壳聚糖(聚(1,4)-2-氨基-2-脱氧-β-D葡萄糖)是甲壳素通过脱乙酰作用得到的阳离子聚合物[1]，由于其环境友好性、生物降解性、生物相容性、高质量成膜能力、可食性和无毒性被广泛应用于食品包装中[2]，用来替代传统食品保鲜膜(聚乙烯、聚氯乙烯以及聚偏二氯乙烯等)，以改善传统保鲜膜造成的环境污染问题[3]。单独的壳聚糖保鲜膜机械性能差，抗菌性和抗氧化性有限，故而将壳聚糖与淀粉(或蛋白)复合成膜以提升壳聚糖膜的机械性能[4]，将壳聚糖与酚类物质通过化学改性或物理共混得到复合膜以改善其抗菌性和抗氧化性[5]，但复合膜机械性能和保鲜效果依然有所欠缺。纳米壳聚糖用于食品保鲜的研究应运而生。
纳米壳聚糖是由壳聚糖经过物理化学方法改性制得的纳米颗粒，可用作食品保鲜。小尺寸的粒径为纳米颗粒与基质的接触提供了更大的比表面积，从而提高了纳米壳聚糖的生物活性[6]。纳米形式大大改善了壳聚糖的水溶性，扩大了应用范围[7]，而且纳米壳聚糖在抗氧化性、抗菌性、渗透性和吸收性等方面也得到了显著提高[8]。在食品保鲜中，纳米粒子的使用可以减少气体的渗透，减少气味损失以增加对食品的保护[9]。纳米壳聚糖已经在果蔬和肉类等食品的保鲜中得以应用，其保鲜效果在一定程度上优于壳聚糖保鲜膜。本文简要介绍了纳米壳聚糖的常见制备方法，包括离子交联法、乳化交联法和喷雾干燥法，总结了3种方法各自的特点，同时较为详细地综述了纳米壳聚糖在食品保鲜中的应用，希望能对纳米壳聚糖保鲜膜在食品保鲜方面的研究提供依据。
1 纳米壳聚糖的制备
纳米壳聚糖的制备方法多种多样，根据不同的实验目的，应用领域，选择不同的制备方法，常见的有离子交联法，乳化交联法和喷雾干燥法等(表1)。其中离子交联法和乳化交联法得到的是纳米壳聚糖悬浮液，可用作涂膜保鲜，而喷雾干燥法制得的是固体壳聚糖纳米粒子，主要用于荷载药物。
表1 纳米壳聚糖的制备方法比较
Table 1 Comparison of three methods for preparing nano-chitosan
文献制备方法负载物质有毒试剂粒径控制手段粒子性质应用[11]离子交联法无无TPP和CS的浓度纳米壳聚糖的最小粒径为260nm作为载体分子,用于治疗疾病[12]离子交联法抗坏血酸无TPP和CS的浓度抗氧化性大大提高在食品加工中添加可提高抗氧化性[13]离子交联法溶菌酶无/抗菌性能得提升直接添加或掺入包装中提高抗菌性[15]离子交联法塑化淀粉无/力学性能和机械性能得到提高用于食品包装改善机械性能[18]乳化交联法无戊二烯和甲苯CS分子质量,不同油相,不同交联剂得到的微粒粒径均匀、球形良好用于包载药物,治疗疾病[19]乳化交联法无/超声时间制备出不同粒径的纳米壳聚糖用于涂膜保鲜番茄[22]乳化交联法抗坏血酸棕榈酸盐无/呈球形,平均直径30～100nm包载抗坏血酸的纳米壳聚糖可以缓慢释放抗氧化性[23]乳化交联法香芹酚无/粒子呈球形,平均直径为40～80nm,Zeta电位值为25～29mV负载香芹酚后纳米壳聚糖的抗菌性显著提高[24]喷雾干燥法无无CS的浓度和分子质量粒径为95～358nm,颗粒均一络合阿莫西林,提高阿莫西林的抗菌性[25]喷雾干燥法无甲醛和戊二醛喷雾干燥机的制备参数微球呈球形,粒径在1.75～3.17μm荷载药物,研究体外释放特性[26]喷雾干燥法维生素C无TPP溶液的用量粒子呈球形,平均粒径为6.1～9.0μm用于口服给药维生素C
