高效液相色谱法测定蓝莓酒中六种花青素含量

王欢1,谯顺彬1,田辉1,石瑞丽1,彭小东2*

1(贵州工业职业技术学院,贵州 贵阳,550008)2(贵州省产品质量检验检测院,贵州 贵阳,550016)

摘 要 该文建立了一种高效液相色谱二极管阵列检测器同时测定蓝莓酒中6种花青素(飞燕草色素、矢车菊色素、矮牵牛色素、天竺葵色素、芍药素、锦葵色素)质量浓度的方法。样品采用 V(乙醇)∶V(水)∶V(盐酸)=2∶1∶1溶液超声提取,120 ℃ 的烘箱中加热水解后测定。以0.1%的磷酸-乙腈溶液作为流动相,梯度洗脱,经Poroshell 120 EC-C18柱分离,检测波长为525 nm。结果表明,6种花青素的浓度与峰面积在0.5~10 mg/L的质量浓度范围内具有良好线性关系,相关系数r>0.999 9,6种花青素的回收率为80.50%~108.80%(相对标准偏差为0.54%~5.63%),除了锦葵色素的检出限为0.10 mg/kg外,其余5种花青素的检出限均为0.15 mg/kg。该方法简便快捷、精确可靠、重现性好,适用于蓝莓酒中6种花青素的检测。

关键词 蓝莓酒;高效液相色谱;花青素

花青素是一种水溶性色素,属黄酮类化合物,其基本结构母核是2-苯基苯并吡喃,是构成花瓣和果实颜色的主要色素之一。有实验证明,花青素是目前清除人体自由基最有效的天然抗氧化剂,是VC的20倍,VE的50倍,能防治多种疾病,改善人体微循环[1]。蓝莓(Vaccinium spp.),别名越橘、蓝浆果,为杜鹃花科越橘属多年生落叶或是常绿灌木。蓝莓果实柔软多汁,营养丰富,富含花青素、槲皮素等多种黄酮类化合物及其他类生理活性成分。研究表明,蓝莓果实有很强的抗氧化活性,具有提高人体免疫力、防止脑神经老化、改善视力、降低血糖血脂、预防癌症等多种生理功能[2-3]

蓝莓酒是以蓝莓果实为主要原料,经过加工酿制以后得到的果酒,因其独特的口感和丰富的营养而受到消费者的欢迎。但是目前针对蓝莓酒中花青素的检测报道较少,而且考察的花青素种类也不全[4],因此建立一种快速、有效的蓝莓酒中多种花青素的检测方法具有重要的意义。目前,常用的花青素检测方法有可见光分光光度法[5-7]、高效液相色谱法[8-10]及高效液相色谱-质谱联用法[11-12]等。其中,可见光分光光度法一般测定的是样品中花青素总的含量,不能确定单一组分含量,且易受干扰,结果准确度较低;高效液相色谱-串联质谱法检测灵敏度高,但设备昂贵,且由于花青素在低pH值下稳定,而低pH值对电喷雾质谱的离子化会有一定的抑制作用,影响质谱分析[13]。综上,本文采用高效液相色谱法来建立同时测定蓝莓酒中6种花青素的检测方法,并对前处理步骤和检测条件进行优化,为开展蓝莓酒的功能性研究提供技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试样,自制蓝莓酒。

花青素标准品(飞燕草色素、矢车菊色素、矮牵牛色素、天竺葵色素、芍药素、锦葵色素),ChromaDex公司;乙腈(色谱纯),德国默克公司;H3PO4、HCl、无水乙醇(均为分析纯),国药集团公司;实验用水为经超纯水仪处理的一级水。

Aglient 1260 Ⅱ高效液相色谱仪(配DAD检测器),美国安捷伦公司;混匀振荡器,Heidolph公司;SB25-12DTD超声波清洗机,宁波新芝生物科技股份有限公司;干燥箱,德国BINDER;电子天平(精度0.000 1 g),瑞士Mettler Toledo公司;移液器,德国普兰德公司。

