苯乳酸(phenyllactic acid，PLA)是一种小分子化合物，具有广谱抗菌的性能，能够抑制某些革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长[1-3]，具有良好的溶解性，在食品中易于扩散，且在较宽pH范围内能够保持稳定[1]，有望开发成一种新型的食品抗菌剂。苯乳酸存在于奶酪等乳制品[2]、发酵面团[3]和新西兰麦卢卡蜂蜜中[4]。可由乳酸菌[5]、白地霉[6]、丙酸杆菌[7]等合成，由于乳酸菌在食品工业中应用普遍且一般公认安全(generally recognized as safe，GRAS)，其作为主要的苯乳酸合成菌株的研究越来越深入并广泛。苯乳酸能够随乳酸菌的发酵生成，近年来有研究显示，苯乳酸存在于四川泡菜[8]和韩国泡菜中[9]。
目前苯乳酸的检测方法主要有HPLC法[10-11]、UPLC-MS/MS法[9]、薄层层析法[12]和气相色谱法[13]。UPLC-MS/MS法设备昂贵，成本较高；气相色谱法检测灵敏，但发酵液需冻干后酯化，前处理复杂；HPLC法由于前处理简单，准确度高，应用较为广泛。有研究对比了前处理对HPLC法检测乳酸菌发酵液中苯乳酸的影响，发现样品通过固相萃取柱后回收率为63.2%，微滤后直接进样回收率为98.7%，乳酸菌发酵液不适于使用固相萃取柱[14]。以上这些方法主要针对于测定乳酸菌纯菌发酵液中的苯乳酸[10,12-14]，而目前对测定食品中苯乳酸含量的研究较少，因发酵食品多为混合菌种发酵[15-16]，成分较多。有研究表明，泡辣椒在发酵过程共产生7类，56种化合物[17]；江米酒中被发现含有乙酸、柠檬酸、琥珀酸、乳酸、苹果酸和乌头酸6种有机酸[18]；王娟娟等[19]利用HPLC法在210 nm波长下检出酸菜含有草酸、苹果酸、乳酸、乙酸4种有机酸，其中乳酸和乙酸在5～7 min出峰，出峰时间间隔不到1 min，前处理步骤需要进行8 h的离子交换。HPLC法测定苯乳酸的检测波长为210 nm[14]，如采用传统HPLC法测定发酵食品中的苯乳酸，可能会有前处理繁琐、目标峰与杂质峰相连等问题，影响目标峰的辨认，造成定量误差大。
近年来，在线2D-HPLC法越来越多的应用于复杂体系分析，因其能简化前处理步骤[20]，改善基质效应[21]，且复杂基质样品可直接进样。目标物质与杂质的分离程度对HPLC法检测至关重要，同时要求良好的灵敏度和重现性。二维色谱峰容量大、与杂质峰的分离程度更好、灵敏度高，能够提高分离效率，适用于成分较多的发酵食品[22]。2D-HPLC目前广泛应用于食品领域，有研究利用2D-HPLC检测奶粉中牛磺酸[23]和脂溶性维生素[24-25]，发现目标峰与杂质分离彻底、前处理步骤少、抗干扰能力强，避免了食品中其他成分对目标峰造成干扰，检测灵敏，结果准确。
本实验拟建立一种在线2D-HPLC检测方法，用于检测发酵食品中的苯乳酸，并对市售的酸奶、东北酸菜、甜米酒、酱黄瓜和广式腊肠中苯乳酸的含量进行了测定，并利用UPLC-MS/MS对样品中的苯乳酸存在性进行验证。
PLA标准品(纯度>98%)，上海子起生物科技有限公司；甲酸、三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA)、乙腈、甲醇(色谱纯)，美国Fisher公司；α-淀粉酶，上海普誉科贸有限公司；甜米酒、东北酸菜、广式腊肠、酸奶、酱黄瓜，上海麦德龙超市。
Agilent-1260高效液相色谱仪，配六通阀和柱温箱，1D-HPLC为Agilent-1260四元泵，可变波长检测器(Variable wavelength detector，VWD)，2D-HPLC为二元泵，二极管阵列检测器(Diode array detector，DAD)，美国Agilent公司；ACQUITY H-CLASS 超高液相色谱仪、ACQUITY UPLC Xevo TQ-XS三重四极杆质谱仪，美国Waters公司；SY-601恒温水浴锅，天津欧诺仪器仪表有限公司；SL-16超声波水浴锅，江苏盛蓝仪器制造有限公司。
1.3.1 标准溶液的配制