注：CS为壳聚糖，TPP为三聚磷酸钠，/表示文中未提到(下同)
1.1 离子交联法
离子交联法制备纳米壳聚糖的操作过程是：壳聚糖在溶液中带阳离子，聚阳离子与聚阴离子[常用三聚磷酸钠(TPP)]通过静电相互作用，形成电离凝胶，得到壳聚糖纳米颗粒[10]。
在1997年CALVO等[11]首次提出用离子交联法制备纳米壳聚糖，将三聚磷酸钠溶液缓慢匀速滴加到壳聚糖乙酸溶液中，即可得到纳米壳聚糖，通过调节壳聚糖和三聚磷酸钠溶液的浓度，以及壳聚糖溶液与三聚磷酸钠溶液的比例，可改变纳米壳聚糖粒径大小，而且在一定范围内，壳聚糖和三聚磷酸钠浓度越低，壳聚糖纳米粒子的粒径越小。通过添加活性物质可以提高纳米壳聚糖的性能。纳米壳聚糖负载抗坏血酸后，会对抗坏血酸有一定的保护作用，延长其抗氧化时间，维持其生物活性，故而实现纳米颗粒抗氧化性的大大提高[12]。将壳聚糖纳米粒子悬浮液与溶菌酶混合，溶菌酶能抑制某些革兰氏阳性菌，但是对革兰氏阴性菌不够敏感，将溶菌酶整合到纳米壳聚糖上可以拓宽溶菌酶的抗菌谱，故而抗菌性能得到大幅提升[13]。另外将硫酸铜加入到纳米壳聚糖悬浮液中，可得到负载铜离子的纳米壳聚糖，铜离子在体外具有较高的抗菌活性，而且贮存过程稳定，所以载铜纳米壳聚糖的抗菌性会有提高[14]。将纳米壳聚糖与塑化淀粉制成复合材料，因为塑化淀粉机械性能和水分敏感性差，在塑化淀粉基体中引入纳米壳聚糖填料，形成淀粉基纳米壳聚糖复合材料，可以提高力学性能、动态力学性能、水蒸气渗透性能和热降解性能[15]。除此之外，将生物活性鱼明胶溶液与纳米壳聚糖悬浮液混合，不仅能提高纳米壳聚糖的抗菌活性，而且还改善了机械性能[16]。离子交联法操作简便，用料便宜易得，中间引入的试剂少，且不具有毒性[17]，故而应用广泛。
1.2 乳化交联法
乳化交联法制备纳米壳聚糖的过程是：壳聚糖溶液为水相，与一种油相混合，形成类似油包水(W/O)或水包油(O/W)型乳剂，然后使用交联剂进行化学交联，超声处理后形成纳米壳聚糖颗粒。
乳化交联法制得的纳米壳聚糖的性能与多种因素有关，包括壳聚糖的分子质量、乳化剂的种类以及交联剂的种类等。张振旺[18]探究了上述因素对纳米壳聚糖制备的影响，结果表明当壳聚糖的分子质量为1×105，以石蜡油与Span 80的混合物为油相，戊二烯的饱和甲苯溶液为交联剂，制备的纳米壳聚糖颗粒均匀，粘连最少。乳化交联法制备纳米壳聚糖的一大优点在于，可通过改变超声时间来控制颗粒大小，主要表现为，随着超声时间的延长，纳米壳聚糖的液滴尺寸不断增加[19]，当平均粒径在30 ～ 120 nm时，浓度越低，粒径越大[20]。乳化交联法制得的壳聚糖纳米颗粒大小均匀，形态稳定，粒径比较小。但此法应用较少，这是由于在制备过程中引入的试剂较多，有些还具有毒性[21]。于是出现了离子交联法联合乳化交联法制备纳米壳聚糖，可以集中两种制备方法的优点，弥补单一方法的不足，形成非常微小的纳米粒子，同时也避免了使用有毒性的交联剂。通过水包油乳液形成液滴，再用钠离子凝胶进行液滴固化，例如在壳聚糖乙酸溶液中加入一种油相，形成水包油乳液，再缓慢加入三聚磷酸钠，同时不断搅拌，每个液滴通过壳聚糖的质子化氨基
和三聚磷酸钠的聚磷酸盐基团
相互作用而固化，最终得到纳米壳聚糖[22]。将香芹酚加入到壳聚糖水包油乳液中，然后加三聚磷酸钠，可得到负载香芹酚的纳米壳聚糖，有效提高单一纳米壳聚糖的抗菌性[23]。
