样品通过LiChrolut-EN SPE小柱(小柱预先活化：5 mL二氯甲烷、5 mL甲醇和5 mL超纯水依次淋洗)后用5 mL超纯水冲洗小柱，减压干燥后使用10 mL二氯甲烷萃取洗脱，无水Na2SO4干燥，最后有机相通过氮吹浓缩至1 mL。
HS-SPME：根据文献[10]的报道方法略加改动。取5 mL醋样，2 g NaCl以及50 μL内标(4-甲基-2-戊醇乙醇溶液0.453 6 g/L)加入到15 mL顶空瓶中，密封在60 ℃的恒温水浴锅中加热(平衡10 min，吸附40 min)。
1.3.3 仪器分析方法
GC条件：DB-WAX色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度250 ℃，不分流进样；升温程序为40 ℃保持2 min，以4 ℃/min升温至240 ℃保持10 min；载气为氦气(>99.999%)，流速1.0 mL/min。
MS条件：电离方式EI；传输线温度和离子源温度分别为240、280 ℃；质量数扫描范围33～350 amu。
此外，采用SPE前处理方法，溶剂延迟时间4.5 min，进样量1 μL；采用HS-SPME前处理方法，进样口250 ℃下解析6 min。
1.3.4 标准曲线绘制
SPE-GC-MS：准确称取一定质量的各香气物质标准品加入到二氯甲烷溶液中配置得到一系列不同浓度梯度的混合标准溶液，将标准溶液进行GC-MS分析，根据目标物与内标物的浓度及响应比绘制标准曲线。
HS-SPME-GC-MS：将食醋中的还原糖和氨基酸的含量按照一定比例配制食醋模拟液，还原糖以葡萄糖计[11-12]。将含有不同浓度混合标准品的食醋模拟液进行GC-MS分析，绘制标准曲线。
1.3.5 定性定量分析
挥发性风味物质定性基于质谱鉴定、香气物质与标准品保留时间比对和保留指数与文献中保留指数比对。采用外标标准曲线法对风味物质进行定量。
1.4 数据分析
采用Microsoft Office Excel 2016、Origin Pro 9.0、GraphPad Prism 8.0、R 3.5.2以及SIMCA 14.1软件等进行数据处理和分析。
2 结果与分析
2.1 食醋样品中挥发性风味物质的组成及不同温度和氧气对其影响
在食醋样品中共鉴定了66种挥发性风味物质，包括酸类、醇类、酯类、醛酮类、酚类、含硫类以及杂环类化合物。由图1可知，温度和氧气对风味物质有明显的影响，大多数风味物质同时受温度和氧气的作用，温度越高，溶氧量越大(半月充氧)，其含量变化越明显。
A-温度；B-氧气；1M-1个月；5M-5个月
图1 不同温度、氧气条件下食醋挥发性风味物质含量热图
Fig.1 Heatmap of volatile flavor compounds in vinegar samples under different temperature and oxygen storage condition
2.1.1 温度对镇江香醋挥发性风味物质的影响
图2表明，温度对酸类和醇类总量的影响较小，而酯类和醛类物质总量受温度影响较显著，温度由25 ℃升高到40 ℃，酯类物质总量明显减少，这可能是由于高温加速酯类物质的水解。而高温对醛类物质生成有促进作用，可能与美拉德反应和醇类物质的氧化有关[13]。此外，温度对酮类和杂环类物质的总量影响较大(未显示)，随着温度的升高，酮类物质总量有明显的降低，而杂环类物质总量显著增加，杂环类物质主要是美拉德反应产生，温度有利于美拉德反应的进行[14]。
A-酸类；B-醇类；C-酯类；D-醛类
图2 不同温度条件下食醋各类挥发性风味物质总量的变化
Fig.2 Changes of volatile flavor compounds in vinegar samples under different temperature
注：不同字母表示同组样品之间的显著性差异(P<0.05)
随着温度的升高，短链脂肪酸如丙酸、丁酸、异丁酸等含量增加，而中长链脂肪酸如己酸、辛酸等趋于降低，在葡萄酒研究中也有类似结论[15]。苯乙醇、乙酸乙酯、异丁醛和异戊醛等在高温条件下含量明显高于低温条件下的含量，说明温度对它们的生成有促进作用。3-羟基-2-丁酮是含量最高的风味物质，受温度影响显著(图3-A)。图3-B表明，高温能明显促进愈创木酚的生成。吡嗪类物质广泛存在于加热的食品饮料中，如咖啡[16]，白酒[17]等。2,3,5,6-四甲基吡嗪受温度影响较大(图3-C)，温度升高能促进其含量增加，在食醋中3-羟基-2-丁酮和铵盐通常被认为是2,3,5,6-四甲基吡嗪的前体物质[18]。葫芦巴内酯，具有“焦糖香”的香气特征，被认为是多种酒精饮料的关键香气物质[19-20]，在食醋中首次被检测定量，高温有利于葫芦巴内酯的产生(图3-D)。