准确称取0.01 g PLA 标准品于100 mL容量瓶中，制成100 mg/L的PLA标准储备液，避光4 ℃储存。准确吸取标准储备液稀释至0.40、0.80、2.00、4.00、10.00 mg/L的标准工作液。
1.3.2 样品前处理
称取粉碎均质后的东北酸菜和酱黄瓜各1 g，超纯水定容至5 mL，10 000 r/min离心2 min，0.22 μm微滤后进样。
称取5 g酸奶加入20 mL水涡旋后，甲醇定容至50 mL，10 000 r/min离心2 min，取离心上清液0.22 μm微滤后进样。
称取粉碎均质后的甜米酒5 g和1 g α-淀粉酶共同加入5 mL 超纯水中酶解并稀释，60 ℃下水浴30 min，冷却后定容至20 mL，9 000 r/min离心2 min，取离心上清液，0.22 μm微滤后进样。
称取粉碎后的广式腊肠5 g加入20 mL水中，后超声处理，用甲醇定容至50 mL，10 000 r/min离心2 min，取离心上清液，0.22 μm微滤后进样。
1.3.3 色谱条件
第一维色谱柱：Dikma Diamonsil Plus C18色谱柱(100 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：V(0.1%甲酸水溶液)∶V(甲醇)=65∶35，流速1.0 mL/min；第二维色谱柱：Agilent Poroshell C8色谱柱(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)，流动相：V(0.05%TFA)∶V(乙腈)=87∶13，流速1.0 mL/min，检测波长：210 nm；进样体积：20 μL，柱温：30 ℃。阀切换时间：0.00 min (位置1～6)，4.70 min (位置1～2)，20.00 min(位置1～6)。
使用一维色谱柱对样品分离，苯乳酸即将通过一维色谱柱时，捕获柱开始截取与苯乳酸有关的部分，将苯乳酸切换至二维色谱柱，二维色谱柱继续对样品分析，此时捕获柱和一维色谱柱进行平衡清洗。
1.3.4 UPLC-MS/MS色谱和质谱条件
色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1×50 mm，1.7 μm)；流动相A为体积分数0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱，洗脱程序0～1 min 90%A，1～6 min A由90%线性变化至10%，6～8 min 保持10%A，8～10 min由10%线性变化至90%；流速：0.3 mL/min。
质谱分析条件：毛细管电压：3.0 kV；离子源：电喷雾离子源(electrospray ionization，ESI)，负离子检测模式；检测方式：质谱多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)；锥孔电压：26 V；脱溶剂温度：400 ℃；脱溶剂气流量：793～800 L/h；锥孔气流量：148～150 L/h；雾化气压力：630～700 kPa；碰撞气流量：0.14 mL/min；定量离子对：165>147(m/z)；碰撞能量：15 eV。
2.1 一维色谱阀切换时间的确定
在一维条件下将苯乳酸标准品连续进样，确定苯乳酸标准品的出峰时间在5.0 min。选用高效的C18色谱柱作为一维色谱的分离柱，能够压缩缝宽，更好地分离目标峰和杂质峰，缩短阀切换时间窗口，减少一维色谱中杂质进入二维色谱[24]。样品在第一维色谱柱上进行富集和分离，4.7 min切换六通阀，将苯乳酸切换到第二维色谱条件进行分析定量，使苯乳酸与杂质分开。苯乳酸切换到第二维色谱柱分析时，对第一维色谱柱进行冲洗和平衡，保护色谱柱的性能，由图1得知，苯乳酸出峰时间为11.0 min。
图1 苯乳酸标准品2D-HPLC色谱图
Fig.1 2D-HPLC graph of PLA standard
