冬瓜(Benincasa hispida，(Thunb.) cogn.)是我国热带和亚热带地区普遍种植的蔬菜作物。近年来，鲜切加工和包装的冬瓜片越来越受到人们的欢迎。鲜切蔬菜指经过清洗、修整、分切、保鲜和包装等步骤，可以直接用于鲜食或烹饪，而没有经过热加工的蔬菜制品。鲜切蔬菜具有方便、卫生等特点，但其工艺可能带来更大的微生物污染风险[1]。同时，由于鲜切蔬菜对于品质的要求较高，传统的高温杀菌技术对于鲜切蔬菜并不完全适用[2]。因此，开发新型保鲜方法，有效延长鲜切冬瓜的保质期，建立可靠的鲜切冬瓜微生物数量预测模型，降低食源致病微生物带来的食品安全风险势在必行。
超声波处理会在液体中产生交替的低压和高压波，造成剧烈的气泡形成和溃灭，强烈的剪切力、瞬时高压和高温可以击穿微生物的细胞壁和细胞膜，将超声波处理与致死温度或亚致死温度结合使用，就是所谓的热超声技术(thermosonication, TS)。与传统的热处理方法相比，它使用的温度更低，处理时间更短，能保持更好的产品风味、质地和外观[3-4]。当与化学或生物杀菌剂一起使用时，热超声处理可以提高杀菌剂穿透细胞膜的效率，从而提高杀菌剂的杀菌效率[5-6]。茶多酚(tea polyphenols, TP)是从茶叶中提取的多酚物质，具有抗氧化、抗癌、抗病毒、抗菌等多种生理功能[7-8]。作为一种食品添加剂，茶多酚已经被广泛应用于多种食品的保鲜和加工[9-11]，表现出较好的效果。茶多酚结合热超声处理，有望在较低的温度和较短的时间下取得较好的杀菌效果，同时减少杀菌剂的使用剂量，保持更好的产品品质。
自适应神经模糊推理系统(adaptive neuro-fuzzy inference system，ANFIS)是一种融合人工神经网络(artificial neural networks，ANN)和模糊推理系统(fuzzy inference systems，FIS)优点的协同混合系统。它采用混合学习方法，从输入输出数据对中生成一组具有适当隶属函数(membership function, MF)的模糊因果(if-then)规则。ANFIS具有训练速度快、收敛速度快、学习效果好等优点，已被用作农业和食品技术中的建模和预测工具[12-13]。
沙门氏菌是公共卫生学上具有重要意义的食源性致病菌，据统计在世界各国的细菌性食物中毒事件中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首，中国内陆地区细菌性食物中毒也常以沙门氏菌为首位，国家标准要求多数食品中不得检出沙门氏菌。本研究的目的是探索茶多酚联合热超声处理对鲜切冬瓜贮藏过程中沙门氏菌菌落数量的影响，研究冬瓜在不同储藏温度下沙门氏菌数量变化的规律，并建立和评估具有不同隶属函数的ANFIS菌落数量预测模型。
新鲜冬瓜购自本地的农贸市场;茶多酚购自国药集团化学试剂有限公司;胰蛋白胨大豆肉汤(tryptic soy broth，TSB)、缓冲蛋白胨水(BPW)和木糖赖氨酸Tergitol 4琼脂(xylose-lysine-tergitol 4，XLT4)购自北京索莱宝(Solarbio)科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯;沙门氏菌菌株ATCC 9270(肠沙门氏菌肠亚种 鸭血清型，Salmonella enterica subsp. enterica serovar Anatum)、ATCC 13076(肠沙门氏菌肠亚种肠炎血清型，Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis)和ATCC 14028(肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型，Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium)为标准菌株，保藏于本实验室。
生物安全柜(BSC-04IIB2)，苏净安泰；恒温培养箱(BPMJ-70F)，上海一恒；小型高速离心机(HICO21)，上海生工；超低温冰箱(Forma 905)，赛默飞世尔；台式超声破碎仪，力辰科技；无菌拍打式均质机(HX-4)，上海沪析。
