茶叶微生物发酵是以茶叶为基质，接种特定微生物进行共培养，通过它们的代谢等作用使茶叶发生生理生化变化。经过微生物发酵后的茶叶增加了许多微生物代谢活性物质，使有效成分种类增加，品质得到很大的改善。因此，近年来“茶+食用菌”的探索一直受研究者的青睐[1]。茶叶中富含茶多酚、咖啡碱、儿茶素等多种活性物质[2-3]，在药理上具有降血压、降血糖、预防动脉粥样硬化、抗菌消炎、利尿止痢等作用，同时其还具有抗氧化、抗衰老、助消化、缓解疲劳等保健功效[4-7]。白参菌是一种食药兼用的珍稀菇菌，其多糖具有抗癌作用，可治疗小儿腹泻、头晕、偏头痛等疾病，在白参菌的发酵液中含有丰富的鹰眼物质，具体包括氨基酸、多肽、蛋白质、单糖、多糖、有机酸、酚类化合物和油脂等多种活性化学成分。以茶为基质，接种白参菌进行固体发酵[8-9]，加工具有茶和白参菌双重功效的新型功能菌茶，可提高茶叶中活性成分的含量，产生对人体健康更有益的次生代谢产物，并可提升茶叶的综合利用率。因此，对于白参菌发酵茶的研究具有十分重要的意义。
茶叶经过发酵后其活性物质种类和含量会在一定程度上发生变化[10-11]。目前茶叶中活性成分的检测通常包括化学分析方法[12]、高效液相色谱法[13-16]、气相色谱法[17]、气相色谱-质谱联用[18-19]、红外光谱法[20]、紫外可见光谱法[21-22]等。但化学分析方法准确度不够高，光学分析法很难得到茶中茶多酚类单体活性成分的含量，电化学分析方法同样只能确定茶多酚的总量，而高效液相色谱分析法可同时测定出复杂样品中多种成分的含量，具有操作简单、快速、准确的优点。本研究通过建立高效液相色谱(high-performance liquid chromatography，HPLC)检测方法，同时对茶叶发酵前后6种活性成分进行比较研究，为进一步探讨功能菌茶的品质研究提供重要依据，为茶产业的深加工提供新途径。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
咖啡碱(纯度≥ 98%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；可可碱(纯度100%)，上海源叶生物科技有限公司；表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯(纯度≥ 98%)，上海安谱科学仪器有限公司；表没食子儿茶素没食子酸酯(纯度≥ 98%)，上海诗丹德生物技术有限公司；乙腈、甲醇(色谱纯)，Fisher Scientific；85%H3PO4，国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
1260型高效液相色谱仪(配有DAD 检测器)，美国Agilent公司；RV8旋转蒸发仪，上海人和科学仪器有限公司；ZHJH-1109B超净工作台，苏净集团安泰公司；HPS-160生化培养箱，哈尔滨东明医疗仪器厂；DHG-9146A电热恒温鼓风干燥箱，上海精密实验设备有限公司；G154D高压灭菌锅，致微(厦门)仪器有限公司；BS110S电子天平，北京赛多利斯仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 HPLC 条件
色谱柱，wondaSil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相乙腈(A)和0.2%磷酸溶液(B)，梯度洗脱(见表1)，流速，1 mL/min，柱温30 ℃，进样量，20 μL，检测波长 280 nm。
表1 梯度洗脱流动相比例 单位：%
Table 1 The gradient elution program
流动相0min15min40min45minA515255B95857595
1.3.2 白参菌种的活化
将经过高压蒸汽灭菌的马铃薯PDA 培养基于超净工作台中倒入平板中，挑取白参菌丝接种在凝固的PDA培养基平板上，置于31 ℃生化培养箱中培养，等菌丝体长满平板时，于4 ℃冰箱保存备用。挑取活化的菌丝逐步接种于葡萄糖含量不断降低的茶叶水培养基上，至菌丝接种在无糖茶水培养基上能够快速生长，铺满平板，再以茶叶作为培养基质，继续培养菌种，逐步降低培养基中的葡萄糖含量，直至菌种可在无糖茶叶培养基上能够快速生长，将驯化好的菌种保存于4 ℃。
1.3.3 白参菌发酵茶的制备
取驯化好的白参菌菌种接种于湿度为75%的40 g绿茶培养基中，封口后充分摇晃置于室温下培养。待菌丝长满平板时，持续培养4～6 d。然后，将培养基里长满菌丝后的发酵茶叶置于烘箱中，在65 ℃下烘干至恒重，密封干燥，得白参菌发酵茶。
1.3.4 样品前处理
绿茶处理：称量10.0 g绿茶，加100 mL蒸馏水浸提1 h，过滤浸提液，将滤液旋转蒸发浓缩至膏状，用蒸馏水溶解浸膏转移至25 mL容量瓶中定容，得绿茶提取液。移取绿茶提取液1 mL于25 mL容量瓶定容，得待测绿茶提取液，4 ℃保存备用。