由图2-a发现，酱黄瓜离心后经0.22 μm微滤进样，流动相V(0.05%TFA)∶V(乙腈)=75∶25，C18色谱柱(4.6×250 mm，5 μm)为固定相进行1D-HPLC分析发现[14]，目标峰与杂质峰相连，且基线不平稳，导致苯乳酸的定性定量不准确，而样品中杂质过多易对色谱柱造成损耗。
a-酱黄瓜；b-酸奶
图2 样品1D-HPLC色谱图
Fig.2 1D-HPLC graphs of samples
由图2-b可知，酸奶在1D-HPLC条件下没有检出苯乳酸。研究表明，植物乳杆菌有合成苯乳酸的能力[2,3,8]，而样品酸奶中含有植物乳杆菌，故推测酸奶中含有苯乳酸。相同样品在2D-HPLC色谱条件下检出含有苯乳酸(图3-c)，表明2D-HPLC方法灵敏度，目标峰分离程度好。
苯乳酸在食品中易于扩散，前处理不当会导致检测效率低和回收率低等问题。发酵食品中成分较为复杂[17-19]，2D-HPLC法测定苯乳酸降低了食品中杂质成分的干扰、防止了色谱柱污染、延长色谱柱寿命、灵敏度更高。由图3可知，样品在2D-HPLC色谱条件下出峰稳定、无杂质干扰，相比1D-HPLC更能满足检测需求。
a-酱黄瓜；b-东北酸菜；c-酸奶；d-甜米酒
图3 四种发酵食品中苯乳酸2D-HPLC色谱图
Fig.3 2D-HPLC chromatograms of PLA in four fermented products
苯乳酸在210和258 nm吸收波长下均能出峰[26]，2D-HPLC法检测苯乳酸时在210 nm下出峰，但在258 nm吸收波长下无色谱峰出现，为验证使用2D-HPLC法时,210 nm处色谱峰为苯乳酸目标峰，本实验采用UPLC-MS/MS进行样品的验证。由图4可知，酱黄瓜、东北酸菜、酸奶和米酒中有苯乳酸存在，验证了2D-HPLC法在210 nm下色谱峰为苯乳酸目标峰。
a-苯乳酸标准溶液；b-酱黄瓜；c-酸菜；d-酸奶；e-甜米酒
图4 四种发酵食品多反应监测色谱图
Fig.5 MRM chromatograms of four fermented products
本实验采用外标法对苯乳酸进行定量检测，通过分析5种浓度(0.40、0.80、2.00、4.00和10.00 mg/L)的标准品溶液，以标准品浓度为x轴，以峰面积为y轴，计算回归方程和系数。检出限定义为信噪比(RSN)为3时对应的质量浓度，定量限定义为RSN为10时对应的质量浓度。在1.3.3的色谱条件下，仪器平衡1 h后，仪器基线噪声为0.80 mAu。
标准溶液浓度对应峰面积见表1，回归方程y=290.29x+7.59且r>0.999 9，该方法在0.40～10.00 mg/L内有良好的线性。使用0.40 mg/L的标准溶液测定检出限和定量限，分别为0.16和0.52 mg/L，表明该方法灵敏度高，能够满足检测需要。
表1 线性回归方程、检出限和定量限
Table 1 Regression equation, LOD and LOQ of PLA reference solution
标准溶液质量浓度/(mg·L-1)峰面积/mAu线性方程r检出限/(mg·L-1)定量限/(mg·L-1)0.40115.77±0.280.80236.42±0.352.00592.60±0.274.001 193.40±0.1810.002 900.30±0.20y=290.29x+7.590.999 90.16±0.000 140.52±0.000 47
对酱黄瓜、东北酸菜、酸奶、甜米酒、腊肠加标测定回收率，分别向样品中分别加入低、中、高3个水平的苯乳酸标准品(即加入折合质量浓度为0.40、0.80和2.00 mg/L的标准品)，按照1.3.3的条件进行2D-HPLC分析考察方法的回收率，每组6个平行。同时测定5种发酵食品中苯乳酸的含量，得出本方法回收率在91.79%～107.37%，RSD<15%，符合国家标准[27]。