1.3 喷雾干燥法
喷雾干燥法是通过喷雾干燥机将壳聚糖溶液变为干粉、颗粒或团聚物的一种工艺，从而制备壳聚糖纳米颗粒。
喷雾干燥法的核心仪器为喷雾干燥机，在壳聚糖乙酸溶液中加入戊二烯或甲醛作为交联剂，送入喷雾干燥机中，从喷嘴处喷出干燥的壳聚糖纳米颗粒。通过喷雾干燥法制得的纳米壳聚糖粒径约为95～358 nm，zeta电位较高，且颗粒均一。壳聚糖溶液的浓度、壳聚糖的分子质量，会影响纳米壳聚糖的性能[24]。且壳聚糖纳米颗粒的粒径与制备参数也有一定的关系，速度快，泵嘴大，空气输入量小的情况下，可以形成较大粒径的壳聚糖纳米颗粒[25]。通过改变这些因素，可控制纳米壳聚糖的性能。采用喷雾干燥法将三聚磷酸钠作为交联剂，得到了包埋维生素C的纳米壳聚糖颗粒。三聚磷酸钠是一种无毒的交联剂，优于其他毒性交联剂，并且可以通过改变三聚磷酸钠溶液的用量，得到不同大小、zeta电位、包封率和表面形貌的纳米壳聚糖颗粒[26]。
喷雾干燥法直观简单，可以直接得到固体样品，而且得到的纳米颗粒粒径可控。此法在荷载药物领域应用广泛，但在食品涂膜保鲜方面并不常见。
2 纳米壳聚糖的食品保鲜机理
壳聚糖的抗菌保鲜机理可能源于下列几种情况：一是因为壳聚糖分子中的质子化氨基具有正电性，吸引带有负电荷的细菌，达到抑菌目的；二是壳聚糖进入菌体内部，抑制微生物的生长和繁殖；三是壳聚糖形成致密的保护膜，阻止了细菌的进入以及气体的交换；四是壳聚糖中的氨基可以与细菌细胞壁表面的羧基反应，影响细胞壁的完整性；五是壳聚糖可以选择性地与细菌体内的金属离子结合，破坏其功能[27-28]。将壳聚糖制备成纳米壳聚糖后，纳米结构大大提升了壳聚糖的渗透性，可以更轻易地进入菌体，与菌体内带有负电荷的物质以及金属离子结合，杀灭细菌。除此之外，与壳聚糖相比，纳米壳聚糖形成的膜更加致密，对细菌和气体的隔绝能力更强。故而，纳米壳聚糖膜的保鲜效果更好[29]。经纳米壳聚糖涂膜的食品可明显减缓腐败变质的速度，延长保质期。
3 纳米壳聚糖与壳聚糖的食品安全评估
壳聚糖作为一种安全可食的制膜材料，具有良好的杀灭微生物性能，而且毒性低，稳定性好[30]。壳聚糖制备成纳米壳聚糖后毒性作用不明显，用作食品包装材料安全性比较高。LIMA等[9]研究了纳米壳聚糖在食品包装薄膜中的遗传毒性，结果表明，纳米壳聚糖对DNA没明显的损伤，但是82和111 nm纳米粒子在最高浓度下降低了有丝分裂指数，体外毒性试验表明，颗粒只有在较大的尺寸和较高的浓度时才具有毒性。另外壳聚糖和纳米壳聚糖均能促进植物生长，使植物器官扩增，类似激素的作用[31]。
4 纳米壳聚糖在食品保鲜中的应用
4.1 水果保鲜
水果的呼吸作用以及蒸腾作用旺盛，水分和糖分损失严重，而且容易腐败变质[32]。壳聚糖保鲜膜可以有效地阻水隔氧，降低水果呼吸作用和蒸腾作用，延长保质期[33]。而纳米壳聚糖在水果保鲜方面大多展现出更加优异的性能。
