肌肉中的蛋白质根据其溶解度大小分成三类:水溶性的肌浆蛋白(30%)、不溶性的胶原蛋白(10%)以及盐溶性的肌原纤维蛋白(myofibrillar protein,MP)(60%);按其所在的位置可以分为MP(55%)以及其他蛋白质(肌浆蛋白质、颗粒蛋白质以及肉基质蛋白质)。由于肉的种类不同,所含比例略有差异(其中水产类MP占比50%~70%,而畜禽类MP占比55%~60%)。不管以何种方式划分,MP不仅是含量最高的蛋白质同时也是热诱导凝胶形成最关键的蛋白质[1]。肌原纤维蛋白凝胶特性决定着糜类肉制品的感官品质(如弹性、硬度等),改善其凝胶特性一直是肉类研究的热点,而氢键、疏水相互作用、二硫键以及静电相互作用这4种化学作用力又决定了凝胶特性[2]。目前国外对蛋白质凝胶化学作用力的研究不够全面,且主要是针对共价键二硫键的研究,而针对氢键、疏水相互作用以及静电斥力研究很少,尤其是氢键。本文通过总结分析国内外肌原纤维蛋白化学作用力对凝胶特性的影响,进而探讨了凝胶形成的深层次原因,旨在为肉类凝胶制品的加工提供一定理论指导。
热诱导是蛋白质形成凝胶的重要形式之一,在加热条件下,原生态肌原纤维蛋白分子内部结构遭到破坏而发生伸展,使得其内部的一些疏水性残基和反应基团暴露,蛋白分子之间相互聚集而形成凝胶,由于蛋白分子之间的引力(氢键、疏水相互作用和二硫键)与斥力(静电相互作用)相平衡形成有序而稳定的三维网络凝胶结构,而不致形成沉淀[2]。热诱导凝胶的特性主要取决于蛋白质变性展开的速度(v展开)和聚集的速度(v聚集):当v展开>v聚集时,MP凝胶结构为有序均匀的,当v展开<v聚集时,MP凝胶结构为无序粗糙的[3]。
贮能模量(G′)和损耗模量(G″)是蛋白质动态流变性的重要指标,G′代表凝胶的弹性部分,G″代表凝胶的黏性部分。而随着温度的升高,G′和G″也会相应的发生改变,因此研究肌原纤维蛋白动态流变性是探索其热诱导凝胶形成过程的有效方法之一,同样对肉制品产品质量控制是非常重要的。
动态流变仪可用于测定肌原纤维蛋白的流变特性。由于肉的种类不同,所含的肌原纤维蛋白比例不同,其流变特性(凝胶形成温度)也略有差别。VISESSANGUAN等[4] 利用动态流变仪研究了箭齿鲽的肌球蛋白(肌原纤维蛋白的主要成分)流变性,根据G′随温度的变化,将其凝胶形成过程归为3个阶段:凝胶开始形成(0~34 ℃)、凝胶强度降低(34~40 ℃)以及凝胶强度增加(40~80 ℃)。LI等[5]发现添加凝胶多糖的鱼糜肌球蛋白的G′在36.4 ℃之前保持平稳不变,36.4~46.1 ℃迅速增长,在46.1 ℃时G′达到最大,这是由于肌球蛋白头部开始变性。46.1 ℃之后G′急剧降低,在50 ℃左右达到一个极小值,这种现象可能是由于肌球蛋白的螺旋与折叠结构相互转换,破坏了蛋白质的网络结构。随后肌球蛋白的G′从50 ℃开始缓慢增加直至80 ℃,此时蛋白质的三维凝胶网络结构形成。而王静宇等[6]研究鸡肉肌原纤维蛋白的流变特性,发现G′值开始先从20 ℃升至48 ℃,超过48 ℃之后G′值显著降低,53 ℃时最低,当温度超过53 ℃以后,G′值又快速增加。
肌原纤维蛋白凝胶的质构特性除受MP分子特性和结构特征影响之外,还受一些外在因素的影响,比如:超高压、超声波、pH、离子强度、添加物等,如表1所示。