由表2知，酱黄瓜、东北酸菜、酸奶、甜米酒能够检出苯乳酸，腊肠中未能检出苯乳酸。经测定东北酸菜和酸奶中苯乳酸含量分别为5.50和1.57 mg/L，市售东北酸菜和酸奶配料表中标识添加植物乳杆菌，未标识添加苯乳酸，苯检出的乳酸可能由乳酸菌发酵合成。酱黄瓜苯乳酸含量为8.01 mg/L，酱黄瓜无乳酸菌和苯乳酸添加标识，可能在腌制的无氧环境下有乳酸菌参与发酵，代谢生成苯乳酸。甜米酒中苯乳酸含量为9.08 mg/L，配料表中未标识添加乳酸菌和苯乳酸，但研究表明米酒中含有乳酸菌[28-29]，检出的苯乳酸可能是由米酒中乳酸菌合成。广式腊肠中未检出苯乳酸，可能由于乳酸菌在广式腊肠中生长代谢更趋向于降解亚硝酸盐，有研究表明，乳酸菌通过合成酸类物质促进亚硝酸盐的降解[27]。
表2 样品中的苯乳酸含量和回收率实验
Table 2 PLA concerntration in five samples and recovery test
样品对照检出浓度质量/(mg·L-1)加标水平/(mg·L-1)加标样品检出质量浓度/(mg·L-1)回收率/%RSD/%0.401.45±0.04898.72±0.0545.47酸菜5.50±0.0680.801.92±0.033102.83±0.0424.042.003.25±0.040107.37±0.0201.870.401.84±0.01597.24±0.0383.94酱黄瓜8.01±0.000 910.802.22±0.04596.50±0.0565.792.003.64±0.055101.56±0.0252.470.400.55±0.017100.01±0.0323.25酸奶1.57±0.0110.800.98±0.027103.27±0.0343.252.002.17±0.13100.74±0.0636.300.402.67±0.01599.77±0.0393.96甜米酒9.08±0.00740.803.01±0.003 591.79±0.004 40.482.004.31±0.045101.58±0.022.190.400.39±0.006 197.15±0.0151.56广式腊肠—0.800.73±0.05691.11±0.077.712.001.98±0.09199.19±0.0464.59
制备6份2.00 mg/L标准溶液，在1.3.3所述色谱仪条件下，在日内和日间(24 h后)分别进样，测定并计算峰面积平均值和RSD。
重复性以RSD表示，表3结果显示该方法日内和日间重复性较好，RSD分别为0.60%和0.94%，能够满足检测要求。
表3 仪器精密度和重复性实验
Table 3 Repeatability test of the PLA reference solution
测定次数日内日间测定质量浓度/(mg·L-1)测定峰面积/mAuRSD/%测定质量浓度/(mg·L-1)测定峰面积/mAuRSD/%12.01589.622.03596.5222.02592.922.00588.7032.03591.172.04600.1342.03595.432.03597.5252.02594.462.01592.0662.04600.121.99585.76平均值2.02±0.01594.95±3.600.602.02±0.02593.45±5.550.94
本实验建立了一种2D-HPLC检测发酵食品中苯乳酸的方法，该方法相比传统1D-HPLC法灵敏度高，目标峰与杂质峰分离彻底。利用本方法测定5种发酵食品的加标回收率为91.79%～107.37%，检出限和定量限分别为0.16和0.52 mg/L，能够满足检测需求，同时本实验利用UPLC-MS/MS法进一步验证了样品中苯乳酸的存在性。本方法前处理步骤简单，适当稀释沉淀蛋白后即可进样；检测效率高、重复性好、结果准确，减少了杂质带来的影响；能够快速简便地检测出食品中的苯乳酸，适用于大批量样品的检测。
本实验利用2D-HPLC法测定出东北酸菜、酱黄瓜、甜米酒和酸奶中含有苯乳酸，其中甜米酒和酱黄瓜中的苯乳酸含量较高。苯乳酸的存在与微生物生长相关，筛选甜米酒和酱黄瓜中的苯乳酸合成菌有待进一步研究。在后续研究中可通过调整流动相洗脱方式，一次性检出多种组分。本方法也为2D-HPLC法测定发酵食品中其他组分提供参考和理论依据。
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