纳米壳聚糖涂膜保鲜技术在水果保鲜中有着较为良好的效果(表2)。纳米壳聚糖的粒径大小对保鲜效果有一定的影响，用离子交联法分别制得110 nm和300 nm纳米壳聚糖涂膜液，喷涂在苹果切片表面，在5 ℃环境中放置10 d。结果表明，与传统壳聚糖涂膜相比，壳聚糖纳米粒子涂膜具有更好的抗菌效果，而且110 nm纳米壳聚糖涂膜在抗菌活性、色泽、多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)、过氧化物酶(peroxidase,POD)和硬度等方面表现出更好的效果，这是由于110 nm颗粒较小，纳米壳聚糖的迁移率和表面相互作用强，从而提高了抗菌活性[34]。除此之外，纳米壳聚糖的浓度也会对保鲜效果造成影响。用0.2%和0.5%的纳米壳聚糖溶液，涂布在苹果表面，在温度(1±1) ℃，湿度80%～90%的情况下存放9周。结果表明，纳米壳聚糖涂层能显著降低苹果的失重率、呼吸速率、乙烯释放量和过氧化物酶活性，且0.5%的纳米壳聚糖溶液对苹果的保鲜效果更好，更为有效地延长了苹果的货架期[35]。纳米壳聚糖负载其它物质是水果保鲜的主要趋势之一。用离子交联法分别制得纳米壳聚糖和载铜纳米壳聚糖，涂布在新鲜草莓表面，在温度(4±1) ℃，湿度70%的环境中放置20 d。2种涂层对草莓多酚氧化酶和过氧化物酶活性均表现出明显的抑制作用，但二者对草莓的保鲜效果相近，综合考虑各方面的因素，前者可能更容易被消费者接受[36]。
表2 纳米壳聚糖涂膜对水果保鲜效果
Table 2 Preservative effect of nano-chitosan on fruit
文献涂膜种类失重率硬度呼吸速率PPO活性POD活性微生物指标感官评定[34]110nmCSNPs/相似/10d后较低10d后最低各种指标均为最低/300nmCSNPs//与110nmCSNPs样品相似比110nmCSNPs样品略高次于110nmCSNPs样品/chitosan//偏高但低于空白偏高与空白相差不大劣于110和300nmCSNPs样品/[35]0.2%CSNPs3.4%优于空白,劣与0.5%CSNPs平均增加幅度为42%降低有一定抑制作用//0.5%CSNPs2.2%硬度保持最好平均增加幅度为64%降低程度与0.2%CSNPs相差不大抑制作用优于0.2%CSNPs样品//[36]不载铜纳米壳聚糖1.7%高于空白最低明显降低明显降低具有一定抑菌性保持良好风味,感官品质载铜纳米壳聚糖1.5%与不载铜样品相似略高于不载铜样品降低程度与不载铜样品相似降低程度次于不载铜样品与不载铜样品相似略差于不载铜样品
注：CSNPs为纳米壳聚糖的简称，PPO活性为多酚氧化酶活性，POD活性为过氧化物酶活性，本图表只列举了几个重要且常见的指标
4.2 蔬菜保鲜
与水果相似，蔬菜同样容易腐败变质，故而蔬菜保鲜也是及其重要的，纳米壳聚糖膜对多种常见蔬菜均具有良好的保鲜效果。
纳米壳聚糖膜及其复合涂膜能显著延长各类蔬菜的保质期(表3)。将壳聚糖纳米涂膜液涂布在番茄表面，放置在温度(15±2)℃，湿度70%～80%的环境中20 d。结果表明，纳米壳聚糖处理后的番茄失重率稍高，但硬度、叶绿素含量的丧失以及可溶性固形物的含量等指标均优于未处理的番茄，这是因为相较于壳聚糖，壳聚糖纳米颗粒小得多，形成的膜更加致密，可降低水蒸气和其他气体渗透性，并且可以阻挡更多的微生物进入[19]。另外纳米壳聚糖也用于平菇保鲜，用纳米壳聚糖和壳聚糖分别处理平菇，4 ℃环境下放置14 d，每2 d检查1次失重率，呼吸强度，可溶性固形物，细胞渗透性和多酚氧化酶活性等指标。结果表明，纳米壳聚糖处理的平菇保鲜效果更佳[37]。纳米壳聚糖涂膜处理能显著延缓鲜切茭白褐变和木质化，提高抗氧化酶类活性，最终维持其较好的品质[38]。