花青素是一种水溶性色素,属黄酮类化合物,其基本结构母核是2-苯基苯并吡喃,是构成花瓣和果实颜色的主要色素之一。有实验证明,花青素是目前清除人体自由基最有效的天然抗氧化剂,是VC的20倍,VE的50倍,能防治多种疾病,改善人体微循环[1]。蓝莓(Vaccinium spp.),别名越橘、蓝浆果,为杜鹃花科越橘属多年生落叶或是常绿灌木。蓝莓果实柔软多汁,营养丰富,富含花青素、槲皮素等多种黄酮类化合物及其他类生理活性成分。研究表明,蓝莓果实有很强的抗氧化活性,具有提高人体免疫力、防止脑神经老化、改善视力、降低血糖血脂、预防癌症等多种生理功能[2-3]。
蓝莓酒是以蓝莓果实为主要原料,经过加工酿制以后得到的果酒,因其独特的口感和丰富的营养而受到消费者的欢迎。但是目前针对蓝莓酒中花青素的检测报道较少,而且考察的花青素种类也不全[4],因此建立一种快速、有效的蓝莓酒中多种花青素的检测方法具有重要的意义。目前,常用的花青素检测方法有可见光分光光度法[5-7]、高效液相色谱法[8-10]及高效液相色谱-质谱联用法[11-12]等。其中,可见光分光光度法一般测定的是样品中花青素总的含量,不能确定单一组分含量,且易受干扰,结果准确度较低;高效液相色谱-串联质谱法检测灵敏度高,但设备昂贵,且由于花青素在低pH值下稳定,而低pH值对电喷雾质谱的离子化会有一定的抑制作用,影响质谱分析[13]。综上,本文采用高效液相色谱法来建立同时测定蓝莓酒中6种花青素的检测方法,并对前处理步骤和检测条件进行优化,为开展蓝莓酒的功能性研究提供技术手段。
试样,自制蓝莓酒。
花青素标准品(飞燕草色素、矢车菊色素、矮牵牛色素、天竺葵色素、芍药素、锦葵色素),ChromaDex公司;乙腈(色谱纯),德国默克公司;H3PO4、HCl、无水乙醇(均为分析纯),国药集团公司;实验用水为经超纯水仪处理的一级水。
Aglient 1260 Ⅱ高效液相色谱仪(配DAD检测器),美国安捷伦公司;混匀振荡器,Heidolph公司;SB25-12DTD超声波清洗机,宁波新芝生物科技股份有限公司;干燥箱,德国BINDER;电子天平(精度0.000 1 g),瑞士Mettler Toledo公司;移液器,德国普兰德公司。
1.2.1 液相色谱条件
Poroshell 120 EC-C18色谱柱(100 mm×4.6 mm×2.7 μm),美国安捷伦公司;流动相A,0.1%的H3PO4溶液;流动相B,乙腈;流速1 mL/min;进样量20 μL;柱温40 ℃;紫外检测器检测波长525 nm;梯度洗脱程序如表1所示。
表1 梯度洗脱程序
Table 1 Gradient elution program
时间/min流动相A/%流动相B/%085158.5080209.00851510.008515
1.2.2 标准曲线的配制
标准储备液:分别准确称取6种花青素标准物质5.0 mg(精确至0.1 mg)于50 mL容量瓶中,10%的盐酸甲醇溶液溶解并定容,得100 mg/L的标准储备液,-20℃下避光保存。
标准混合中间液:准确吸取1 mL各标准储备液至10 mL的容量瓶中,10%HCl定容至刻度,制得10.0 mg/L标准工作液。
1.2.3 样品前处理
提取:准确称取1.00~5.00 g的蓝莓酒样品于25 mL的容量瓶中,用提取试剂V(乙醇)∶V(H2O)∶V(HCl)=2∶1∶1定容至刻度,超声振荡提取30 min。
水解:超声提取后,密封好瓶塞,于120 ℃下水解1 h,取出冷却至室温,提取液再次定容,过0.45 μm的水系膜,待上机。
1.2.4 计算公式
花青素含量的计算,如公式(1)所示:
(1)
式中:Xi为样品中各花青素的质量分数,mg/kg;Ci为标准曲线定量的样品各花青素的质量浓度,mg/L;C0为空白的花青素的浓度,mg/L;V为定容体积,mL;m为取样质量,g;d为稀释倍数。花青素总量为各个花青素测定值之和。
参考文献[13],花青素需在较低pH下进行分离测定,且6种花青素的结构相近,一般短的C18 柱达不到分离效果,而长柱虽能达到分离效果但会占用较长的分析时间,因此选择能够耐低pH且分离度较高的Agilent Poroshell 120 EC-C18 柱,结合花青素各组分的分离度及样品分析时间考虑,经过反复调节流动相比例及梯度,最后得到最优的梯度洗脱程序如表1所示。
由图1和图2可知,6种花青素的出峰时间在10 min以内,分析时间短,且样品跟标液均能达到很好的分离度。由图2可知,蓝莓酒中检出了5种花青素,其中天竺葵色素未检出,这与胡莉等研究的蓝莓中未检出天竺葵色素的情况相符[13]。
在确定最佳色谱条件后,本试验采用DAD检测器对6种花青素进行全波长扫描(190~600 nm)。由图3可知,除天竺葵色素的最大吸收波长为512 nm,其余5种花青素的最大吸收波长在525 nm左右,因此综合考虑检测灵敏度及效率值(无需切换波长),统一检测波长为525 nm。
1-飞燕草色素;2-矢车菊色素;3-矮牵牛色素;4-天竺葵色素;5-芍药素;6-锦葵色素
图1 六种花青素标准物质色谱图
Fig.1 The chromatogram of anthocyanins
