我国是牛肉生产和消费大国，2019年我国的牛肉产量达到685万t，仅次于美国、巴西和欧盟；而牛肉消费量更是高达923.3万t，位于世界第2位[1]。作为一种低脂肪、高蛋白的食品，牛肉深受消费者的喜爱。其中，嫩度是影响消费者满意度和接受度的主要因素，也是衡量牛肉食用品质的关键指标之一。牛的品种、年龄、性别、营养状况和肌肉部位等都会影响牛肉的嫩度，但究其根本，肌节长度、结缔组织含量和肌原纤维蛋白水解程度才是决定肉嫩度的关键因素[2]。
研究发现消费者愿意高价购买肉质较嫩的牛肉，并且通常以牛肉嫩度的高低来评价肉质的好坏[3]。一般用剪切力值作为牛肉嫩度的客观评定指标。在我国，当牛肉剪切力值> 55.43 N时，消费者会认为肉质较韧；当剪切力值< 41.4 N时，牛肉肉质较嫩，消费者易于接受[4]。而近期的研究发现，我国牛肉多处于较韧的范畴(63～99 N)[5-7]，因此如何改善牛肉的嫩度一直是国内外肉类研究领域的重点问题之一。多种嫩化技术如电刺激[8-9,13-15]、盆骨吊挂[10-11]和延迟冷却[12]等已实现商业应用并取得良好的嫩化效果。近年来出现的超声波、脉冲电场、SmartStretchTM等技术在牛肉嫩化方面也表现出巨大的潜力，因而受到广泛关注，但是当前对上述3种新型嫩化方法的优缺点仍缺乏系统性的总结，其嫩化机制及作用效果仍存在争议。因此，本文就超声波、脉冲电场、SmartStretchTM技术的应用现状进行综述，并深入分析了其嫩化机制及应用前景，旨在为牛肉嫩化技术的发展提供理论依据。
1 超声波嫩化技术
超声波是频率高于20 kHz的声波，具有绿色环保、穿透力强、方向性好、安全性高等优点[16]。我国对于超声波技术的研究较晚，但发展迅速，该技术已经在医疗化工等方面取得了广泛应用。超声波通常可以分为：高强度(10～1 000 W/cm2)低频率(20～100 kHz)声波和低强度(<1 W/cm2)高频率(>1 MHz)超声波[17]。2种类型的超声波在食品加工中应用都比较广泛，前者可用于修饰细胞结构，有助于食品的腌制、干燥和嫩化等，后者可用于食品的无损检验及品质监控等。近几年，超声波作为一种新技术，已成为肉品加工领域的研究热点，并在肉类嫩化、腌制、杀菌、解冻等方面产生了重要的应用价值。
1.1 超声波对肉嫩度的影响
超声波具有热效应、空化效应和机械效应等特性[18]，其中起嫩化效果的主要是空化效应和机械效应。该技术对肉类的嫩化机制可以概括为以下2个方面[16]：改变细胞膜的通透性，破坏结缔组织并降低其机械强度；促进Ca2+及蛋白酶的释放，加快蛋白质水解，损坏肌肉超微结构[19]，从而使肉的嫩度得到改善。目前，许多研究已经证实，当超声波参数控制在20 k～40 kHz，11～25 W/cm2时，可使牛肉剪切力值降低，嫩化效果明显，但当超声波处理时间过短或者波频率过高时嫩度改善效果不显著(表1)。
表1 超声波技术对牛肉嫩度的影响
Table 1 Effect of ultrasound technology on beef tenderness
作用对象处理参数剪切力改善情况骨架蛋白降解情况参考文献半腱肌40 kHz,1 500 W,10、20、30、40、50、60 min所有处理组均可降低剪切力值,处理30 min效果明显,可使剪切力降低17.6 N未提及[23]背最长肌40 kHz,60 min,11 W/cm2剪切力降低2.45～2.99 N未提及[24]背最长肌、半腱肌24 kHz,0、30、60、120、240 s,12 W/cm2处理组均可降低剪切力,第0天剪切力降低最明显,可减少13～17 N未提及[25]半腱肌20 kHz,20、40 min,25 W/cm2第1天剪切力降低不显著,第3、7天剪切力可降低6.5～6.7 N、7.5～8.2 N肌钙蛋白-T和肌间线蛋白降解增加[20]背最长肌150、300 