LUO等[39]探究了壳聚糖/纳米壳聚糖复合涂膜对茭白的保鲜效果，考察茭白褐变和木质化情况。结果表明，与壳聚糖涂膜相比，壳聚糖/纳米壳聚糖复合涂膜控制茭白褐变和木质化效果更为明显。扎塔里亚多花香精油(ZEO)具有显著的抗氧化作用和抗菌特性，纳米壳聚糖对ZEO有一定的装载和递送能力，所以用负载ZEO的纳米壳聚糖涂膜处理黄瓜，与涂有单一的纳米壳聚糖膜的黄瓜相比，具有更好的理化性质和微生物指标，更好地维持了黄瓜的品质[40]。香芹酚是由牛至、百里香、马郁兰和夏得薄荷提取的主要成分，具有极强的抗菌性，被普遍认为是一种安全的食物级添加剂，用香芹酚负载纳米壳聚糖涂膜液处理鲜切胡萝卜，具有更好的保鲜效果，主要表现在，具有更好的微生物抑制能力，更好的可溶性固形物含量指标、颜色指标和感官品质指标等[41]。
4.3 肉类保鲜
肉类非常容易腐败变质，货架期普遍很短。肉制品是高蛋白质含量的食品，其水分活度较大，给微生物的繁殖生长提供了很好的条件，极易腐败[42]。壳聚糖能够在肉制品贮藏期间减缓其脂质过氧化反应的发生，并抑制腐败性细菌的繁殖，保持肉品质量的稳定性，延长肉品保存期[43]。
表3 纳米壳聚糖涂膜对蔬菜保鲜效果
Table 3 Preservative effect of nano-chitosan on vegetables
文献涂膜种类失重率硬度颜色分析可溶性固形物含量呼吸强度PPO活性微生物指标[19]400nmCSNPs较低最高颜色最重且比空白浅最低///600nmCSNPs最高较高较浅较低///800nmCSNPs最低最差颜色最浅与600nmCSNPs样品相似///[37]0.5%CSNPs1.76%//2.91%第二低最高/1%CSNPs1.17%//3.59%最低最低/1.5%CSNPs2.64%//2.61%最高第二低/1%CSNPs2.13%//2.53%第三低第三低/[38]chitosan比空白低比空白略高白色指数比空白高//比空白略低/nano-chitosan最低最高白色指数与chitosan样品相似//最低/[40]CSNPs偏高但低于空白明显高于空白对比色差为7.99/呼吸峰值为34.30mL/(kg·h)/优于空白ZEO+CSNPs最低最高对比色差为6.60/呼吸峰值为25.81mL/(kg·h)/最好
注：ZEO为扎塔里亚多花香精油
纳米壳聚糖应用于肉类保鲜中表现出良好的效果，有效延长其保质期(见表4)。用壳聚糖和纳米壳聚糖分别处理冷冻鲤鱼鱼片，结果表明，壳聚糖和纳米壳聚糖涂膜对冷冻鲤鱼鱼片均有一定的保鲜效果，但纳米壳聚糖的比表面积更大，与细菌细胞的亲和力更高，所以纳米壳聚糖的抗菌性能优于壳聚糖[44]。同样是对鲤鱼鱼片保鲜，先在桔皮和石榴果皮提取液中分别浸泡处理，再用纳米壳聚糖浸泡涂膜后，保鲜效果明显优于只用纳米壳聚糖进行涂膜处理的鱼片，且石榴皮提取物浸泡过的鱼片保鲜效果更佳[45]。纳米壳聚糖也可用于黄鳍金枪鱼的保鲜，以提高野生黄鳍金枪鱼的货架期。用纳米壳聚糖分散液浸泡黄鳍金枪鱼样品30 min，在2种不同温度(4 ℃和28 ℃)下放置，测量鱼的变质情况，包括挥发性盐基氮值(total volatile basic nitrogen，TVB-N)，细菌总数，感官评价，pH和水含量等指标。结果表明，纳米壳聚糖保鲜效果良好，一定程度上延长了贮藏期，且28 ℃时抑制细菌活性效果更为明显[46]。另外WANG等[47]比较了羧甲基壳聚糖和纳米壳聚糖涂膜对凡纳滨对虾的保鲜效果。结果表明，与羧甲基壳聚糖涂层相比，壳聚糖纳米粒子涂层对虾的品质保持效果更好，这是由于纳米壳聚糖具有更好的防腐抗氧化作用。