菌茶处理：菌茶的处理与上述绿茶处理方式一致。
1.3.5 标准溶液的制备
精密称取可可碱10.0 mg、表没食子儿茶素5.0 mg、咖啡碱50.0 mg、表儿茶素5.0 mg、表没食子儿茶素没食子酸酯5.0 mg、表儿茶素没食子酸酯10.0 mg于25 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至25 mL，配制成标准品的混合溶液。逐级稀释，用甲醇定容，得混合标准品质量浓度为可可碱(12.5～400 μg/mL)，表没食子儿茶素(6.25～200 μg/mL)，咖啡碱(62.5～2 000 μg/μL)，表儿茶素(6.25～200 μg/mL)，表没食子儿茶素没食子酸酯(6.25～200 μg/mL)，表儿茶素没食子酸酯(12.5～400 μg/mL)。4 ℃保存备用。
2 结果与分析
2.1 标准混合样品色谱图
图1为6种混合标准品样品色谱图，标准品可可碱、表没食子儿茶素、咖啡碱、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯； 6种成分的出峰时间为10.62、16.14、17.61、22.16、24.33、32.28 min。由图1可知，各标准品在35 min内均完全分离，各成分分离度高、峰型好。表明该方法适合于同时对茶叶中可可碱、表没食子儿茶素、咖啡碱、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯的分离检测。
1-可可碱;2-表没食子儿茶素;3-咖啡碱;4-表儿茶素;5-表没食子儿茶素没食子酸酯;6-表儿茶素没食子酸酯
图1 六种混合对照品的HPLC色谱图
Fig.1 HPLC chromatogram of 6 mixed reference substances
2.2 线性关系、检出限和定量限
分别取“1.3.5”项下不同浓度的混合标准溶液1 mL，经0.45 μm微孔滤头过滤，按照“1.3.1”项下色谱条件注入高效液相色谱仪中，重复进样5次，记录色谱峰面积。以峰面积S对浓度C作图，绘制标准曲线并进行回归计算，具体结果见表2。测定仪器信噪比(S/N)，当标准溶液稀释至信噪比3<S/N<10时，以该溶液浓度计算仪器检出限(LOD，S/N=3)在0.312 5～1.870 μg/mL，定量限(LOQ，S/N=10) 在1.038～6.240 μg/mL。6种标准样品的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限如表2 所示，6种标准样品质量浓度与峰面积呈现良好的线性关系，R2值在0.995 5以上。
表2 六种不同浓度混合标准品的线性关系、检出限和定量限
Table 2 The linear relativity,LOD and LOQ of six mixed standard substances with different concentrations
标准品 线性关系线性范围/(μg·mL-1)检出限/(μg·mL-1)定量限/(μg·mL-1)相关系数(R2)可可碱S=22377C+51.3512.50～4000.31751.0550.9981表没食子儿茶素S=6794.2C-2.1796.25～2001.12003.7300.9999咖啡碱S=21168C+729.362.50～20000.31251.0380.9972表儿茶素S=4372C-18.626.25～2001.87006.2400.9955表没食子儿茶素没食子酸酯S=13115C-20.906.25～2000.68502.2900.9999表儿茶素没食子酸酯S=17329C-65.9812.50～4000.37131.2350.9997
2.3 重复性试验
分别吸取“1.3.4”项中绿茶和发酵菌茶提取液各5份，经0.45 μm微孔水系滤头过滤，按照 “1.3.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图峰面积，带入“2.2”项下线性方程并计算。绿茶样品中6种活性成分(可可碱、表没食子儿茶素、咖啡碱、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯)的RSD依次为2.92%、5.13%、3.05%、4.03%、2.47%、4.54%。发酵菌茶样品中6种活性成分的RSD依次为3.29%、2.61%、3.13%、5.19%、2.78%、4.17%，表明该方法重复性良好。
2.4 稳定性试验
分别吸取“1.3.4”项中同一绿茶和发酵菌茶提取液，经0.45 μm微孔水系滤头过滤，按照“1.3.1”项下色谱条件分别在0、 3、 6、 9、 12、 15 h进行测定，记录色谱峰面积，计算绿茶样品中6种活性成分(可可碱、表没食子儿茶素、咖啡碱、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯)的RSD依次为0.25%、1.07%、0.04%、0.24%、1.04%、1.14%。发酵菌茶样品中6种活性成分的RSD依次为0.46%、4.37%、0.30%、5.19%、1.75%、0.43%。结果表明,绿茶和发酵菌茶提取液在15 h内稳定。