1.2 实验方法

1.2.1 液相色谱条件

Poroshell 120 EC-C18色谱柱(100 mm×4.6 mm×2.7 μm),美国安捷伦公司;流动相A,0.1%的H3PO4溶液;流动相B,乙腈;流速1 mL/min;进样量20 μL;柱温40 ℃;紫外检测器检测波长525 nm;梯度洗脱程序如表1所示。

表1 梯度洗脱程序
Table 1 Gradient elution program

时间/min流动相A/%流动相B/%085158.5080209.00851510.008515

1.2.2 标准曲线的配制

标准储备液:分别准确称取6种花青素标准物质5.0 mg(精确至0.1 mg)于50 mL容量瓶中,10%的盐酸甲醇溶液溶解并定容,得100 mg/L的标准储备液,-20℃下避光保存。

标准混合中间液:准确吸取1 mL各标准储备液至10 mL的容量瓶中,10%HCl定容至刻度,制得10.0 mg/L标准工作液。

1.2.3 样品前处理

提取:准确称取1.00~5.00 g的蓝莓酒样品于25 mL的容量瓶中,用提取试剂V(乙醇)∶V(H2O)∶V(HCl)=2∶1∶1定容至刻度,超声振荡提取30 min。

水解:超声提取后,密封好瓶塞,于120 ℃下水解1 h,取出冷却至室温,提取液再次定容,过0.45 μm的水系膜,待上机。

1.2.4 计算公式

花青素含量的计算,如公式(1)所示:

(1)

式中:Xi为样品中各花青素的质量分数,mg/kg;Ci为标准曲线定量的样品各花青素的质量浓度,mg/L;C0为空白的花青素的浓度,mg/L;V为定容体积,mL;m为取样质量,g;d为稀释倍数。花青素总量为各个花青素测定值之和。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的确定

参考文献[13],花青素需在较低pH下进行分离测定,且6种花青素的结构相近,一般短的C18 柱达不到分离效果,而长柱虽能达到分离效果但会占用较长的分析时间,因此选择能够耐低pH且分离度较高的Agilent Poroshell 120 EC-C18 柱,结合花青素各组分的分离度及样品分析时间考虑,经过反复调节流动相比例及梯度,最后得到最优的梯度洗脱程序如表1所示。

由图1和图2可知,6种花青素的出峰时间在10 min以内,分析时间短,且样品跟标液均能达到很好的分离度。由图2可知,蓝莓酒中检出了5种花青素,其中天竺葵色素未检出,这与胡莉等研究的蓝莓中未检出天竺葵色素的情况相符[13]

2.2 检测波长的选择

在确定最佳色谱条件后,本试验采用DAD检测器对6种花青素进行全波长扫描(190~600 nm)。由图3可知,除天竺葵色素的最大吸收波长为512 nm,其余5种花青素的最大吸收波长在525 nm左右,因此综合考虑检测灵敏度及效率值(无需切换波长),统一检测波长为525 nm。

1-飞燕草色素;2-矢车菊色素;3-矮牵牛色素;4-天竺葵色素;5-芍药素;6-锦葵色素
图1 六种花青素标准物质色谱图
Fig.1 The chromatogram of anthocyanins

1-飞燕草色素;2-矢车菊色素;3-矮牵牛色素;4-芍药素;5-锦葵色素
图2 蓝莓酒样品中的花青素色谱图
Fig.2 The chromatogram of anthocyanins in blueberry wine

a-飞燕单色素;b-矢车菊色素;c-矮牵牛色素;d-天竺葵色素;e-芍药素;f-锦葵色素
图3 六种花青素的全波长扫描图
Fig.3 Full-wavelength scanning of 6 kind of anthocyanins

2.3 方法的线性及检出限

将1.2.2的标准混合中间液进行梯度稀释,配制质量浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L的系列标准工作液。结果表明,6种花青素在质量浓度为0.5~10 mg/L线性良好(r>0.999 9)。采用在空白基质中添加目标组分的方法,依据色谱峰的信噪比(S/N)的3倍确定检出限,得到6种花青素的检出限结果如表2所示。