表4 纳米壳聚糖涂膜对肉类保鲜效果
Table 4 Preservative effect of nano-chitosan on meat
文献涂膜种类pH值TBARS值TVB-N值微生物指标感官评定[44]chitosan12d后显著低于对照组12d后低于对照组明显低于对照样品劣于nano-chitosan样品,但优于对照12d后感官品质与可接受度大大高于对照样品nano-chitosan与chitosan样品无显著差异与chitosan样品无显著差异最低对各种微生物的抑制效果均为最好与chitosan样品无显著差异[45]CSNPs相对偏高,但低于对照组偏高,但低于对照组显著降低较好12d后感官品质与可接受度大大高于对照样品但低于复合膜O+CSNPs12d后最低低于CSNPs样品与CSNPs样品无显著差异最好12d后感官品质与可接受度最高P+CSNPs与O+CSNPs样品无显著差异最低略高,但低于对照样品与CSNPs样品的无明显差异在可接受度上与O+CSNPs样品无显著差异[47]羧甲基壳聚糖与对照组无显著差异比对照组低,但高于nano-chitosan样品低于对照组,且有显著差异较nano-chitosan样品差,但优于对照组硬度和弹性较nano-chitosan样品次之,但优于对照组nano-chitosan最低最低最低总活菌数最少硬度和弹性均保持最好
注：O+CSNPs为橘皮提取物与纳米壳聚糖的复合膜，P+CSNPs为石榴皮提取物与纳米壳聚糖的复合膜，TBARS值为硫代巴比妥酸反应性物质值，TVB-N值为总挥发性盐基氮值
4.4 纳米壳聚糖在食品保鲜领域的其他应用
纳米壳聚糖除了可以用于水果，肉类和蔬菜保鲜，还可以在食品保鲜的其他领域得以应用。在牛奶中添加抗坏血酸可溶性纳米壳聚糖，可以改善牛奶品质。研究结果表明，低浓度(体积分数1%～3%)的纳米壳聚糖溶液可用于制备纳米壳聚糖乳，不会对牛奶的物理、化学和感官特性产生明显的不良影响[48]。纳米壳聚糖在食品包装中的应用已经越来越广泛，并趋向于多种类，多形式，更实用，更有效。
5 总结与展望
综上所述，纳米壳聚糖已初步应用于水果，蔬菜，肉类及其他食品的保鲜中，与壳聚糖相比，其抗菌性以及抗氧化性均有所提高，但保鲜效果依然有待进一步改善。目前纳米壳聚糖在食品保鲜方面的应用以涂膜保鲜为主，纳米壳聚糖制膜保鲜研究较为罕见。多酚类物质具有良好的抗氧化能力，常用来与壳聚糖形成共价膜或共混膜，保鲜效果可观。纳米壳聚糖有望通过同样的方法提升其保鲜性能。与壳聚糖膜相比，纳米壳聚糖膜具有更好的力学性能，但与聚乙烯及聚氯乙烯等传统保鲜膜相比，还是有很大不足，通过将纳米壳聚糖与淀粉、蛋白质等物质形成复合膜，来提高保鲜膜的机械拉伸性能，也可能是将来研究纳米壳聚糖保鲜膜的一个重要方向。除此以外，纳米壳聚糖的应用还应该朝着更多样，更大范围的方向发展，一些加工食品也可以应用纳米壳聚糖进行包装，以减轻白色污染的威胁，达到保护环境的目的。
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