W,30、120 min,20 kHz150 W处理组剪切力无显著变化,300 W处理组剪切力可降低14.88～17.35 N肌间线蛋白:30 min超声波处理组,肌间线蛋白的降解随超声波功率的增加而增加;120 min超声处理组,蛋白降解不受超声波功率的影响,但其降解仍高于30 min处理组肌钙蛋白-T:降解程度随超声波处理时间以及功率的增加而增加[21]背最长肌、半膜肌20 kHz,15 s,62 W/cm2剪切力无显著变化未提及[29]背最长肌600 kHz,10 min,320、760 W剪切力无显著变化未提及[30]
1.1.1 空化效应
空化效应是通过高温高压作用导致细胞及肌肉结构损坏，使肌质网和溶酶体等被破坏，促进Ca2+和蛋白酶的释放，加快肌原纤维蛋白的降解，并使肌纤维沿Z线和I带断裂，缩短成熟时间[16]。众所周知，钙蛋白酶系统通过调节肌原纤维蛋白(包括伴肌球蛋白、伴肌动蛋白、肌间线蛋白、肌钙蛋白-T等)的水解程度来影响肉的嫩度。如表1所示，WANG等[20]发现牛半腱肌经超声波(20 kHz，25 W/cm2)处理后，肌原纤维解体，小片化指数增加，且处理组肌间线蛋白与肌钙蛋白-T的降解速度明显高于对照组，研究得出钙蛋白酶对肌原纤维结构完整性和组成的影响是超声波处理提高牛肉嫩度的原因。KANG等[21]也得出类似的结果，并且还发现高功率(300 W)、长时间(120 min)的超声波处理可破坏肌纤维的显微结构，使肌原纤维发生断裂，降低牛肉剪切力值(处理组45.88 N,对照组63.23 N)。
1.1.2 机械效应
结缔组织的含量主要影响肉的本底硬度，且在一定程度上，其机械强度还可以反映剪切力值。机械效应可以引起组织细胞内物质的运动，改变细胞膜的通透性，促使细胞内部结构发生变化，导致结缔组织机械强度降低[16]。张坤等[22]证实超声波可以在短时间内破坏结缔组织，增大肌原纤维小片化指数。在CHAGN等[23]的研究中，处理组的机械强度低于对照组，与剪切力值结果一致，并说明结缔组织机械强度的削弱是导致牛肉变嫩的主因，且40 kHz、1 500 W超声波处理30 min的肉质更嫩(约43 N)。PENA-GONZALEZ等[24]也指出低频超声波(40 kHz、11 W/cm2、60 min)处理可使牛肉肌纤维之间的空隙增大，结缔组织降解增加，贮藏0、7、14 d的牛排经过处理后，其剪切力值(分别是20.41、17.11和17.32 N显著低于对照组的22.95、19.56、20.31 N，与此前JAYASOORIYA等[25]的报道相似。
1.2 存在的问题
超声波技术作为一种非热加工方法，在改善肉类嫩度方面展现出较大的应用前景，但在实际生产中还不够成熟。近期，部分学者发现超声波可以加速脂质氧化，并产生具有攻击性的自由基(过氧化物、己醛、丙醛、丙二醛)来加速蛋白质的氧化，然而蛋白质氧化会通过二硫键的交联作用产生蛋白质聚集体，这些化学结构的存在增加了肉的韧性，对嫩度产生负面影响[26-28]。KANG等[28]研究了超声波对牛肉蛋白质氧化程度的影响，结果发现随超声波强度的增加(2.39、6.23、11.32、20.96 W/cm2)，牛肉中的羰基含量、游离蛋白质巯基呈现上升的趋势，但总巯基含量却随超声处理时间的延长而降低，从而导致蛋白质以共价交联的方式聚集。然而LYNG等[29]却发现蛋白质水解程度及胶原蛋白溶解度无显著变化，超声波处理(20 kHz、15 s、62 W/cm2)未能改善牛肉嫩度，这很可能是处理时间较短造成的。然而，长时间使用超声波技术也会对肉质造成不利影响(温度升高、蛋白质变性)，因此在操作过程中应严格把控超声波处理时间。
2 脉冲电场嫩化技术