保水性是凝胶性质中的一种重要性质。测定蛋白质凝胶保水性最常见的方法就是离心,但是离心必须在高速条件下,这样蛋白质的凝胶网络结构就会遭到破坏,从而导致所测得的保水值不够准确。而新兴的高新技术低场核磁共振,是一种无损的、非侵入式的测量高含水量样品水分分布状态和移动性的仪器,能够在不破坏凝胶结构的情况下测定凝胶中各种水的可移动性及各水分的比例,能够较好地反映凝胶保水性。保水性要符合以下情况:保留水的空间以及留住水分所需要的作用力。PUOLANNE等[17]指出蛋白质与水之间的氢键作用和毛细管作用是维持凝胶中水分主要作用力。而GUO等[18]指出0.5 mT低频磁场处理的猪肉肌原纤维热诱导凝胶的保水性最好,这是因为α-螺旋增加和β-折叠减少导致其结构发生改变,疏水作用增加,而在热诱导凝胶形成过程中,疏水作用力能形成更好的蛋白-蛋白聚集物,从而能够促进形成均一、致密结构的凝胶,最终凝胶的保水性得到提高。王静宇等[2]表明凝胶保水性的大小受其作用力影响,研究得出短时间的超声波处理(0~6 min)鸡肉肌原纤维蛋白,其凝胶保水性与疏水作用力、静电斥力以及氢键这3种作用力都随着超声时间的增加显著增加。适量的强氧化剂HClO(5 mmol/L)可有效增加猪肉肌原纤维蛋白分子表面的净电荷,从而改善其保水性[19]。
表1 质构特性的主要外在影响因素
Table 1 The main external influence factors of texture property
外在因素作用机理质构特性参考文献超高压通过影响蛋白质分子结构,压力过高则加速蛋白质变性速,反而分子间的相互作用力减小,致使分子间交联度降低,凝胶品质降低。200MPa压力下鸡肉肌原纤维蛋白热诱导形成的凝胶强度最好[7]450MPa处理可以改善低盐鱼糜制品凝胶品质[8]超声波超声波产生的空穴效应以及微束流能够破坏蛋白分子间的作用力,从而引起蛋白质凝胶质构特性的改变。超声6min时鸡肉肌原纤维蛋白热诱导凝胶的交联结合紧密,凝胶的硬度和弹性均增强[9]超声3min后的鲣鱼肌原纤维蛋白凝胶质构特性(硬度、弹性、凝聚性))明显降低[10]pHpH改变会引起蛋白分子静电相互作用的改变,导致蛋白质氨基酸侧链的解离受到影响pH6.0时猪肉肌原纤维蛋白热诱导凝胶硬度最大[11]pH6.0时羊肉肌原纤维蛋白热诱导凝胶硬度最小[12]离子强度高离子强度可能屏蔽蛋白质表面的电荷,使得分子之间的排斥力减弱,相应地增强了蛋白质分子之间的疏水相互作用,进而改善质构特性。离子强度(0.2~0.6)的增加,鸡肉肌原纤维蛋白热诱导凝胶的硬度和弹性也不断增大[13]三聚磷酸盐质量分数为0.15%的条件下用γ-聚谷氨酸复合谷氨酰胺转胺酶处理鸡胸肉肌原纤维蛋白凝胶硬度和弹性均最好[14]添加物脂肪中含有多种脂肪酸,能够促进凝胶网络的形成;马铃薯淀粉中支链淀粉比直链淀粉多,且淀粉的糊化温度在60℃左右,随着温度的升高,增加了淀粉与蛋白质之间的交联作用,从而改善了蛋白凝胶的质构特性。添加少量的脂肪(0.20%)于鸡肉肌原纤维蛋白中,会增加其凝胶硬度[15]在70℃条件下添加4%马铃薯淀粉的鲤鱼凝胶的弹性百分比增加量最大[16]
在MP热诱导凝胶形成过程中,化学作用力(氢键、静电相互作用、疏水相互作用和二硫键)是决定蛋白凝胶特性的关键因素。ZHOU等[20]通过高速剪切力对肌原纤维蛋白与低脂形成的混合凝胶进行研究发现,蛋白质热诱导凝胶形成过程中的主要作用力是氢键、静电斥力和疏水相互作用,而不是二硫键。IWAMI等[21]在研究鲑鱼肌原纤维蛋白热凝胶过程时,推测疏水相互作用和静电相互作用是肌原纤维蛋白交联形成具有三维网络结构的凝胶的主要作用力。张兴等[22]通过添加尿素研究了鸡肉肌原纤维蛋白热诱导凝胶形成过程,也认为静电相互作用和疏水相互作用比氢键的作用更重要。LIU等[23]研究了鱼肉和猪肉肉糜在加热过程中蛋白分子间的相互作用,发现当温度达到25 ℃时,肉糜凝胶中的氢键数量迅速改变。
