唾液乳杆菌M18-6体外抗氧化功能评价及其机制探讨

董晨阳1,2,3,张红星1,2,3,贾宇1,谢远红1,刘慧1,金君华1,2,3*

1(北京农学院 食品科学与工程学院,北京,102206)2(食品质量与安全北京实验室(北京农学院),北京,102206) 3(农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京重点实验室(北京农学院),北京,102206)

摘 要 分别检测了唾液乳杆菌M18-6菌悬液、无细胞上清液及细胞内容物的体外抗氧化功能指标,包括DPPH自由基清除率、抑制亚油酸过氧化率、羟自由基(·OH)清除率、抗氧化相关酶活力等,并结合菌株基因组信息,利用实时荧光定量PCR,检测菌株中11个抗氧化功能相关的基因在mRNA上的表达水平,以期对菌株体外抗氧化功能进行全面评价,并从分子水平进一步探讨其抗氧化的机理。结果显示,唾液乳杆菌M18-6无细胞上清液清除DPPH自由基和·OH的清除能力、抑制亚油酸过氧化率的能力均显著高于鼠李糖乳酸杆菌LGG(P<0.05),在菌株无细胞上清液中检测到较强的谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性,表明唾液乳杆菌M18-6无细胞上清液中有较强的抗氧化能力。在2.5 mmol/L H2O2胁迫下,菌株的NADH氧化酶和超氧化物歧化酶编码基因在mRNA上表达水平分别上调了6.2和4.5倍,硫氧还蛋白系列的基因(trxA1、trxA2、trxA3、trx)和过氧化氢酶基因表达水平也均上调2倍以上,推测唾液乳杆菌M18-6可能通过上调NADH氧化酶基因与硫氧还蛋白系统相关基因表达,激活硫氧还蛋白系统,通过上调sodcat基因表达水平,提高超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的酶活力,发挥抗氧化作用。

关键词 唾液乳杆菌;抗氧化功能;抗氧化机理;基因表达

氧化应激是导致机体衰老和与衰老相关疾病的根本原因,可能引起糖尿病、动脉粥样硬化、关节炎、高血脂、心脑血管疾病等多种疾病[1]。近年来,乳酸菌具有抗氧化作用的报道逐步增多,人们对乳酸菌抗氧化功能的认识也在不断深入。KULLISAAR等[2]发现了2株发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)E-3、E-18,均能耐受H2O2且对羟自由基(·OH)有较强的清除能力。ZHAI等[3]评价了10株乳酸菌菌株的抗氧化活性,发现植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM 8661菌液表现出较最强的脂质过氧化抑制活性。

乳酸菌主要通过清除细胞及周围的活性氧自由基、螯合金属离子、缓解脂质过氧化、自身抗氧化防御系统调控、调节宿主细胞抗氧化防御系统、调节宿主细胞与抗氧化相关的信号通路等方式发挥抗氧化作用[4-6]。乳酸菌的自身抗氧化防御系统分为酶类系统与非酶类系统,可以通过乳酸菌体内存在的氧化还原调控系统发挥抗氧化作用[7-8]

目前,国内外已有关于唾液乳杆菌体外抗氧化功能评价的研究,但是关于其抗氧化机制,尤其是结合全基因组序列信息,在分子层面对抗氧化机理的探究却鲜有报道。本研究全面评价了1株唾液乳杆菌M18-6的体外抗氧化功能,检测其无细胞上清液、菌悬液、细胞内容物的体外抗氧化指标,并从菌株基因组中挖掘11个与抗氧化相关蛋白的编码基因,在mRNA水平探讨菌株在H2O2氧化胁迫环境下的分子应答机制。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

