冰葡萄酒是一种特殊的甜型葡萄酒，因其浓郁的香气特征及独特的口感，被誉为葡萄酒中的“液体黄金”[1]。香气是决定冰葡萄酒质量的一个重要指标，也是当下冰葡萄酒研究的热点[2-3]。冰酒的香气受产地、品种、酿造工艺等多种因素影响。酿造工艺对冰酒香气的影响，主要集中在酵母和发酵温度上[4-5]。
目前在酿酒酵母对冰葡萄酒香气特征性的影响方面已有较多研究，但主要还是以国外研究为主。ERASMUS等[6]比较了7种商业酵母菌株在冰酒酿造中的差异，结果表明ST、N96和EC1118最适宜冰酒生产。CRANDLES等[7]通过对不同酵母(V1116、VL1、EC1118、自然发酵)发酵冰酒香气化合物研究发现，在雷司令冰酒中，EC1118产生的2-甲基-1-丁醇和乙酸异戊酯和癸酸乙酯浓度最高；在威代尔酒中，EC1118产生的大多数化合物浓度最高，但苯乙酸乙酯、葡萄螺烷、对乙烯基愈创木酚和1,1,6-三甲基-1,2-二氢萘在自然发酵的冰酒中含量更高。SYNOS等[8]以品丽珠为原料，使用3种酵母(V1116、EC1118、VL1)进行发酵并和自然发酵进行比对，发现EC1118和自然发酵冰酒的香气活性物质含量最高，但是两者的香气活性物质种类有很大差异。而在我国的冰葡萄酵母的研究中，裴广仁等[9]选用了9种商业酵母进行冰酒发酵，从冰酒的理化指标、风味组成和感官分析3方面综合分析，认为WY1、WY3、WY4 具有发酵优质冰酒的潜力。张小倩等[10]对4种不同酿酒酵母(ST、K1、EC1118、R2)发酵的威代尔冰葡萄酒挥发性化合物进行分析，结果表明，R2酵母发酵的冰葡萄酒中醇类、酯类、羰基化合物的含量具有明显优势，且1-辛烯-3-醇、1-己醇、β-大马士酮、里那醇、香叶醇、1-辛烯-3-酮等香气化合物含量明显高于其他酵母。上述研究可以发现，目前针对不同酵母对冰酒风味影响方面已经进行了较为详细的研究，但是冰酒酿造过程中的香气动态变化规律则鲜有人探究。
因此，本研究以辽宁本溪桓仁的威代尔冰葡萄为试材，采用顶空固相微萃取结合全二维气相色谱质谱联用(headspace solid-phase microextraction coupled with comprehensive two-dimensional gas chromatography time-of-flight mass spectrum, HS-SPME-GC×GC-TOFMS)对其发酵过程中不同时期的香气化合物进行测定分析，研究威代尔冰葡萄酒酵过程中香气化合物的变化规律。该研究不仅能丰富冰葡萄酒风味化学研究的理论基础，同时也为进一步调控冰葡萄酒风味质量提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
原料：2018年威代尔冰葡萄，辽宁本溪桓仁。
酵母：R2酵母，法国Lallemand公司。
试剂：2-辛醇、甲醇、二氯甲烷(色谱纯)，美国 Sigma-Aldrich 公司；NaCl、Na2HPO4、柠檬酸、偏重硫酸钾(分析纯)，上海国药集团试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
Milli-Q超纯水系统，美国 Millipore公司；固相萃取装置，美国 Supelco 公司；Pegasus® 4D全二维气相色谱-飞行时间质谱仪，LECO Corp., St. Joseph, MI, USA；Agilent DB-FFAP色谱柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)， Palo Alto, CA, USA; Restek Rxi-17Sil MS二维色谱柱(1.5 m×0.25 mm，0.25 μm), Bellefonte, PA, USA。