2.4 蓝莓酒样品中花青素的测定及方法的回收率、精密度、稳定性

蓝莓酒样品中花青素的测定方法为准确称取1.00 g 蓝莓酒样品,3个平行,按照1.2.3的方法进行前处理,上机分析,结果如表3所示。

表2 花青素的线性方程及检出限
Table 2 Linear equations and LOD of anthocyanins

组分名称线性方程相关系数(r)检出限/(mg·kg-1)飞燕草色素Y=103.06171X-2.015270.999990.15矢车菊色素Y=131.14334X-2.420270.999990.15矮牵牛色素Y=155.71821X-2.836661.000000.15天竺葵色素Y=44.26479X-0.1933220.999980.15芍药素 Y=133.56272X-0.1824990.999980.15锦葵色素 Y=122.58610X-0.7492810.999990.10

表3 蓝莓酒中花青素的质量浓度
Table 3 The quality concentration of anthocyanins in blueberry wine

组分名称质量浓度/(mg·kg-1)1号2号3号平均值/(mg·kg-1)RSD/%飞燕草色素11.2411.3611.3711.320.65矢车菊色素16.8617.1017.1217.020.85矮牵牛色素6.656.726.786.710.97天竺葵色素-----芍药素 4.273.894.354.175.89锦葵色素 29.5829.7729.1129.491.15

注:-代表未检出

结果表明,蓝莓酒中检出5种花青素,未检出天竺葵色素。5种花青素的含量从高到低分别为锦葵色素 29.49 mg/kg;矢车菊色素 17.02 mg/kg;飞燕草色素 11.32 mg/kg;矮牵牛色素 6.71 mg/kg;芍药素 4.17 mg/kg,RSD在0.65%~5.89%(表3)。

对蓝莓酒中花青素进行测定后,准确称取1.00g蓝莓酒样品,分别加入5、10和20 mg/kg花青素混合标液,每个浓度3个平行,按照1.2.3的方法进行前处理,上机分析,结果如表4所示,6种花青素的回收率为80.50%~108.80%,RSD在0.54%~5.63%。

表4 蓝莓酒中6种花青素的回收率
Table 4 Recovery of anthocyanins in blueberry wine

组分名称加标量/(mg·kg-1)本底值/(mg·kg-1)加标样测定值/(mg·kg-1)回收率/%RSD/%515.8791.001.17飞燕草色素1011.3220.6293.001.162041.03105.151.56522.03100.200.54矢车菊色素1017.0225.4183.901.062040.12100.601.32511.1288.203.59矮牵牛色素106.7114.7680.503.632037.8789.352.6955.21104.205.63天竺葵色素1009.5395.302.122041.76108.802.4559.0798.004.38芍药素104.1713.4092.301.092040.65103.252.43533.7785.605.33锦葵色素1029.4938.1486.500.782060.19102.331.45

精密度和稳定性测定方法为:将6种花青素的混合标准品溶液(1 mg/L),分别于0、2、4、8、12、24 h 各进样 1 次,记录其峰面积和保留时间,计算 RSD、叠加色谱信号,结果如表5和图4所示。

表5 六种花青素的精密度和稳定性
Table 5 The precision and stability of anthocyanins

组分名称0h2h4h8h12h24h平均值RSD/%飞燕草色素30.5272430.4754330.2268529.8465329.5846829.2973529.993011.66矢车菊色素59.8300259.9985659.8273259.8324359.7618959.5188159.794840.26矮牵牛色素47.7741246.9795246.8330446.3984346.4563046.1258946.761221.25天竺葵色素16.9763616.9680617.4504916.9234216.8850016.7508116.992361.41芍药素 47.8885447.2096447.3688146.8124545.9678045.3243746.761942.04锦葵色素 29.345729.0718128.9094927.9300127.6832827.3075128.374632.96

图4 花青素混合标准溶液叠加色谱图
Fig.4 The overlapped chromatograms of anthocyanins mixed standard solution