将3株沙门氏菌菌株ATCC 9270、ATCC 13076和ATCC 14028分别在37 ℃的TSB培养基中培养至指数期，离心分离。将细菌细胞重新悬浮于BPW中，然后将3株沙门氏菌等量均匀混合，形成沙门氏菌混合液。用BPW连续10倍稀释菌体混合液，取0.1 mL不同浓度菌体稀释液涂抹在XLT4琼脂平板，并在37 ℃下孵育，以计数沙门氏菌菌落，制成最终细胞浓度约为9.0 lg CFU/mL的沙门氏菌菌液。
冬瓜清洗后使用无菌刀板切成10 g左右同等尺寸的小块，放在无菌生物安全柜中晾10 min。随后，用无菌微量吸管将50 μL新鲜沙门氏菌混合液均匀接种于冬瓜样品表面，在生物安全柜内干燥30 min，以确保细菌充分吸附到样品表面。然后将样品翻转，在样品的另一侧重复相同的操作。经上述操作接种后，沙门氏菌的初始水平大约为7.0 lg CFU/g。对照组样品采用了与上述类似的程序进行处理，仅稀释倍数有差异，其初始沙门氏菌水平为4.6 lg CFU/g(与热超声茶多酚联合处理后的处理组样品菌落数量相等)。沙门氏菌的准确浓度经连续梯度稀释后，采用XLT4平板计数确认，计数方法参见1.6沙门氏菌计数。
使用台式超声波破碎仪进行热超声处理。将接种的样品与去离子水按样品∶水=1∶3(w/v)的比例放置在无菌的超声波破碎仪中，400 W功率下，50 ℃处理1 min。立即将冬瓜样品从去离子水中取出，在20 ℃的质量浓度为10 g/L的茶多酚溶液中浸泡5 min，样品与茶多酚溶液的比例为1∶3(g∶mL)，随后样品放置在生物安全柜中约10 min以除去过量的液体。处理后，立即将样品置于无菌均质袋内，密封保存在(4±1)、(10±1)和(25±1) ℃的温度下，初始沙门氏菌水平约为4.6 lg CFU/g的对照样品未经处理，保存在相同的条件下，定期取样计数沙门氏菌。
在每个含有10 g样品的均质袋中加入90 mL BPW，密封后放入无菌均质机中，持续60 s均质2次。将均质机产生的匀浆在BPW中连续梯度稀释，并取每个梯度的稀释液0.1 mL涂布到XLT4琼脂上，在37 ℃下培养24 h，以计数菌落。XLT4琼脂是针对沙门氏菌的选择性培养基，其在XLT4上显示特异性的颜色和菌落特征，通常为黑色或黑色为中心的菌落，便于鉴别和计数。
ANFIS系统基于模糊推理系统的神经网络来生成和优化决策规则。如图1所示，在ANFIS体系结构的5层中，第1层是模糊化层，该层中的节点是具有隶属函数的自适应节点，其参数称为前件参数。第4层是去模糊层，该层中的节点是具有隶属函数的自适应节点。其参数称为后件参数。第2、3和5层分别是规则层、规范化层和输出层，其节点是固定节点。本文采用最小二乘法(least-squares algorithms，LS)和反向传播法(back-propagation algorithms，BP)相结合的混合训练方法，尝试选择8种不同的隶属函数类型，对ANFIS模型的前件参数和后件参数进行优化。
模型构建通过Matlab 2016a的ANFIS工具箱进行。将处理组实验数据输入软件，每个输入/输出数据对包含2个输入值(存储温度和存储天数)和1个输出值(沙门氏菌菌落数量)。实验数据对被随机分入训练集(60%)，验证集(18%)和预测集(22%)。利用预测值与实验值线性回归曲线的确定系数(R2)和均方根误差(RMSE)估计ANFIS模型的预测性能。用SPSS v17.0统计软件对预测值与实验值进行线性回归分析。
a-自适应神经模糊推理系统的结构和算法；b-本研究中ANFIS模型的构成
图1 自适应神经模糊推理系统结构
Fig.1 Adaptive neuro-fuzzy interface system architecture
茶多酚是从茶叶中提取的多酚类物质，具有广谱的抗菌性，茶多酚能够抑制细菌生物膜的形成，降低对宿主的吸附能力，中和细菌毒素，降低细菌对宿主的致病性[7]。沙门氏菌是最为多发的食源性致病菌之一，本研究以沙门氏菌为例，研究热超声和茶多酚联合处理对鲜切冬瓜中致病菌数量的影响。由于冬瓜内部通常是无菌的，实验中测得的沙门氏菌均来自于人工接种。接种的鲜切冬瓜片经热超声和茶多酚联合处理后，在25、10和4 ℃下贮藏。用平板计数法监测沙门氏菌菌落数量，结果如图2所示。
a-4 ℃；b-10 ℃；c-25 ℃
图2 鲜切冬瓜在不同温度下贮藏时沙门氏菌菌落数量
Fig.2 Salmonella populations in fresh-cut wax gourd during storage at different temperatures