(1)试验菌株:唾液乳杆菌M18-6,保藏号为CGMCC 16199。

(2)参考菌株:鼠李糖乳酸杆菌 (Lactobacillis rhamnosus GG,LGG)ATCC 53103, 中国农业大学食品科学与营养工程学院保藏。

1.2 材料、试剂

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)试剂盒(货号A001-1-2)、过氧化氢酶(catalase, CAT)试剂盒(货号A007-1-1)、谷胱甘肽过氧化物酶 (glutathione peroxidase,GSH-Px)试剂盒(货号A005-1-2)、总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)检测试剂盒(货号A015-2-1),南京建成生物工程研究所;PrimeScriptTM 1 st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(货号6110A)、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 试剂盒(货号RR820A)、Recombinant DNase Ⅰ试剂盒(货号2270A),宝生物工程(大连)有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、邻二氮菲、FeSO4、H2O2、K3[Fe(CN)6]、FeCl3、亚油酸、三氯乙酸(trichloroacetic acid solution,TCA)、L-半胱氨酸、盐酸、抗坏血酸盐、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(butylated hydroxytoluene,BHT)、丁醇等均为国产分析纯。

1.3 体外抗氧化功能评价

1.3.1 样品制备

将菌株以体积分数为2%的接种量接种于MRS肉汤中,37 ℃恒温培养 12 h,传至3代备用。将活化好的菌液,4 ℃下5 000×g离心 10 min,收集上清液,经0.22 μm滤膜过滤所得滤液即为发酵上清液;菌体沉淀重悬于等体积无菌磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)(pH 7.4,下同)中得到菌悬液;菌体沉淀用无菌PBS缓冲液洗涤3次,重悬于无菌 PBS 缓冲液中,调整细菌的浓度为1×109 CFU/mL,并用细胞破碎仪400 W 间歇 4 s,破碎 5 min,10 000×g离心10 min,收集上清液为细胞内容物[9]

1.3.2 DPPH自由基清除能力

将新配制的2 mL 0.1 mmol/L DPPH试剂与1 mL待测样品混合,室温下静置30 min,5 000×g离心10 min,于517 nm处测定上清液的吸光值(A样品),以去离子水代替样品测定的吸光值(A对照),以无水乙醇代替DPPH测定的吸光值(A空白),以去离子水和无水乙醇调零[10]。按照公式(1)计算DPPH自由基清除能力:

DPPH自由基清除率

(1)

式中:A对照,1 mL H2O+2 mL DPPH;A空白,1 mL无水乙醇+2 mL样品;A调零,1 mL H2O+2 mL无水乙醇。

1.3.3 ·OH清除率

将1 mL 0.75 mmol/L邻二氮菲试剂、2 mL PBS缓冲液、1 mL 0.75 mmol/L FeSO4充分混匀,加入1 mL 体积分数为10%的H2O2和1 mL待测样品溶液,在37 ℃环境下静置90 min, 在波长536 nm处测吸光值为As。用生理盐水替代样品得到的吸光值为Ac,用生理盐水代替H2O2和样品溶液得到的吸光值为Ab[11]。按照公式(2)计算·OH清除率:

·OH清除率

(2)

1.3.4 总还原能力

在0.5 mL待测样品中加入0.5 mL PBS缓冲液、0.5 mL 10 g/L K3[Fe(CN)6],置于50 ℃水浴20 min,取出后迅速冷却,加入0.5 mL 100 g/L TCA,3 000×g离心5 min,取1 mL上清液,加入1 mL蒸馏水及1 mL 1 g/L FeCl3,混合均匀,在室温下静置10 min,在波长700 nm处测吸光值,蒸馏水做空白管。

配制0~400 μmol/L的L-半胱氨酸盐酸盐,按上述步骤测吸光值,做标准曲线,将样品吸光值带入标准曲线,计算半胱氨酸当量[12]

1.3.5 亚油酸过氧化抑制率

将1 mL亚油酸的乳化液与0.5 mL PBS溶液混合,加入0.2 mL 0.1 g/L FeSO4溶液、0.02 mL 0.1 g/L 抗坏血酸盐和0.4 mL待测样品,混匀后置于37 ℃水浴反应12 h,向混合液中加入0.2 mL 40 g/L TCA、2 mL 8 g/L TBA和0.2 mL 4 g/L BHT,混匀后在100 ℃水浴中反应30 min,取出后迅速冷却,用2 mL丁醇提取,在532 nm处测定其上清液的吸光值为A样品,用PBS缓冲液代替样品的吸光值为(A空白)[5]。按照公式(3)计算亚油酸过氧化抑制率:

亚油酸过氧化抑制率

(3)

1.3.6 抗氧化酶类物质活性

用试剂盒测定菌悬液、无细胞上清液、无细胞提取物中GSH-Px、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)和CAT的活性以及T-AOC。

1.4 全基因组测序以及抗氧化相关基因信息挖掘

将活化好的菌体交由美吉生物公司,结合2代Illumina Hiseq×10平台及3代PacBio测序平台,进行基因组序列测定,获取菌株基因组完成图[13]。将预测得到的编码基因通过与数据库(NR、Swiss-Prot、Pfam、EggNOG、GO和KEGG)进行比对进行功能注释。挖掘与抗氧化相关蛋白的编码基因,利用NCBI设计引物,与内参基因引物一同在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5 总RNA的提取、cDNA的合成以及RT-qPCR

将2代的菌液以体积分数为2%的接种量分别接种到H2O2浓度为0、0.5、1.0、1.5、2和2.0 mmol/mL 的MRS液体培养基中,37 ℃培养12 h,取2 mL菌悬液,4 ℃环境下12 000×g离心5 min。采用玻璃珠-酚仿法提取菌体RNA,利用TAKARA Recombinant DNase Ⅰ试剂盒消化DNA,具体方法参考吴思琪等[14]研究。

cDNA合成:利用TAKARA公司的PrimeScriptTM 1 st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行反转录。

RT-qPCR体系:1 μL模板、1 μL上游引物、1 μL下游引物、0.4 μL ROX、0 μL TB GREEN 1和6.6 μL H2O。具体步骤为:95 ℃预变性3 min,扩增循环(95 ℃ 10 s,引物Tm 30 s),39个循环,对每种目的基因的扩增反应都进行了扩增产物的融解曲线分析。

将cDNA样品的连续稀释后进行实时荧光定量PCR,做标准曲线评估引物扩增效率,扩增效率在1.90~2.05的引物用于后续的mRNA水平检测,利用2-ΔΔCT计算基因表达水平,将内参基因的表达量设定为1[15]

1.6 数据处理

采用SPSS 17.0对所得数据进行统计学分析,采用t检验分析样品的差异显著性,P<0.05时认为有显著性差异

2 结果与分析

2.1 菌株体外抗氧化能力评价

2.1.1 DPPH自由基清除能力

由图1可知,唾液乳杆菌M18-6的菌悬液、无细胞上清液以及细胞内容物中均有较强的清除DPPH自由基的能力,其中无细胞上清液DPPH自由基清除能力最强(26.9%),显著高于菌悬液和细胞内容物的清除能力,分别为13.9%和11.75%;无细胞上清液和细胞内容物的DPPH自由基清除能力均显著高于商业菌株LGG的无细胞上清液和细胞内容物,分别为20.2%和9.05% (P<0.05)。结果表明,菌株无细胞上清液中的活性物质能很好地清除DPPH自由基。有研究表明,菌体清除DPPH自由基的能力与菌体代谢产生的胞外多糖有关[16]

图1 唾液乳杆菌M18-6清除DPPH自由基能力
Fig.1 DPPH free radicals scavenging rate of L.salivarius M18-6 注:*表示与同处理组的LGG相比具有显著性差异(P<0.05)(下同)

2.1.2 ·OH清除能力

本实验体系中,·OH由Fenton反应产生,被清除后体系中Fe2+的质量浓度升高,吸光度也相应升高[17]。·OH清除率如图2所示,唾液乳杆菌M18-6的无细胞上清液以及细胞内容物的·OH清除能力分别为61.95%和18.76%,其中无细胞上清液的清除·OH的能力显著高于商业菌株LGG(49.21%) (P<0.05)。与类似研究结果相比较发现,唾液乳杆菌M18-6无细胞上清液的·OH清除能力高于其他乳杆菌。刘少敏[1]研究发现,植物乳杆菌NDC 75017、嗜酸乳杆菌ATCC 14917和植物乳杆菌NCFM的无细胞上清液·OH清除率分别为32.13%、23.65%和17.28%,均低于本实验的唾液乳杆菌M18-6。无细胞上清液中的·OH清除率高,说明菌株在发酵过程中产生了可清除·OH的活性物质。