1-飞燕草色素;2-矢车菊色素;3-矮牵牛色素;4-芍药素;5-锦葵色素
图2 蓝莓酒样品中的花青素色谱图
Fig.2 The chromatogram of anthocyanins in blueberry wine
a-飞燕单色素;b-矢车菊色素;c-矮牵牛色素;d-天竺葵色素;e-芍药素;f-锦葵色素
图3 六种花青素的全波长扫描图
Fig.3 Full-wavelength scanning of 6 kind of anthocyanins
将1.2.2的标准混合中间液进行梯度稀释,配制质量浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L的系列标准工作液。结果表明,6种花青素在质量浓度为0.5~10 mg/L线性良好(r>0.999 9)。采用在空白基质中添加目标组分的方法,依据色谱峰的信噪比(S/N)的3倍确定检出限,得到6种花青素的检出限结果如表2所示。
蓝莓酒样品中花青素的测定方法为准确称取1.00 g 蓝莓酒样品,3个平行,按照1.2.3的方法进行前处理,上机分析,结果如表3所示。
表2 花青素的线性方程及检出限
Table 2 Linear equations and LOD of anthocyanins
组分名称线性方程相关系数(r)检出限/(mg·kg-1)飞燕草色素Y=103.06171X-2.015270.999990.15矢车菊色素Y=131.14334X-2.420270.999990.15矮牵牛色素Y=155.71821X-2.836661.000000.15天竺葵色素Y=44.26479X-0.1933220.999980.15芍药素 Y=133.56272X-0.1824990.999980.15锦葵色素 Y=122.58610X-0.7492810.999990.10
表3 蓝莓酒中花青素的质量浓度
Table 3 The quality concentration of anthocyanins in blueberry wine
组分名称质量浓度/(mg·kg-1)1号2号3号平均值/(mg·kg-1)RSD/%飞燕草色素11.2411.3611.3711.320.65矢车菊色素16.8617.1017.1217.020.85矮牵牛色素6.656.726.786.710.97天竺葵色素-----芍药素 4.273.894.354.175.89锦葵色素 29.5829.7729.1129.491.15
注:-代表未检出
结果表明,蓝莓酒中检出5种花青素,未检出天竺葵色素。5种花青素的含量从高到低分别为锦葵色素 29.49 mg/kg;矢车菊色素 17.02 mg/kg;飞燕草色素 11.32 mg/kg;矮牵牛色素 6.71 mg/kg;芍药素 4.17 mg/kg,RSD在0.65%~5.89%(表3)。
对蓝莓酒中花青素进行测定后,准确称取1.00g蓝莓酒样品,分别加入5、10和20 mg/kg花青素混合标液,每个浓度3个平行,按照1.2.3的方法进行前处理,上机分析,结果如表4所示,6种花青素的回收率为80.50%~108.80%,RSD在0.54%~5.63%。
表4 蓝莓酒中6种花青素的回收率
Table 4 Recovery of anthocyanins in blueberry wine
组分名称加标量/(mg·kg-1)本底值/(mg·kg-1)加标样测定值/(mg·kg-1)回收率/%RSD/%515.8791.001.17飞燕草色素1011.3220.6293.001.162041.03105.151.56522.03100.200.54矢车菊色素1017.0225.4183.901.062040.12100.601.32511.1288.203.59矮牵牛色素106.7114.7680.503.632037.8789.352.6955.21104.205.63天竺葵色素1009.5395.302.122041.76108.802.4559.0798.004.38芍药素104.1713.4092.301.092040.65103.252.43533.7785.605.33锦葵色素1029.4938.1486.500.782060.19102.331.45
精密度和稳定性测定方法为:将6种花青素的混合标准品溶液(1 mg/L),分别于0、2、4、8、12、24 h 各进样 1 次,记录其峰面积和保留时间,计算 RSD、叠加色谱信号,结果如表5和图4所示。
表5 六种花青素的精密度和稳定性
Table 5 The precision and stability of anthocyanins
组分名称0h2h4h8h12h24h平均值RSD/%飞燕草色素30.5272430.4754330.2268529.8465329.5846829.2973529.993011.66矢车菊色素59.8300259.9985659.8273259.8324359.7618959.5188159.794840.26矮牵牛色素47.7741246.9795246.8330446.3984346.4563046.1258946.761221.25天竺葵色素16.9763616.9680617.4504916.9234216.8850016.7508116.992361.41芍药素 47.8885447.2096447.3688146.8124545.9678045.3243746.761942.04锦葵色素 29.345729.0718128.9094927.9300127.6832827.3075128.374632.96