处理前沙门氏菌菌落数量约为(6.80±0.04)lg CFU/g，处理后约为(4.58±0.08)lg CFU/g，即热超声和茶多酚联合处理可以有效地将鲜切冬瓜中沙门氏菌的数量减少约2.20 lg CFU/g (P<0.05)。储藏过程中，处理组的样本沙门氏菌数量绝大多数情况下均显著低于相应的对照组(P<0.05)。在4 ℃下(图2-a)，两组样品菌落数量均呈现先下降后平稳的趋势；处理组在最初的7 d内迅速下降，在随后几天内围绕在2.50 lg CFU/g上下波动；对照组在前8 d内显著下降，在随后的几天内围绕在3.50 lg CFU/g上下波动。在10 ℃下(图2-b)，处理组菌落数量在第1天内显著减少约0.40 lg CFU/g(P<0.05)，在第2～5天内缓慢下降，然后在剩余的几天内围绕4.0 lg CFU/g上下波动；对照组菌落数量呈现非常缓慢的增长趋势。在25 ℃下(图2-c)，两组样品菌落数量均呈现先上升后下降的趋势；对照组样品各阶段到来时间较早。
在不同的水果和蔬菜中，沙门氏菌数量在储藏过程的规律有差异。STRAWN等[14]报道了芒果和番木瓜中沙门氏菌的数量变化情况；火龙果中的情况与番木瓜相似[15]；SANT'ANA等[16]报道了9种即食蔬菜中沙门氏菌的生长情况；FENG等[17]报道了7种鲜切水果中沙门氏菌的生长情况；本研究首次报道了鲜切冬瓜中沙门氏菌生长情况。冬瓜和其他大多数水果蔬菜在4 ℃下储藏时，沙门氏菌菌落数量保持不变或下降，在10～15 ℃下菌落数量显著大于4 ℃，并且根据水果和蔬菜种类的不同，呈现上升或下降等不同的趋势。在25 ℃下，菌落数量显著高于4 ℃和10～15 ℃，并且绝大多数呈现明显的增长趋势。因此，储藏温度对于沙门氏菌的生长具有非常巨大的影响，低温是抑制鲜切果蔬沙门氏菌生长、保证食品安全的重要保障。10～15 ℃下沙门氏菌呈现的不同生长趋势，可能与水果和蔬菜本身的性质有关，例如果蔬的pH、含水量、含糖量、质地、是否含有抗菌物质等。
热超声的杀菌效果好于单独使用超声波和较高的温度；茶多酚是一种来源于茶叶的非挥发性天然提取物，安全性好，可以留存在储藏的全过程中，起到持续的抑菌作用。本研究中，处理组的样本沙门氏菌数量在不同储藏条件下均显著低于相应的对照组(P<0.05)。特别是在10 ℃贮藏时，对照样品中沙门氏菌菌落数量仍呈现缓慢的增长趋势，而处理组样品中沙门氏菌菌落数量已呈现明显的下降趋势。可见，热超声和茶多酚联合处理能够显著减少鲜切冬瓜中沙门氏菌的数量，并且在储藏过程中持续抑制冬瓜保鲜过程中沙门氏菌的生长，保持较好的蔬菜品质，是一种具有较大应用潜力的蔬菜保鲜技术。
采用ANFIS系统对鲜切冬瓜中沙门氏菌生长数据进行拟合和预测。经过优化，模型的每个输入变量采用2个隶属函数，生成8个因果规则，并测试了8种不同类型的隶属函数的建模效果。模型在训练和预测阶段的预测数值和处理组实验数据之间的相关性如图3所示，模型训练和预测阶段的RMSE和R2如表1所示，各模型的输出值的分布曲面如图4所示。
图3中，采用不同隶属函数构建的ANFIS模型，训练和预测阶段的各数据点呈现集中的线性分布，数据点与其回归直线距离较近，训练和预测阶段的回归直线高度重合，这表明ANFIS模型在训练和预测阶段的稳定性和一致性较好。
由表1可见，采用不同隶属函数构建的模型，其RMSE均小于0.2，R2>0.98，表明ANFIS系统能较好地预测不同贮藏温度下鲜切冬瓜沙门氏菌的数量。根据RMSE越小越好、R2越大越好的原则可见，在训练阶段dsigmf和psigmf函数的性能最好，而在预测阶段，gaussmf函数的性能最好。
(a)trimf，(b)trapmf，(c)gbellmf，(d)gaussmf，(e)gauss2mf，(f)pimf，(g)dsigmf和(h)psigmf(下同) 图3 热超声和茶多酚处理的鲜切冬瓜在贮藏过程中，沙门氏菌数量实验值与采用不同隶属函数得到的ANFIS模型预测值的相关性
Fig.3 Correlation between experimental and predictedSalmonella population in fresh-cut wax guard treated by thermosonication and tea polyphenol during storage using the ANFIS models
注：ANFIS模型在预测阶段(○)和训练阶段(*)的回归直线分别用黑色和灰色表示，其相应的决定系数(R2)分别标记
在回归直线上侧和下侧
表1 采用不同类型的隶属函数生成的ANFIS模型，在训练和预测阶段对沙门氏菌数量预测值的均方根误差和决定系数