图2 唾液乳杆菌M18-6的·OH清除率
Fig.2 The hydroxyl radical scavenging rate of L.salivarius M18-6

2.1.3 总还原能力

具有抗氧化性的物质可将K3[Fe(CN)6]还原成K4[Fe(CN)6],再与Fe3+作用生成普鲁士蓝,在700 nm波长具有最大的光度值,以检测普鲁士蓝的生成量作为试样的还原能力[18]。如图3所示,唾液乳杆菌M18-6的菌悬液、无细胞上清液以及细胞内容物中均有较强的总还原能力,与对照菌株LGG持平,分别为371.125、1 448.625和155.29 μmol/L半胱氨酸当量,其中无细胞上清液显著高于菌悬液与细胞内容物(P<0.05)。由结果可知,菌株在发酵过程中产生了还原力强的活性物质,还原能力优于菌体与细胞内容物。

图3 唾液乳杆菌M18-6总还原能力
Fig.3 The total reducing capacity of L.salivarius M18-6

2.1.4 亚油酸过氧化抑制能力

亚油酸易发生氧化而形成过氧化物,进而氧化Fe2+为Fe3+,与邻菲罗啉中的SCN-生成络合物,在500 nm处有最大吸光值,吸光值与亚油酸自氧化程度成正比[19]。由图4可知,唾液乳杆菌M18-6具有良好的抑制亚油酸过氧化能力,其中无细胞上清液的抑制亚油酸过氧化能力为71.3%,显著高于商业菌株LGG(54.08%),也高于同菌株的菌悬液和细胞内容物的抑制亚油酸过氧化能力,分别为31.79%和17.93%。结果表明,菌株无细胞上清液中的活性物质是抑制亚油酸过氧化率的主要因素,部分完整细胞的非酶物质也能够起到一定的作用。

图4 唾液乳杆菌 M18-6抑制亚油酸过氧化率
Fig.4 Inhibition rate of linoleic acid peroxidation in L.salivarius M18-6 注:**表示与同处理组的LGG和菌株其他处理组相比 具有显著性差异(P<0.05)

2.1.5 抗氧化酶类物质活性

抗氧化酶类在机体防御活性氧的损伤中扮演着极为关键的角色[19]。如表1所示,唾液乳杆菌M18-6的菌悬液及无细胞上清液中具有GSH-Px活性,且活性显著高于商业菌株LGG(P<0.05);无细胞上清液中T-SOD活性显著高于商业菌株LGG(P<0.05);菌悬液中具有CAT活性;无细胞上清液以及细胞内容物中检测出较强的T-AOC。结果表明,SOD与GSH-Px活性主要展现在无细胞上清液中,证明其主要来源于菌体代谢产物;CAT活性主要是由于菌体表面的活性物;菌体无细胞上清液的T-AOC很强,与上文总还原能力结果一致。与类似研究结果相比较发现[20],对于乳杆菌抗氧化酶类物质的检测,鲜有将这4种酶类同时检测的报道,并且与同类菌株相比较,唾液乳杆菌M18-6的无细胞上清液的SOD、GSH-Px活性也有较强的优势。

表1 M18-6及LGG抗氧化酶类物质活性单位:U/mg

Table 1 The activity of antioxidant enzymes in L.salivarius M18-6 and L.rhamnosus GG

酶种类M18-6LGG菌悬液无细胞上清液细胞内容物菌悬液无细胞上清液细胞内容物GSH-Px1.73±0.07∗19.15±4.71∗---2.40±0.15T-SOD-19.58±1.05∗--13.72±0.99-CAT18.41±1.34∗----3.01±0.44T-AOC-0.17±0.01∗0.09±0.02∗-0.05±0.010.05±0.01