图4 花青素混合标准溶液叠加色谱图
Fig.4 The overlapped chromatograms of anthocyanins mixed standard solution
由表5和图4可知各组分的峰面积在24 h内无明显变化,RSD<3.00%;保留时间稳定,结果表明方法的精密度和稳定性良好。
花青素主要以花色苷的形式存在,试样通过水解后生成花青素,因此水解温度直接影响花青素的形成。为有更多的温度选择,得到更好的水解效果,本试验选择在烘箱中进行加热水解反应,温度在70、80、90、100、110、120、130 ℃,水解1 h,考察温度对各花青素质量分数的影响。
如图5所示,当温度在120 ℃时,各花青素质量分数最高,120 ℃以上时略有下降,且温度越高,花青素降解的速度越快,前处理对密封的要求也越高,且易发生喷溅,综合考虑,选择120 ℃作为最佳水解温度。
图5 水解温度的影响
Fig.5 Effect of hydrolysis temperature
水解时间的长短也直接影响花青素质量浓度的高低。实验选择在120 ℃水解20、30、45、60、90、120 min,考察水解时间对花青素质量浓度的影响。如图6所示,60~90 min,各花青素质量浓度达到最高,90 min后开始下降,结合时效考虑,选择60 min的水解时长为最佳。
图6 水解时间的影响
Fig.6 Effect of hydrolysis time
本文研究建立了蓝莓酒中的6种花青素的高效液相色谱检测方法,检出蓝莓酒中含有飞燕草色素、矢车菊色素、矮牵牛色素、锦葵色素5种花青素,其中锦葵色素含量最高(29.49 mg/kg),矢车菊色素(17.02 mg/kg)、飞燕草色素(11.32 mg/kg)次之。实验采用烘箱加热水解的方式,在温度为120 ℃,水解时间为60 min时,花青素的提取效果最佳,优化了提取和色谱条件,方法的线性良好,检出限较低,精密度和稳定性良好,回收率在80.50%~108.80%,可作为蓝莓酒中花青素快速检测的参考方法。
[1] BAKOWSKA A, KUCHARSKA A Z, OSZMIANSKI J. The effects of heating, UV irradiation, and storage on stability the anthocyanin-polyphenolcopigment complex[J]. Food Chemistry,2003,81:349-355.
[2] 李亚东,张志东,吴林.蓝莓果实的成分及保健机能[J].中国食物与营养,2002(1):27-28.
[3] 陈卫.蓝莓及其营养与保健功能[J].中外食品,2003(7):34-35.
[4] 宋阳成,陈玉娟,李皓,等.蓝莓类饮料中花青素的快速检测方法[J].食品科学,2010,31(24):334-336.
[5] RAPISARDA P, FANELLA F, MACCATONE E. Reliability of analytical methods for determining anthocyanidin in blood orange juices[J]. J Agric Food Chem,2000, 48(6): 2 249-2 252.
[6] 刘洪海,张晓丽,杜平,等. pH示差法测定烟73葡萄中花青素含量[J].中国调味品,2009,34(4):110-111;117.
[7] 杨兆艳. pH示差法测定桑椹红色素中花青素含量的研究[J].食品科技,2007,32(4): 201-203.
[8] 岳喜庆,张超,王宇滨,等.双标样高效液相色谱法测定紫玉米花青素的含量[J].食品研究与开发,2010,31(6):126-129.
[9] 薛晓丽.高效液相色谱法测定黑米提取物中矢车菊色素的成分及含量[J].食品科技, 2010, 35(2):268-270;274.
[10] 杨莹莹,王晓燕,冯夏珍,等. HPLC测定黄刺玫果中主要花青素的成分及其含量[J].中国食品添加剂,2018(10):173-178.
[11] 刘玉芹,江婷,赵先恩,等.高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱分析紫甘蓝和羽衣甘蓝中花色苷[J].分析化学,2011,39(3):419-424.
[12] 杭园园,李悦,王朝警,等.黑果枸杞39花青素类型、含量及结构分析研究[J].食品研究与开发,2018,39(13):143-148.
[13] 胡莉,仲伶俐,毛建霏,等.高效液相色谱测定粮食、蔬菜和水果中的花青素[J].分析试验室,2012,31(12):43-47.