由于蛋白质原材料、处理手段等的不同,使得每种化学作用力在凝胶形成过程中的作用存在差异,但普遍认为在凝胶形成过程中,非共价键(氢键、静电相互作用和疏水相互作用)作用大于共价键(二硫键),后者只延长了蛋白质分子的链长,对形成或维持其凝胶网络结构没有作用[24]。化学作用力与蛋白质结构也是息息相关的。蛋白质一级结构主要依靠肽键和二硫键连接,氢键是稳定二级结构的主要作用力,尤其是α-螺旋结构,而维持三级和四级结构的作用力主要是二硫键和疏水相互作用。而MP热诱导凝胶的形成正是因为加热使得原始肌原纤维蛋白分子内部结构遭到破坏而发生伸展,其埋藏在分子内部的巯基和疏水基团暴露,蛋白分子间的化学作用力达到平衡,从而形成了有序而稳定的三维网络凝胶结构。
研究不同的作用力需要用不同的方法,但目前对这4种作用力的测定方法研究还不够完善。其中二硫键测定方法的研究是最多的,静电斥力和疏水相互作用次之,氢键最少,而且研究不够全面和深入。
二硫键属于共价化学键,国内外针对蛋白质凝胶中二硫键的研究最多,相应的测定方法也是最成熟的,其中利用总巯基和活性巯基含量变化来表征二硫键的变化是最常见的;也可以通过添加化学试剂影响二硫键的作用。最近研究发现SDS-PAGE技术以及拉曼光谱也可以用来研究蛋白质分子的二硫键。
许多学者通过巯基含量变化研究了肌原纤维蛋白与其主要成分肌球蛋白凝胶形成过程中二硫键的变化,总巯基含量指暴露在蛋白表面和埋藏在蛋白分子内的巯基,而活性巯基指暴露在蛋白分子表面的巯基。YONGSAWATDIGU等[25]指出马鲅鱼肌动球蛋白在整个加热过程中(5~90 ℃),总巯基含量先保持不变(5~30 ℃),之后逐渐降低(40~90 ℃),而活性巯基含量先增加后降低, 50 ℃达到最大值,可能是随加热温度的上升,蛋白分子逐渐展开,内部巯基逐渐暴露出来,使活性巯基含量达到最大并促进蛋白分子内部的巯基形成二硫键。RIEBROY等[26]通过研究鳕鱼肌动球蛋白酸诱导凝胶形成过程,猜测二硫键的形成是因为巯基基团氧化,从而导致总巯基含量的减少。VISESSANGUA等[27]对箭齿鲽肌球蛋白热诱导凝胶形成过程进行研究,也得出同样的结论。ZHANG等[28]指出超声波能够使水分子解离出高活性的自由基(H2O→·H+·OH),进而反应生成的过氧化氢很容易把蛋白质中的巯基氧化成二硫键,导致总巯基减少。
添加化学试剂也可以影响二硫键的变化,最常见的就是添加化学试剂二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol,DTT),这是因为其可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。SMYTH等[29]通过添加DTT于鸡胸肉肌球蛋白中来研究其热诱导凝胶形成过程,发现二硫键存在与否,鸡胸肉肌球蛋白凝胶都可形成,但二硫键存在时,有助于凝胶网络结构的形成。LIU等[30]通过添加DTT研究了大豆分离蛋白间的相互作用,也得出了同样结论。有人曾使用FeCl3、H2O2、抗坏血酸盐等氧化蛋白质中的活性巯基,导致二硫键的形成[31]。
SDS-PAGE技术近年来被用于研究蛋白质中的二硫键。KO等[32]通过SDS-PAGE电泳对热变性后的罗非鱼肌动球蛋白分子质量进行测定时,发现当温度达到75 ℃后发现有聚合物生成,并进一步指出75 ℃以上的热聚集主要归功于二硫键。潘锦锋等[33]以1 ℃/min的升温速率加热草鱼肌原纤维蛋白溶液进行研究,其SDS-PAGE电泳结果表明肌球蛋白重链随着温度的上升而减少,同时分离胶上方还有一定的大分子物质生成,即草鱼肌原纤维蛋白在加热过程中(>45 ℃时)产生了二硫键。