注:-,未检出

2.2 基因水平分析菌株抗氧化功能机制

2.2.1 抗氧化相关基因的引物设计

硫氧还蛋白系统、谷胱甘肽系统和是乳酸菌细胞内最主要的氧化还原调控系统[1]。硫氧还蛋白系统由硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)、硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase, TrxR)和还原型辅酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)组成[21]。谷胱甘肽系统主要是由还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、GSH-Px、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)以及谷胱甘肽转硫酶(glutathione-S-transferase,GST)组成[22]

同时,sodcat等抗氧化酶基因表达出的SOD和CAT能够与过氧化物作用,发生还原反应,实现抗氧化的功能。根据以上抗氧化机理,选择基因注释中与抗氧化功能相关酶的基因,并设计相应引物(表2)。

2.2.2 H2O2胁迫下抗氧化相关基因的转录水平分析

为了探讨唾液乳杆菌M18-6的抗氧化机理,本研究检测了菌株在不同浓度的H2O2胁迫环境下,基因组中11个抗氧化性相关基因(表2所示)在mRNA上表达水平变化(图5)。研究结果显示,各基因均在0.5 mmol/L H2O2胁迫后出现显著表达上调,其中,NADH氧化酶(gene1634)和超氧化物歧化酶基因(sod)在2.5 mmol/L H2O2胁迫下,mRNA表达水平上调最多,分别上调了6.2和4.5倍。硫氧还蛋白系列(trxA1、trxA2、trxA3、trx)4个基因分别在2.5 mmol/L H2O2胁迫下表达上调了3.2、3.8、2.5和3.7倍,3个过氧化氢酶基因(cat 1、cat 2、cat 3)分别上调了2.3、3.3和1.2倍,gene0157基因表达水平在H2O2胁迫下未发生显著变化。推测在分子水平上,M18-6主要通过NADH氧化酶与硫氧还蛋白系统发挥抗氧化作用[23],并且sodcat编码的抗氧化。

表2 唾液乳杆菌M18-6基因组中抗氧化功能相关编码基因及其引物设计
Table 2 Genome and primer design of L.salivarius M18-6 about antioxidant function-encoding gene

分类参考序列编号基因名称基因功能设计引物序列上游/下游 (5’-3’)Tm/℃PCR片段长度/bpWP_003861174.1trxA1硫醇还原酶硫氧还蛋白CAGCTGGTTGGTGTCCTGAT56116ACGATCTACTTCTTTTC-CATCTTCA硫氧还蛋白系统WP_003860964.1trxA2硫醇还原酶硫氧还蛋白AGCTGCTGTTTCTTGATTTG-CAT57130CATGGTGTGGTCCTTGTCGTWP_003678631.1trxA3硫醇还原酶硫氧还蛋白AAGATCATCGCTGGAATACT-CA56182TTTTTGGGCAGAATGGTGCGWP_003855300.1trx硫氧还蛋白CCACTGATATTGCTGGCTGC56125TACCTGTTGACGCGTCTGTC谷胱甘肽系统WP_003861417.1gene0157谷胱甘肽S-转移酶家族蛋白TGCTTAGGTGTGGTAAAGTCG55182GATGCCGATAGAGGTGAGGCWP_003862932.1 gene1634NADH氧化酶GCGCCAAGAAGCTAACCTTG57193ACGCCTCCTAGGCCTAAACTWP_003862560.1sod超氧化物歧化酶TGAAACAGTGCGTGTTCTCG54162CACCTGCAGTAGGAGCAAAGA抗氧化酶WP_003855300.1fnr铁氧还蛋白-NADP(+)还原酶AGCTGAATCACCACCACCTG57108ATAGCGAATGCCGAAGCACTWP_003855734.1cat 1过氧化氢酶ACTGCTAGTTACCGACCACA57129GCATGCAACCAAGCACTACCWP_011667631.1cat 2过氧化氢酶TTACTAGCTTCCAAACATGCT-TAAT56182CAACATGCGATGGATGCGTTWP_011102230.1cat 3过氧化氢酶ATAACGCTGTTGTTGGGGCA54160