2.5 加样回收率与精密度
分别称取绿茶和发酵菌茶各3份，每份10.0 g，精密称定，分别加入加标水平为20、 40、 80 μg/g 3个浓度水平的混合标准品溶液，按照1.3.4项样品前处理步骤对加标绿茶和发酵茶样品进行处理，得加标绿茶和发酵菌茶提取液进行加标回收率实验，结果如表3和表4所示，绿茶提取液中可可碱、表没食子儿茶素、咖啡碱、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯的加标回收率均≥95.06%，6种有效成分回收率RSD均≤0.86%；发酵菌茶提取液中上述6种有效成分加标回收率分别≥85.06%，6种有效成分回收率RSD均≤4.23%。
表3 绿茶加标回收试验结果(n=6)
Table 3 Results of recovery tests of green tea
化合物名称 保留时间/min加标量20μg/g加标量40μg/g加标量80μg/g回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%可可碱10.62104.940.0495.060.06104.160.07表没食子儿茶素16.1496.560.28100.770.32101.630.86咖啡碱17.61105.970.0599.800.07105.740.70表儿茶素22.16101.520.07101.380.0397.210.13表没食子儿茶素没食子酸酯24.33100.910.1398.020.17108.740.26表儿茶素没食子酸酯32.28109.060.06105.590.06111.060.08
表4 白参菌茶加标回收试验结果(n=6)
Table 4 Results of recovery testsof Schizophyllum communeh fermented tea
化合物名称 保留时间/min加标量20μg/g加标量40μg/g加标量80μg/g回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%可可碱10.62118.880.45112.390.05102.050.10表没食子儿茶素16.14105.610.67102.071.8686.703.28咖啡碱17.61114.570.05106.160.06100.520.07表儿茶素22.1686.021.75102.800.6793.080.95表没食子儿茶素没食子酸酯24.3394.041.5793.001.1390.550.75表儿茶素没食子酸酯32.28102.034.2395.253.0185.060.80
2.6 绿茶和发酵茶样品测定
分别称取绿茶和发酵菌茶各5份，每份10.0 g，精密称定，按照“1.3.4”项的方法制备供试品溶液，分别吸取按照“1.3.1”项色谱条件进行测定各供试品溶液中6种有效成分含量，比较发酵前后各有效成分含量的变化，结果如图2所示，绿茶与白参菌共发酵后，茶叶中可可碱和咖啡碱的含量几乎没有变化，但表没食子儿茶素含量降低了0.46%，表儿茶素含量降低了1.82%，表没食子儿茶素没食子酸酯含量降低了2.81%，表儿茶素没食子酸酯含量降低了2.78%，RSD值为0.08%～3.39%。性状上，绿茶提取液颜色较浅，而发酵后提取液颜色较深，呈棕黄色，苦涩感降低，口感更佳。
1-可可碱；2-表没食子儿茶素；3- 咖啡碱；4-表儿茶素；5-表没食子儿茶素没食子酸酯；6-表儿茶素没食子酸酯
图2 高效液相色谱图绿茶和白参菌茶
Fig.2 HPLC chromatograms of green tea and Schizophyllum communeh fermented tea
3 结论
本研究建立了同时检测茶叶发酵前后6种活性成分含量变化的高效液相色谱方法。6种活性成分质量浓度在6.25～2 000 μg/mL下线性关系良好，相关系数R2在0.995 5～0.999 9，检出限在0.312 5～1.870 μg/mL。本方法快速、准确、灵敏度高，能够满足茶叶中多种活性成分的定性、定量检测需求。
对白参菌茶发酵前后的活性成分进行测定，结果表明，绿茶与白参菌共发酵后，茶叶中咖啡碱和可可碱含量几乎没有变化，表没食子儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯的含量均大幅下降，降低比例高达80 %以上，从而改善了粗茶的活性成分，提高茶汤口感，有利于促进兼备茶叶和药食用真菌双重效用的新型保健茶品的开发。
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