脉冲电场(pulsed electric field，PEF)是食品行业为提高食品安全性、改善食品结构、提取食品生物活性物质而发明的一种非热处理技术。该技术可以在短时间内(ns、ms级)将高压脉冲施加到两电极之间的物料上[31]，具有高效、环保、无污染等优点[32]。PEF主要由脉冲发生装置、脉冲处理室、示波器等组成[33]，其最初应用于牛奶、果蔬汁[34]等液态食品的加工中，近年来在牛肉嫩化方面也表现出巨大的应用潜力。有研究表明，当PEF处理参数设置在5～10 kV，20～90 Hz时，牛背最长肌和半膜肌可获得较优嫩化效果。但有时也会因为牛种、年龄、性别等因素而对牛肉嫩度产生不良影响(表2)。
表2 脉冲电场技术对牛肉嫩度的影响
Table 2 Effect of pulsed electric field technology on beef tenderness
作用对象处理参数剪切力改善情况骨架蛋白降解情况参考文献背最长肌低PEF:2.5 kV,200 Hz,20 μs高PEF:10 kV,200 Hz,20 μs高PEF组剪切力提高27～40 N,低PEF组与对照组无显著差异未提及[43]背最长肌、半膜肌10 kV,90 Hz,20 μs背最长肌:剪切力随PEF次数的增加而减少半膜肌:PEF对剪切力无显著影响背最长肌:1次应用PEF组肌钙蛋白-T和肌间线蛋白降解明显[35]背最长肌10 kV,90 Hz,20 μs低pH组剪切力低于中、高pH组,但是差异不显著肌钙蛋白-T和肌间线蛋白降解增加,低pH组蛋白质降解高于高pH组[42]背最长肌、半膜肌10 kV,90 Hz,20 μs背最长肌:3次应用PEF组剪切力提高18～20 N,1次和2次PEF处理组剪切力无显著影响半膜肌:在宰后3 d时,3次应用PEF组剪切力降低25 N背最长肌:1次PEF处理组肌钙蛋白-T降解最多,2次和3次PEF处理组对肌钙蛋白-T降解有负面影响[38]背最长肌、半膜肌5、10 kV,20、50、90 Hz背最长肌:剪切力减少19.5%半膜肌:20、50、90 Hz组剪切力分别减少4.1%、10.4%、19.1%[40]背最长肌、半膜肌5、10 kV,20、50、90 Hz背最长肌:剪切力减少19%半膜肌:剪切力减少19%背最长肌:肌钙蛋白-T和肌间线蛋白降解增加[39]背最长肌、半膜肌5、10 kV,20、50、90 Hz背最长肌:剪切力随频率的增加有增韧的趋势半膜肌:剪切力减少21.6%背最长肌:肌钙蛋白-T和肌间线蛋白降解在20 Hz组降解明显[41]
2.1 PEF技术对肉嫩度的影响
PEF技术嫩化肉类的机制主要有[32]：PEF电场强度超过跨膜电位的临界值(0.5 kV/cm)时[35]会造成细胞膜损伤，导致其通透性增加，加速Ca2+释放，进而较早激发钙蛋白酶活性[36]；促使溶酶体释放组织蛋白酶，促进蛋白质降解；加速僵直前期肉的糖酵解进程。
2.1.1 PEF技术对牛肉肌原纤维及其骨架蛋白降解的影响
肌钙蛋白-T和肌间线蛋白的降解是牛肉嫩化的标志[37]。有研究发现[35]，当牛背最长肌多次应用PEF(10 kV，90 Hz，20 μs)技术时，其骨架蛋白在1次应用PEF处理组中降解明显，但随着PEF重复次数的增加，蛋白降解明显减少，这与BEKHIT等[38]的研究结果相似。但是牛肉的剪切力值会随PEF处理次数的增加而发生显著差异(P<0.01)。可能是反复PEF处理造成牛肉温度升高1、2、3次PEF处理组分别升温：8.1～8.5 ℃、12.6～12.7 ℃、16.1～16.2 ℃)，促使蛋白水解酶变性。此外，SUWANDY等[39]发现不同的PEF处理参数(如电压、频率、电场强度等)也会影响牛肉骨架蛋白的降解情况。通过设置不同的PEF处理参数(电压为5、10 kV；频率为20、50、90 Hz)，得出肌钙蛋白-T在低压高频(5 kV,90 Hz)和高压低频(10 kV,20 Hz)处理组中降解明显，肌间线蛋白在低压中频(5 kV,50 Hz)和高压低频(10 kV,20 Hz)处理组中降解明显，几种处理均能够使牛背最长肌和半膜肌的剪切力值降低19%左右。这与BEKHIT[40]的结果类似，但在BEKHIT的研究中，半膜肌的剪切力只有在90 Hz处理组中才可降低19%左右(20、50 Hz处理组的剪切力分别下降4.1%、10.4%)。另外，SUWANDY[41]等对热剔骨牛背最长肌和半膜肌进行相同的PEF[39]处理，发现肌钙蛋白-T与肌间线蛋白的降解只发生在少数样品中，而且在20 Hz(低频)处理组降解较为明显。