1.3 实验方法
1.3.1 冰葡萄酒发酵及取样
发酵温度(12±1)℃，从发酵第0 天开始，每隔7 d取样1次，直到发酵结束的第42天停止，共7个取样点。
1.3.2 理化指标的测定
冰葡萄酒中总糖、总酸、pH、乙醇体积分数的测定参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行[11]。
1.3.3 HS-SPME-GC×GC-TOFMS定性分析
1.3.3.1 HS-SPME步骤
在20 mL顶空瓶中加入5 mL冰葡萄酒样品及1.5 g NaCl，并添加10 μL 2-甲氧基苯酚-D3(内标物终质量浓度为609.76 μg/L)，具体程序：样品萃取温度为50 ℃，平衡时间为5 min，萃取时间为45 min，萃取时转速为250 r/min。萃取头于250 ℃下解吸附5 min，不分流。
1.3.3.2 GC×GC-TOFMS分析
GC×GC-TOFMS分析及质谱条件参照本课题组前期优化建立的方法[12]。
定性分析：对由Pegasus 4D工作站采集的数据，使用仪器自带ChormaTOF软件来解析，一维色谱峰的峰宽设为24 s，二维色谱峰宽设为0.2 s，自动识别大于200信噪比的色谱峰，然后进行自动积分解卷积和质谱库(NIST14，Wiley 9)比对。相似度大于700作为筛选化合物的标准，去除色谱柱流出物含硅化合物与没有风味贡献的化合物，作为初步鉴定结果。在此基础上，相同条件下分析一系列正构烷烃(C5～C30)的保留时间来确定每个化合物的色谱柱保留指数，并与文献报道的保留指数比对确认，偏差在30以内的化合物作为最终定性的结果。
半定量分析：根据内标物的含量计算定性得到的化合物的相对含量，并进行数据分析。
1.3.4 数据处理
使用Excel 2019对威代尔冰葡萄酒中挥发性化合物定量数据进行计算；使用SPSS 22进行单因素方差分析(ANOVA)；使用SIMCA 13.0进行偏最小二乘法判别分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)。
2 结果与讨论
2.1 理化指标的测定
针对发酵初始第0天的冰葡萄汁和发酵结束第42天的冰葡萄酒的基本理化指标进行了测定，通常发酵冰酒的葡萄汁含糖量介于300～400 g/L，总酸在8～12 g/L。而国标中规定冰葡萄酒的残糖不得低于125 g/L，乙醇体积分数为9%～14%。根据理化指标的检测数据可以看出，采用R2酵母酿造的冰葡萄酒总糖为141.5 g/L，乙醇体积分数为10.2%，均符合冰葡萄酒国家标准和工艺要求[13]。
表1 冰葡萄汁及冰葡萄酒的基本理化指标
Table 1 Chemical composition of the Vidal ice wine juice and Vidal ice wine
理化指标0 d42 dpH3.40±0.053.30±0.05总酸(酒石酸计)/(g·L-1)12.08±0.2512.60±0.36总糖(葡萄糖计)/(g·L-1)322.50±8.20141.50±5.36乙醇体积分数/%010.20±0.54
2.2 发酵过程中冰葡萄酒游离态香气化合物组分分析
2.2.1 冰葡萄酒游离态香气化合物的定性分析
在所有发酵过程中的冰葡萄酒样中共定性出507种挥发性香气化合物，其中酯类131种、萜烯类45种、醇类97种、酸类25种、含氮化合物10种、挥发酚类20种、含硫化合物5种、芳香族化合物68种、内酯类19种、醛类22种、酮类50种、呋喃类15种。各类化合物所占比例如图1所示，其中酯类化合物种类所占的比例最多，占总量的25.84%，其次是醇类、芳香族及萜烯类化合物。