图5 唾液乳杆菌M18-6基因组中抗氧化相关基因在 H2O2胁迫环境下的mRNA表达水平
Fig.5 The mRNA expression levels of antioxidant-related genes in the L.salivarius M18-6 genome under H2O2 stress

3 结论

M18-6无细胞上清液的DPPH自由基清除能力、·OH清除能力、亚油酸过氧化抑制能力均显著高于商业菌株LGG,另外,菌株的无细胞上清液中的GSH-PX与SOD活性也显著高于LGG上清液,表明菌株M18-6的无细胞上清液同时具有酶类和非酶类的抗氧化活性物质。

针对唾液乳杆菌M18-6的抗氧化机制探讨结果显示,唾液乳杆菌M18-6可能通过上调NADH氧化酶基因与硫氧还蛋白系统相关基因(gene1634、trxA1、trxA2、trxA3、trx)表达,及激活硫氧还蛋白系统呈现抗氧化作用效果,同时sodcat基因表达上调,提高SOD、CAT酶量,提高酶活力,发挥抗氧化作用。

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Evaluation of antioxidative function of Lactobacillus salivarius M18-6 in vitro and its antioxidant mechanisms

DONG Chenyang1,2,3,ZHANG Hongxing1,2,3,JIA Yu1,XIE Yuanhong1, LIU Hui1,JIN Junhua1,2,3*

1(Faculty of Food Science and Engineering, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China) 2(Beijing Laboratory of Food Quality and Safety, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China) 3(Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control of Spoilage Organisms and Pesticide Residue, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China)

ABSTRACT This study investigated the antioxidant function of Lactobacillus salivarius M18-6 bacterial suspension, cell-free supernatant and cell contents in vitro, respectively, by testing 1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine (DPPH) clearance rate, inhibition of linoleic acid peroxidation rate, hydroxyl radical (·OH) clearance rate, antioxidant related enzyme activity, etc. Furthermore, combined with strain genome information, this study detected the transcription level of 11 genes involved in antioxidant function using real-time fluorescence quantitative PCR. The results showed that activity of scavenging DPPH free radicals and ·OH, and inhibiting linoleic acid peroxidation rate were significantly higher than that of L.rhamnosus GG (P<0.05). Meanwhile, the glutathione peroxidase (GSH-PX) and superoxide dismutase (SOD) activities were also high in the cell-free supernatant of the strain. The results indicated that the cell-free supernatant of L. salivarius M18-6 had strong antioxidant capacity. Under 2.5 mmol/L H2O2 stress, the transcription level of the genes encoding NADH oxidase and superoxide dismutase of the L. salivarius M18-6 were up-regulated by 6.2 and 4.5 times, respectively, and the transcription level of thioredoxin series genes (trxA1, trxA2, trxA3, trx) and catalase(cat) were also up-regulated by more than 2 times. It is speculated that L. salivarius M18-6 might exhibit antioxidant effects by increasing the expression of NADH oxidase and thioredoxin to activate the thioredoxin system, and by up-regulating the expression levels of sod and cat genes to increase the activity of SOD and catalase.

Key words Lactobacillus salivarius;antioxidant function;antioxidant mechanism;gene expression

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.023705

引用格式:董晨阳,张红星,贾宇,等.唾液乳杆菌M18-6体外抗氧化功能评价及其机制探讨[J].食品与发酵工业,2021,47(1):132-137.DONG Chenyang,ZHANG Hongxing,JIA Yu,et al.Evaluation of antioxidative function of Lactobacillus salivarius M18-6 in vitro and its antioxidant mechanisms[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(1):132-137.

第一作者:硕士研究生(金君华副教授为通讯作者,E-mail:jinjunhua002008@163.com)

基金项目:北京市教育委员会科研计划一般项目(KM202010020002)

收稿日期:2020-02-21,改回日期:2020-04-14