SUWANDY等[42]进一步研究了PEF处理对不同极限pH值(ultimate pH，pHu)牛肉嫩度的影响。结果发现PEF处理(10 kV，90 Hz，20 μs)使肌钙蛋白-T和肌间线蛋白降解增加，其中低pHu组(5.5～5.8)蛋白降解最明显，这在剪切力结果上也有所体现,低、中(pH 5.8～6.2)、高(pH>6.2)pH组分别为57、67、71 N。说明PEF处理在改善低pHu组牛肉嫩度上具有较大的应用潜力。
2.1.2 PEF技术对牛肉的物理破坏
PEF技术可以破坏肌纤维的物理结构，缩短成熟时间，改善牛肉嫩度。KHAN等[43]以冷却牛肉为研究对象，发现与未处理组相比，低PEF处理组(2.5 kV，200 Hz，20 μs)的肌纤维束被拉长，而高PEF处理组(10 kV，200 Hz，20 μs)的肌纤维束却发生收缩，这与剪切力值结果相符(高PEF组：102～124 N；低PEF组：56～100 N；对照组：62～97 N)。还有学者发现经PEF(1.1～2.8 kV/cm，5～200 Hz，12.7～226 kJ/kg)处理后，肌原纤维碎片增多，但是未能显著改善牛肉嫩度，可能是应用的电场强度较低所致[44]。
2.2 存在的问题
牛肉在经PEF技术处理后会产生轻微的欧姆加热现象，导致肉温度升高(1.9～40.5 ℃)、蛋白质变性，并对肉的嫩度产生不良影响。KHAN等[43]发现，低PEF处理组(2.5 kV，200 Hz，20 μs)牛肉温度升高1.9 ℃，而高PEF处理组(10 kV，200 Hz，20 μs)可升温40.5 ℃，明显抑制蛋白水解酶的活性，并且其剪切力值比低PEF处理组高出24～46 N，导致牛肉嫩度较差。O’DOWD[44]和BEKHIT等[38]也发现PEF致使牛肉温度升高，蛋白质变性，牛肉嫩化效果不显著。
除此之外，SUWANDY等[41]发现PEF技术会对牛背最长肌和半膜肌的剪切力值产生不同的影响(背最长肌增加，半膜肌降低21.6%)，表明PEF技术在嫩化牛肉方面效果有限，并且其主要部件和装置依然需要合理设计，技术水平有待进一步提高，这也在一定程度上限制了该技术的商业化应用。
3 SmartStretchTM技术
关于肌肉拉伸技术的研究最早见于20世纪60年代末，欧洲的部分国家在90年代就已经将肌肉拉伸技术进行商业化应用[45]。常用的拉伸技术包括盆骨吊挂、嫩切、PiVac®等。近年来，研究人员发现热剔骨工艺具备节省冷却空间、减少制冷成本、提高产品质量、加快产品周转速度等优点[46]，但是与冷剔骨相比，热剔骨肉更容易发生收缩，且嫩度较差[41]。因此，为了增加企业利润的同时满足消费者对高品质牛肉的需求，SmartStretchTM开始出现在肉类研究中。
3.1 SmartStretchTM技术对肉嫩度的影响
SmartStretchTM技术可将肌肉拉伸和肌肉塑形相结合，在改善嫩度的同时起到塑形的效果。它主要是应用一种可以放置在密闭室中的弹性橡胶套筒和安全气囊，当空气被泵出密闭室时，产生的负压会导致橡胶管膨胀，从而允许肉被插入，当空气泵入气囊时会将肉压缩，以此防止垂直于肌纤维的力使肉的直径扩大，从而起到嫩化的作用[32]。根据TAYLOR等[47]修改后的SmartStretchTM的操作示意图,如图1所示。