图1 发酵过程中挥发性香气化合物种类汇总
Fig.1 Summary of volatile aroma compounds during fermentation
2.2.2 冰葡萄酒游离态香气化合物的定量分析
通过对发酵过程中酒样的各类别化合物的含量分析发现(图2)，醇类、芳香族类、酯类、酸类、萜烯类、酚类、含氮类、呋喃类、内酯类、醛类化合物的总含量初期都是随着发酵的进行逐渐增加，并在发酵第14天时达到最高，随后含量降低并趋于稳定；而酮类化合物总含量随着发酵的进行一直降低，在发酵第14天时含量达到最低后趋于稳定；含硫类化合物则是随着发酵的进行含量逐渐升高，并在发酵第28天达到最高，随后又逐渐降低。
图2 发酵过程中挥发性香气化合物含量变化
Fig.2 Change of volatile aroma compounds in fermentation process 注:黑色图例化合物含量对应左边纵坐标； 白色图例化合物含量对应右边纵坐标
通过比较发酵初始与发酵结束2个时间点(发酵第0天与发酵第42天)的各类化合物含量发现，除酮类化合物含量减少，酯类、醇类、酸类、萜烯类、内酯类、芳香族类、酚类、醛类、醚类、含氮化合物类、含硫类化合物含量均增加。根据以上的结果，主要针对发酵过程中挥发性化合物中既具有香气特征(与香气物质数据库Flavornet Home进行比对[14])同时具有显著性差异的香气化合物进行汇总分析，结果见表2。
酯类：在发酵过程中酯类化合物的含量有显著性差异的共有22种，其中乙酸异戊酯、乙酸异丁酯、乙酸丁酯、丁二酸二乙酯、丁酸乙酯、十一酸乙酯、戊酸乙酯等的相对含量较高。这些呈果香味的酯类的含量较发酵前都有所增加，乙酸异戊酯(香蕉香)的含量经过发酵后增加了35%，乙酸异丁酯(水果香)、乙酸丁酯(梨香)、丁二酸二乙酯(水果香气)、丁酸乙酯(苹果香气)、十一酸乙酯(椰子香)、戊酸乙酯(水果香)的含量在经过发酵后分别增加了2～3倍。经过发酵后的提供果香的中长链脂肪酸酯的含量增加，会明显的改善冰酒的感官品质[15]，并且这种变化也与以往威代尔冰葡萄酒发酵过程中酯类的变化规律相似[16]。
醇类：发酵阶段挥有显著性变化的醇类共有22种。在发酵结束的酒中，1-己醇、2，3-丁二醇、1-辛烯-3-醇、1-丙醇、3-辛醇的含量较高。经过发酵后，具有花香、甜香、青草味的1-己醇增加了11%，呈水果香气的2,3-丁二醇比发酵前的冰葡萄汁含量增加了2倍，黄瓜香气的2-壬醇增加了3倍。
酸类：在整个发酵过程中，6种酸的含量有显著性差异，其中己酸、丁酸、癸酸、十二酸、戊酸等中长链脂肪酸的含量都增加，这也与葡萄酒发酵发酵过程中羧酸类化合物的变化趋势一致[17]，较高的酸类物质会给葡萄酒风味带来负面影响，但是也有研究显示较低含量的酸可以通过增加香气的复杂性来提高葡萄酒的品质[18]。而乙酸作为高糖胁迫下酵母产生的主要挥发酸，其含量会影响冰到葡萄酒的质量[19]。发酵结束时乙酸的含量比发酵前增加了2倍，并且在发酵结束后乙酸酯的含量增加也可能与乙酸的含量增加相关。
醛、酮类：在GC-MS分离过程中，羰基化合物和酯类的分离比较困难，往往检出率较低[17]，但是在GC×GC-TOFMS的分离下，有较多的羰基化合物检出。醛酮类化合物的总含量随着发酵的进行而降低，在5种具有显著性的醛类中呈柑橘香气的壬醛相对含量最高，其次是呈杏桃香气的桃醛，且这5种醛在发酵结束后含量都降低。酮类中的呈奶油香气阈值的2,3-丁二酮含量较发酵前明显降低，但呈热牛奶香气的2-壬酮的含量却从6.97 g/L增加到了43.60 g/L。