Table 1 RMSE and R2 for Salmonella populations byANFIS models generated with different types of inputmembership functions (MFs) at training and predictionphases
隶属函数类型训练阶段预测阶段RMSER2RMSER2trimf0.139 1910.988 00.169 3710.985 0trapmf0.088 0610.995 20.180 5520.981 1gbellmf0.089 3100.995 00.135 8130.989 5gaussmf0.104 2090.993 30.124 5910.992 1gauss2mf0.087 7660.995 20.172 6130.982 8pimf0.095 8070.994 30.193 5900.978 9dsigmf0.083 9480.995 70.161 5550.986 1psigmf0.083 9490.995 70.161 5600.986 1
为直观地展示各模型的预测值是否符合实际情况和一般经验，把不同隶属函数构建的模型输出值(即预测值)绘制成曲面，如图4所示。由图4可见，各隶属函数之间差异较大，gaussmf隶属函数构建的模型，其输出值的曲面最为平滑，没有不必要的波动，且不同温度下的曲线形态与实验值形态最接近。
图4 采用不同隶属函数构建的ANFIS模型输出值的分布曲面
Fig.4 Output surface of ANFIS model with different membership functions
结合图3、图4和表1的结果可知，采用gaussmf隶属函数构建的ANFIS模型的综合性能优于其他隶属模型，其输出值的分布曲面更加符合实验数值和一般经验。因此，建议采用gaussmf隶属函数构建ANFIS模型对处理组进行菌落数量预测，得到的沙门氏菌菌落预测曲线和实验值如图5所示。从图5中可见，在3种储藏温度下，预测曲线均能够准确反映实验值的变化规律，预测效果较好。
图5 茶多酚和热超声联合处理后的冬瓜在不同温度储藏过程中沙门氏菌数量实验值及其ANFIS预测值
Fig.5 Observed and predicted Salmonella population in fresh-cut wax gourd treated by thermosonication and tea polyphenol during storage at different temperatures
常用的描述微生物生长的数学模型和公式有很多，如Gompertz模型[18]、Baranyi模型[19]和Huang模型[20-21]等。这些模型最适宜的拟合场景是由滞后期、指数期和平稳期组成的S型增长曲线，并且在提供某些函数的物理学或生物学意义方面具有优势。但是，上述模型具有内在的局限性。其一，这些模型通常用来描述增长曲线，在预测复杂多变的微生物种群曲线方面的应用可能受到限制，如不适用于下降曲线等。这意味着条件发生改变时，需要重新设置模型参数，或者使用多种不同类型的模型进行拟合和预测。其二，操作人员需要具备特定的专业知识，才能理解上述模型中某些关键函数和参数的物理学或生物学意义，这对模型的推广应用带来了一定的限制。
基于模糊推理建立的ANFIS模型，采用人工神经网络进行自主学习，使用输入和输出的数据对优化各项参数，自动生成因果规则，虽然无法提供明确的公式，但同时也不需要操作人员具有复杂相关背景知识。因此，它可以方便地应用于各种情况，有望成为模拟和预测微生物数量和食品保质期的有力工具。
热超声和茶多酚联合处理能够显著减少鲜切冬瓜中沙门氏菌的数量，在25、10和4 ℃储藏过程中，持续抑制冬瓜保鲜过程中沙门氏菌的生长，是一种具有较大应用潜力的蔬菜保鲜技术。本文建立的ANFIS模型，每个输入变量采用2个隶属函数，生成8个因果规则，最佳的隶属函数类型为gaussmf，采用该函数构建的模型RMSE<0.2，R2>0.99，能较好地预测不同贮藏温度下鲜切冬瓜中沙门氏菌的数量。该模型采用人工神经网络进行自主学习，自动生成因果规则，不需要操作人员具有复杂相关背景知识，能够适用于各种微生物增长和衰亡曲线，有望成为预测微生物数量和食品保质期的有力工具。
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