A-3-羟基-2-丁酮；B-愈创木酚；C-2,3,5,6-四甲基吡嗪；D-葫芦巴内酯
图3 不同温度条件下食醋挥发性风味物质变化
Fig.3 Changes of key volatile flavor compounds in vinegar samples under different temperature
2.1.2 氧气对镇江香醋挥发性风味物质的影响
镇江香醋在陈酿过程中受氧气因素的影响，半月充氧是加大充氧频率，增加样品中溶解氧含量，进而增强氧气影响效果。如图4所示，氧气促进酸类和醛类物质总量的增加，而醇类和酯类物质总量受影响较小。此外，杂环类物质总量随溶氧量的增大而增加，而含硫类物质总量变化相反。含硫化合物可以通过美拉德反应中含硫氨基酸的Strecker降解或微生物发酵产生[21]，具有极低的香气阈值和独特的香气特征，在食醋中也被鉴定为重要的香气类别[22]。
A-酸类；B-醇类；C-酯类；D-醛类
图4 不同氧气条件下食醋各类挥发性风味物质总量的变化
Fig.4 Changes of volatile flavor compounds in vinegar samples under different oxygen storage conditions
由图5可知，氧气促进2,3-丁二酮的生成，由于其香气特征突出，2,3-丁二酮被鉴定为食醋中重要的香气组分[23]。含硫化合物中，3-甲硫基丙醇随着溶氧量的增加含量明显减低。2,3,5,6-四甲基吡嗪以及葫芦巴内酯等不仅受温度的影响，氧气也是重要影响因素。此外，异丁醛和异戊醛是主要的两种醛类物质，氧气有利于它们的产生，在黄酒风味特征的研究中也有类似的发现[4]。
A-2,3-丁二酮；B-3-甲硫基丙醇；C-2,3,5,6-四甲基吡嗪；D-葫芦巴内酯
图5 不同氧气条件下食醋挥发性风味物质变化
Fig.5 Changes of key volatile flavor compounds in vinegar samples under different oxygen storage conditions
2.2 基于多元统计方法分析温度和氧气对镇江香醋挥发性风味物质的影响
2.2.1 基于PCA和OPLS-DA分析温度对挥发性风味物质的影响
对不同温度条件下食醋样品结果进行PCA分析，提取3个主成分，累计贡献率68.7%，基本可以代表样品的整体信息。PCA结果表明(图6-A)，55 ℃与25、40 ℃条件下的样品有明显的区分。
A1-异戊醇；A2-苯甲醇；A3-苯乙醇；A4-2,3-丁二醇；B1-异丁醛；B2-异戊醛；B3-己醛；B4-苯甲醛；B5-苯乙醛；B6-香草醛；B7-丁香醛；C1-丁酸；C2-戊酸；C3-己酸；C4-辛酸；C5-异丁酸；C6-异戊酸；C7-苯甲酸；C8-丙酸；C9-壬酸；C10-糠酸；D1-乙酸乙酯；D2-乳酸乙酯；D3-丁二酸二乙酯；D4-乙酸苯乙酯；D5-异戊酸乙酯；D6-乙酸异戊酯；D7-己酸乙酯；D8-苯乙酸乙酯；D9-乙酸糠酯；D10-苯甲酸乙酯；D11-甲酸-2-苯乙酯；D12-烟酸乙酯；E1-2,3-丁二酮；E2-3-羟基-2-丁酮；E3-3-乙酰基-2-丁酮；F1-愈创木酚；F2-苯酚；G1-二甲基二硫；G2-二甲基三硫；G3-3-甲硫基丙醛；G4-3-甲硫基丙醇；G5-3-甲硫基丙酸；H1-2,4,5-三甲基恶唑；H2-吡嗪；H3-2-甲基吡嗪；H4-2,5-二甲基吡嗪；H5-2,3-二甲基吡嗪；H6-2,3,5-三甲基吡嗪；H7-2,3,5,6-四甲基吡嗪，H8-糠醛；H9-2-乙酰基呋喃；H10-5-甲基糠醛；H11-r-丁内酯；H12-糠醇；H13-r-己内酯；H14-2(5H)-呋喃酮；H15-麦芽酚；H16-3-乙酰基吡咯；H17-r-壬内酯；H18-2-甲醛吡咯；H19-泛酰内酯；H20-呋喃酮；H21-葫芦巴内脂；H22-5-乙酰氧基甲基-2-糠醛；H23-5-羟甲基糠醛
图6 不同温度条件下样品PCA分析Biplot图(A)和OPLS-DA得分图(B)
Fig.6 PCA biplot(A)and score plot of OPLS-DA(B)of vinegar samples under different temperatures