拉曼光谱是一种新型技术,广泛应用于研究分子结构,属于分子振动光谱,可以提供分子振动信息,具有分辨振动频率强,测定方法简单且不损坏样品等优点。二硫键(S—S)会发生伸缩振动,在拉曼光谱的谱峰中会显示二硫键的3种构象,在510 cm-1处是扭式-扭式-扭式(g-g-g)构象;525 cm-1处是扭曲-扭曲-反式(g-g-t)构象,540 cm-1处是反式-扭曲-反式(t-g-t)构象[34],如表2所示。因此拉曼光谱中500~550 cm-1附近的酰胺Ⅲ氨基酸侧链的伸缩振动可以反映S—S三种构象的变化,从而引起二硫键的改变。WANG等[9]通过拉曼光谱分析发现经不同时间的超声处理,二硫键扭曲-扭曲-反式(g-g-t)构象的伸缩振动均会显著增强。
表2 拉曼光谱中二硫键构象谱图分析
Table 2 Analysis of disulfide bond conformation in Raman spectra
来源波数/cm-1指认结构信息胱氨酸 510S—S伸缩振动扭式-扭式-扭式S—S构象半胱氨酸525S—S伸缩振动扭式-扭式-反式S—S构象蛋氨酸 540S—S伸缩振动反式-扭式-反式S—S构象
疏水相互作用是指蛋白质在水溶液中由水结构诱导的非极性基团之间的相互作用。普遍认为疏水作用力是蛋白凝胶形成过程中最主要的作用力之一。RELKIN等[35]研究发现在加热条件下蛋白质分子内部包埋的多肽链就会暴露到表面,是相邻多肽链间的疏水作用力增强的最主要原因。VISESSANGUAN等[27]通过研究箭齿鲽肌球蛋白的热诱导形成凝胶过程,得出即使在高温条件下,疏水相互作用也是凝胶形成过程中的主要化学作用力。疏水性氨基酸的暴露为蛋白质提供了表面疏水性,能够反映蛋白质分子微观构象的变化,因此疏水作用力可以用其来衡量[36]。荧光分光光度法通常可用来测定疏水作用力[34]。8-苯氨基-1-萘磺酸铵盐作为一个疏水性荧光探针,被用于通过与蛋白质的疏水区域结合来监测蛋白质构象变化[37]。王静宇等[2]研究表明适度的超声波(0~6 min)处理,显著增强了肌原纤维蛋白凝胶的表面疏水性。
近期发现拉曼光谱也可以测定蛋白质的疏水相互作用,其既能反映蛋白质主链的骨架振动,也能反映其侧链周围微环境的变化。由于苯丙氨酸的强度不随蛋白质结构的变化而发生改变,因此可以根据其在拉曼光谱1 003 cm-1处伸缩振动的强度作为内标进行归一化,其中以色氨酸疏水残基的760 cm-1处的归一化强度(I760/I1003)反映蛋白的疏水性[38]。ZHANG等[39]研究了在低钠和不同盐替代NaCl条件下MP凝胶的拉曼光谱变化情况,数据显示常规钠组(0.6 mol/L NaCl)凝胶在760 cm-1处归一化强度显著高于低钠组(0.4 mol/L NaCl),由此得出低浓度的钠盐会减弱MP热诱导凝胶的疏水相互作用的结论。
静电相互作用是肌原纤维蛋白形成凝胶的重要作用力。由加热形成的肌原纤维蛋白凝胶网络结构是蛋白质分子中引力和斥力平衡的结果,蛋白质分子受热打开,内部的功能基团暴露出来形成引力,而蛋白质分子表面电荷形成斥力[40]。一般在蛋白质聚集过程中,静电相互作用常表现为静电斥力。远离等电点时,蛋白质分子表面的正电荷与负电荷数目不等,此时静电斥力作用最大,蛋白质表面的氢键结合位点增加,氢键作用增强,因此蛋白质多肽链结构中的非共价键平衡被打破,疏水相互作用减弱,导致蛋白质分子中引力和斥力不平衡,不利于形成均一稳定的肌原纤维蛋白凝胶网络结构。而在等电点附近时,刚好相反,排斥的静电相互作用和吸引的疏水相互作用、分子间的氢键作用以及二硫键能保持很好的平衡,有利于形成均一稳定的肌原纤维蛋白凝胶网络结构[11]。
静电相互作用常用的测定方法是Zeta电位。因其能测定蛋白质表面电荷的电位,常用于解释蛋白质凝胶颗粒间的静电相互作用。ZHANG等[41]研究发现经超高压处理后的肌原纤维蛋白再经热处理凝胶化后,Zeta电位的绝对值持续升高,这是由于超高压能够破坏蛋白聚集体,并使蛋白质分子链逐渐展开,暴露更多的疏水基团、带电基团和羟基等极性基团,导致蛋白分子间静电斥力增强。