SmartStretchTM的嫩化机制与盆骨吊挂类似，胴体在僵直期间，其肌原纤维会产生收缩张力，对胴体进行吊挂及对肌肉进行拉伸的原理就是人为地施加与收缩张力相反的力，起到防止肌肉收缩，降低肌动蛋白和肌球蛋白重叠程度的作用，从而提高肉的嫩度[48]。另有研究发现，拉伸会导致I带断裂、Z线解体，肌动蛋白、伴肌球蛋白、伴肌动蛋白等遭到破坏，肌节完整性也受到损害，以此改善肉的嫩度[49]，但目前SmartStretchTM技术是否也会对肌肉造成同等程度的物理破坏，还尚待阐明。
图1 SmartStretchTM操作示意图
Fig.1 Operation diagram of the SmartStretchTM machine
当前，SmartStretchTM技术主要应用于热剔骨的牛羊肉，相关报道已经证实SmartStretchTM技术可明显提高羊肉嫩度[50]，即使成熟5 d[49]后，改善效果依然存在，但在牛肉上的应用却没有表现出令人满意的结果。研究发现，当牛臀中肌[47]应用SmartStretchTM技术后，其长度可以达1.92 μm，和对照的1.7 μm相比，平均增加34%，肌节长度显著增加。此外，处理后牛肉的初始剪切力值为53.6 N，与对照的66.3 N相比降低20%，但是在成熟8 d后，该技术对剪切力值的改善效果不显著。TAYLOR等[51]也发现该技术可以改善牛背最长肌的初始嫩度，但是在成熟14 d之后，改善效果同样不明显。虽然SmartStretchTM技术导致肌肉长度增加，但是对肌节长度无显著影响，可能是牛肉内部发生了一些断裂导致肌肉变长，这与PEN等[52]的研究结果相似，同时PEN还发现SmartStretchTM技术对牛肉剪切力值无影响，嫩化效果较差。为了探究SmartStretchTM技术对不同部位肉嫩度的改善情况，TOOHEY等[53]将该技术应用于成年牛的半膜肌，发现只有成熟时间影响牛肉的剪切力，SmartStretchTM技术对剪切力值无显著影响(P>0.05)，该研究结果与TAYLOR等[51]的研究形成鲜明的对比。很可能是该研究的肉样取自成年牛，结缔组织数量以及交联程度偏大，在一定程度上影响着牛肉的剪切力值。因此，为了更好的理解结缔组织数量和类型对SmartStretchTM改善效果的影响，在后续的工作中有必要对成年牛肉的肌肉结构以及结缔组织对肉本底嫩度的影响进行深入研究。
3.2 存在的问题
SmartStretchTM作为一种新颖的拉伸方法，发展潜力巨大，但是目前针对SmartStretchTM技术的研究较少，其推广过程中也面临诸多挑战。例如，将设备集成到现有生产链的成本、操作人员的培训、处理后肉样嫩度不一致以及热剔骨肉牛屠宰场相对较少等[32]。而且，目前关于SmartStretchTM技术对于牛肉嫩度的影响，只是从剪切力以及肌节长度等方面进行解释，而在肌原纤维蛋白降解以及肌肉的物理结构等方面鲜有研究，为了更好的利用该技术，促进其商业化发展，有必要对上述问题进行深入探究。
4 结语
综上所述，超声波、脉冲电场、SmartStretchTM等技术均能起到改善牛肉嫩度的作用，其中，高强度(10～1 000 W/cm2)低频率(20～100 kHz)超声波可以有效改善牛肉嫩度，而SmartStretchTM技术的嫩化效果稍显不足。因此，根据物种、年龄、肌肉部位等因素来优化工艺参数，并将以上技术进行商业化、工厂化应用成为未来牛肉嫩化研究的新方向。此外，多种嫩化技术的复合应用可以解决单一嫩化技术存在的效果不明显、过度处理等缺陷，如超声波与木瓜蛋白酶的联用[54-55]；冻融与PEF技术的结合[56]都可在一定程度上降低牛肉剪切力值，提高牛肉嫩度，满足市场和消费者对高品质牛肉的需求，多种复合嫩化技术的涌现为牛肉嫩化提供更多可能，也是未来牛肉嫩化研究的重点之一。
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