在55 ℃高温长时间陈酿的食醋样品附近，聚集的主要有2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪，葫芦巴内酯、5-羟甲基糠醛等一些杂环类化合物以及异丁醛、异戊醛、异丁酸、乙酸乙酯等，表明温度对这些物质有重要的影响。此外，所有样品均在95%的置信区间内，因此可以基于PCA进行监督分析，即OPLS-DA。
由图6-B可知，不同温度条件下食醋样品聚类区分明显，表明温度能明显影响食醋的风味特征。对模型进行置换检验(200次)，结果显示未出现过拟合现象，说明该OPLS-DA模型有效。
为了明确温度对食醋中风味物质的影响，将25和40 ℃样品分为一组，55℃样品为另一组，进行OPLS-DA模型分析。通过化合物的变量投影重要性(variable importance in the projection, VIP)以及S-plot分析，选取VIP>1的化合物(对分组贡献比较大)在S-plot图上标记，对具有差异性的标志物可视化。
由图7可知，H23(5-羟甲基糠醛)、H8(糠醛)、E2(3-羟基-2-丁酮)、E1(2,3-丁二酮)和D2(乳酸乙酯)是由温度引起差异的主要风味物质，表明在食醋陈酿过程中，5-羟甲基糠醛、糠醛、3-羟基-丁酮、2,3-丁二酮、乳酸乙酯等物质的含量受温度影响较大。
图7 不同温度条件下样品OPLS-DA S-plot图
Fig.7 OPLS-DA S-plot of vinegar samples under different temperatures
2.2.2 基于PCA和OPLS-DA分析氧气对挥发性风味物质的影响
将不同氧气条件下食醋样品进行PCA分析，提取3个主成分，累计贡献率72.0%。如图8-A所示，长时间陈酿、溶氧量高的样品附近聚集着一些吡嗪类物质如2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪等以及香草醛、烟酸乙酯、异丁酸等，表明氧气对其有重要的影响作用。此外，结果显示所有的样品均在95%的置信区间内。对样品进行OPLS-DA分析(图8-B)可知，不进行充氧与进行充氧操作的食醋样品有明显的聚类区分，表明在陈酿过程中，氧气能明显影响食醋的风味特征。同时，有效性验证结果表明模型具有可靠性。
WO2-不充氧；MO2-每月充氧；BO2-半月充氧
图8 不同氧气条件下醋样PCA分析Biplot图(A)和OPLS-DA得分图(B)
Fig.8 PCA biplot(A)and score plot of OPLS-DA(B)of vinegar samples under different oxygen storage conditions
将不充氧样品归为一组，每月充氧和半月充氧样品归为另一组，进行OPLS-DA模型分析。在S-plot图上标记VIP>1的风味物质。由图9可知，在陈酿过程中，氧气能明显影响E1(2,3-丁二酮)、B1(异丁醛)、B2(异戊醛)、B4(苯甲醛)、C5(异丁酸)、C6(异戊酸)、H8(糠醛)、A1(异戊醇)和G4(3-甲硫基丙醇)的含量变化。
图9 不同氧气条件下醋样分析的OPLS-DA S-plot图
Fig.9 OPLS-DA S-plot of vinegar samples under different oxygen storage conditions
3 结论
本研究采用SPE和HS-SPME结合GC-MS对陈酿过程中不同温度和氧气条件下镇江香醋挥发性风味物质酸类、醇类、酯类、醛酮类、酚类、含硫类以及杂环类化合物进行定量检测，并通过PCA和OPLS-DA等多元统计方法对结果进一步分析。结果表明，贮存环境因素温度和氧气对食醋挥发性风味物质有显著的影响，大多数风味物质同时受温度、氧气的作用。PCA和OPLS-DA均可对不同处理条件下食醋样品进行有效的区分，55 ℃和25、40 ℃食醋样品区分明显，不充氧和充氧的食醋样品区分明显。温度对5-羟甲基糠醛、糠醛、3-羟基-丁酮、2,3-丁二酮、乳酸乙酯影响显著，氧气能明显影响2,3-丁二酮、异丁醛、异戊醛、苯甲醛、异丁酸、异戊酸、糠醛、异戊醇和3-甲硫基丙醇的含量变化。研究结果表明，食醋在陈酿过程中挥发性风味物质受温度、氧气协同作用影响，因此可以通过对温度和氧气的控制加速食醋陈酿进程，进而调控食醋风味品质。
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