由表5和图4可知各组分的峰面积在24 h内无明显变化,RSD<3.00%;保留时间稳定,结果表明方法的精密度和稳定性良好。

2.5 水解温度选择

花青素主要以花色苷的形式存在,试样通过水解后生成花青素,因此水解温度直接影响花青素的形成。为有更多的温度选择,得到更好的水解效果,本试验选择在烘箱中进行加热水解反应,温度在70、80、90、100、110、120、130 ℃,水解1 h,考察温度对各花青素质量分数的影响。

如图5所示,当温度在120 ℃时,各花青素质量分数最高,120 ℃以上时略有下降,且温度越高,花青素降解的速度越快,前处理对密封的要求也越高,且易发生喷溅,综合考虑,选择120 ℃作为最佳水解温度。

图5 水解温度的影响
Fig.5 Effect of hydrolysis temperature

2.6 水解时间选择

水解时间的长短也直接影响花青素质量浓度的高低。实验选择在120 ℃水解20、30、45、60、90、120 min,考察水解时间对花青素质量浓度的影响。如图6所示,60~90 min,各花青素质量浓度达到最高,90 min后开始下降,结合时效考虑,选择60 min的水解时长为最佳。

图6 水解时间的影响
Fig.6 Effect of hydrolysis time

3 结论

本文研究建立了蓝莓酒中的6种花青素的高效液相色谱检测方法,检出蓝莓酒中含有飞燕草色素、矢车菊色素、矮牵牛色素、锦葵色素5种花青素,其中锦葵色素含量最高(29.49 mg/kg),矢车菊色素(17.02 mg/kg)、飞燕草色素(11.32 mg/kg)次之。实验采用烘箱加热水解的方式,在温度为120 ℃,水解时间为60 min时,花青素的提取效果最佳,优化了提取和色谱条件,方法的线性良好,检出限较低,精密度和稳定性良好,回收率在80.50%~108.80%,可作为蓝莓酒中花青素快速检测的参考方法。

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Determination of anthocyanins in blueberry wine by high-performance liquid chromatography

WANG Huan1, QIAO Shunbin1,TIAN Hui1,SHI Ruili1,PENG Xiaodong2*

1 (Guizhou Industry Polytechnic College, Guiyang 550008, China)2(Guizhou Product Quality Inspection and Testing Institute, Guiyang 550016, China)

ABSTRACT A simple, accurate and stable method for the analysis of anthocyanins in blueberry wine was established. Six kinds of anthocyanins, namely, delphinidin, cyanidin, petunidin, pelargonidin, peonidin, and malvidin were determined by high-performance liquid chromatography with diode array detection. A mixture of ethanol, water and hydrochloric acid at a ratio of 2∶1∶1(V/V/V) was used for the ultrasonic extraction. The samples were detected after heating and hydrolysis in an oven at 120 ℃. Poreshell 120 EC-C18 column was used as an analytical column. A mixture of 0.1% phosphoric acid and acetonitrile was used as the mobile phase in gradient mode and the detection wavelength was 525 nm. The results showed that the concentration of anthocyanins was in accordance with linear regression in the range of 0.5-10 mg/L (r>0.999 9). The range of the spiked recoveries was 80.50%-108.80%, with the relative standard deviations (RSD) of 0.54%-5.63%. The limit of detection (LOD) obtained for malvidin and other five anthocyanins were 0.10 mg/kg and 0.15mg/kg, respectively. Method validation showed that the developed method was reliable for the analysis of anthocyanins.

Key words blueberry wine; high-performance liquid chromatography; anthocyanin

引用格式:王欢,谯顺彬,田辉,等.高效液相色谱法测定蓝莓酒中六种花青素含量[J].食品与发酵工业,2020,46(8):280-284.WANG Huan, QIAO Shunbin,TIAN Hui, et al. Determination of anthocyanins in blueberry wine by high-performance liquid chromatography[J].Food and Fermentation Industries,2020,46(8):280-284.

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.022040

第一作者:硕士,讲师(彭小东工程师为通讯作者,E-mail:seasky.sun@163.com)

收稿日期:2019-08-20,改回日期:2020-02-14