萜烯类：萜烯类化合物虽然在葡萄酒中含量较低，但因其较低的阈值，而对葡萄酒的香气有较大的贡献。经过发酵，具有显著性差异的萜烯化合物共有24种，其中冰葡萄酒中比较重要的物质，如呈现花香的橙花醚、玫瑰醚和蜂蜜香气的β-大马酮、花香和木香的芳樟醇、柠檬香气的松油烯[20]的含量都比较高。萜烯含量的增加，一方面可能在冰酒较长的发酵时间中通过酸解对糖苷结合态的萜烯类化合物进行较好的释放，另一方面也有可能R2酵母具有β-葡萄糖苷酶的活性，通过酶解对结合态香气进行释放，其具体释放原因还有待进一步研究。
芳香族类：苯甲醇、苯乙醇、苯甲酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯的含量都比较高，且这些物质都主要呈现花果香和甜香，尤其是呈现玫瑰香气的乙酸苯乙酯的含量最高，其次是苯乙醇含量在发酵结束时有明显增加，其不仅可在发酵过程中形成，也可由结合态香气前体释放[21]，这种增加也在之前的研究中有相关报道[18]。其他几种芳香族化合物也有不同程度的增加，但是没有苯乙醇的含量增加显著。
2.2.3 PLS-DA分析
将具有显著性差异的挥发性化合物进行PLS-DA分析，最终，有36个化合物的变量投影重要性值大于1.0。根据这36个差异化合物作图(图3)，7个取样点的样品聚集在不同的分区，其中发酵前期3个取样点的差异明显，也就说明在发酵初始阶段，葡萄汁中的挥发性香气化合物的种类与含量会随着发酵的进行产生很大的变化，发酵第0天与己酸己酯、2,3-戊二酮、2,3-丁二酮、香草酸乙酯相关性较高，发酵第7天则与香叶醇相关，发酵第14天与壬醛、1-辛烯-3-酮、乙酸异丁酯、乙酸丁酯、2,3-丁二醇、丁酸甲酯、苯酚相关。在发酵的后期冰葡萄酒中的挥发性成分已经趋于一个较稳定的状态，到发酵中后期的样本则比较聚集，主要与香茅醇、芳樟醇、3-辛酮相关；发酵结束的第42天则与水芹烯、1-丁醇、松油烯、γ-萜品烯、DL-柠檬烯、1,4-桉叶素、芳樟醇氧化物等化合物相关。最终经过酵母发酵，冰葡萄汁和冰葡萄酒的挥发性组分已经有了明显区别。果酒经过酵母发酵后，无论是香气物质的种类和含量都会发生一定变化，与孙佳勰等[22]研究发现发酵初始与发酵结束后香气物质产生显著差别，而发酵后期香气变化相对较小，样本则更为集中的结果相一致。
图3 发酵过程中挥发性香气化合物PLS-DA图
Fig.3 Volatile aroma compounds analysis with PLS-DA
3 结论
本研究采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析了R2酵母发酵威代尔冰葡萄酒在发酵过程中香气化合物的变化规律，结果表明，R2酵母发酵后冰葡萄酒的挥发性组分较初始发生了明显变化，醇类、芳香族类、酯类、酸类、萜烯类、酚类、含氮类、呋喃类、内酯类、醛类化合物的总含量都是随着发酵的进行逐渐增加，并在发酵第14天时达到最高，随后含量降低并趋于稳定。而酮类化合物总含量随着发酵的进行一直降低，在发酵第14天时含量最低后趋于稳定；含硫类化合物则是随着发酵的进行含量逐渐升高，随后又逐渐降低。此外，通过对比发酵前后结合态化合物含量变化，发现发酵结束时，除酮类化合物含量减少，其他类化合物含量均增加。PLS-DA分析结果表明发酵前期(0、7、14 d)挥发性化合物变化较为显著，到发酵中后期的样本则相对变化较小，挥发性化合物趋于一个较稳定的状态。
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