通常情况下,大量的氢键用以维系蛋白质的各级结构,同时其在凝胶结构和黏弹性的形成方面也起重要作用。针对氢键在蛋白质凝胶形成中的作用,说法不一。倪娜等[12]通过改变pH来研究羔羊背最长肌肌原纤维蛋白,发现pH为7.5时,疏水相互作用是形成凝胶最主要的作用力,但pH对氢键具有较大影响。SHIGERU等[42]通过对大豆蛋白热诱导凝胶形成过程的研究,提出在凝胶网络结构的形成和维持中,起到最重要作用的是氢键,而不是其他化学作用力(二硫键等)。
在肌原纤维蛋白热诱导凝胶形成过程中,对各种化学作用力的研究,很少有针对氢键的研究报道。原因可能包括两个方面,一方面是肌原纤维蛋白分子处在一个复杂的环境溶液中,因此氢键既能作用于蛋白分子内部也能作用于蛋白分子之间,同时也能作用于蛋白分子与其所在溶剂之间;第二是很难定量测定氢键作用。
研究表明酰胺、氨基酸和羟基这3个基元是产生氢键的最重要基团[43]。而含有氨基酸(NH2—CH—COOH)的衍生物可以在一定条件下转化为含有酰胺基元(—CO—NH2)的衍生物,后者的CO和N—H可以形成分子间氢键,进而可以通过测定酰胺或者羟基基团(—OH)的变化来间接研究分子间氢键。CAO等[44]利用傅里叶变换红外光谱技术研究苯甲酰肼衍生物形成凝胶的过程,发现酰基肼中的N—H与CO间形成N—H…CO氢键是凝胶形成的重要作用力。BADDI等[45]指出有机溶剂形成的凝胶与具有特定NCO/OH比例的合成聚合物有关,且傅里叶变换红外光谱确定了酰胺基团间的氢键作用。然而目前为止还没有关于傅里叶变换红外光谱技术应用在蛋白质凝胶中氢键作用力测定的研究,更多的是研究蛋白质二级结构的改变。近期发现拉曼光谱可以用于检测蛋白质凝胶中的氢键,这是因为酪氨酸是一种含有酚羟基的氨基酸,能够与水或者其他基团形成氢键,其在拉曼光谱图中850 cm-1和830 cm-1附近会出现2个谱峰,而I850/I830比值的变化情况可以反映MP凝胶中氢键变化[41]。张兴等[22]同样在拉曼光谱图中,根据I850/I830比值发生改变,得出不同浓度尿素处理对鸡肉蛋白热诱导凝胶形成过程中氢键的影响。
肌原纤维蛋白的凝胶特性决定着肉制品的质量,而化学作用力(疏水相互作用、静电相互作用、氢键以及二硫键)决定着蛋白质的凝胶特性。我们可以通过一些物理(超声波、超高压等)或者化学(尿素、pH等)方法来改变肌原纤维蛋白凝胶化学作用力,进而改变其凝胶特性,找出最优处理条件,从而为糜类凝胶制品(香肠、丸子等)实际生产应用提供参考。因此研究化学作用力对肌原纤维蛋白凝胶特性的影响至关重要。目前国内外对蛋白质凝胶化学作用力的研究不够全面,且主要是针对共价键二硫键的研究,但针对氢键、疏水相互作用以及静电斥力研究很少。因此现阶段对肌原纤维蛋白凝胶形成的主要化学作用力还不够深入,且方法单一,尤其是氢键。酰胺(—CO—NH2)、氨基酸(NH2—CH—COOH)和羟基(—OH)是最重要的氢键给体与受体,因此可以根据测定这3个基团的改变来间接研究肌原纤维蛋白热诱导凝胶中氢键的变化。现已有利用拉曼光谱技术,基于酪氨酸上的酚羟基与水形成氢键的原因来研究蛋白质凝胶中氢键的改变。近些年各种检测技术手段的更新发展,比如近红外光谱技术,它可以确定酰胺基团间的氢键作用,反过来我们也可以把这种技术应用在蛋白质凝胶中氢键的研究。由于蛋白质分子相互作用决定其结构变化,且多个酰氨基团在分子中的位置对于凝胶的理化性质也有很大影响,因此我们也可以更加深入地从蛋白质分子官能团结构角度认识及解释化学作用力在凝胶形成过程中的具体变化,进而引起凝胶特性的改变,这将为糜类肉制品品质的进一步改善提供理论依据。
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