兔肉具有极高的营养价值，其营养组成符合现代饮食理念，深受消费者的喜爱[1]。但由于兔子体型较小且骨头较多，在加工过程中不可避免地会产生一定量的碎肉，造成了极大的损失。近年来，重组肉在肉制品行业的发展受到越来越多的关注，重组肉是将多余的碎肉合理利用起来，并通过一些技术手段改善产品的外观、结构、风味等品质，使其营养价值和感官特性达到消费者的需求。鉴于此，将生产过程中不能被利用的兔肉进行重组制成肉制品，不仅能满足人们对营养的需求，还可以提高兔肉利用率。
由于重组肉通常是将不同种类的肉制成肉糜后再重新组合，因此，相较于传统肉制品来说，重组肉的持水力和质构特性等品质特性相对较差。鉴于此，工业生产中通常使用黏合剂去改善重组肉制品的品质。黏合剂可以在非热条件下促进蛋白质之间的交联，既避免了因热处理所引起的营养流失和肌肉成分氧化等不良现象，又赋予重组肉制品良好的质地和黏合特性。CANTO等[2]以添加了转谷氨酰胺酶(transglutaminase，TGase)的重组牛肉排为实验组，以未添加TGase为对照组，发现添加TGase后重组牛肉排的弹性和黏度值得到明显提高。虽然以微生物产生的TGase作为黏合剂应用研究较多，但由于其成本高，不适合大规模生产[3]，因此，寻找新型黏合剂成为一种趋势。葡萄糖酸-δ-内酯可以促进酸诱导的肌原纤维蛋白凝胶的形成，常被作为凝固剂、酸化剂以及品质改良剂应用于食品领域，但由于单独过量添加可能造成水分的流失，因此葡萄糖酸-δ-内酯不适合单独添加到肉制品中[4-5]。β-葡聚糖是由葡萄糖单体组成的水溶性多糖，在一定分子质量和分子结构的条件下，β-葡聚糖具备较好的黏度和凝胶特性[6-7]，在食品中常常被用作增稠剂。另外，有研究表明，β-葡聚糖能提高肉糜制品的保水性，并具有保护脂肪、促进凝胶形成的作用[8]。酪蛋白酸钠是一种盐溶性蛋白，在一定条件下，它能促进肌原纤维蛋白凝胶的形成，从而改善肉制品的质地[9]。由此可见，β-葡聚糖、酪蛋白酸钠、葡萄糖酸-δ-内酯和卡拉胶等可以作为黏合剂单独或复合使用，应用于重组肉的生产。然而，在目前的研究中，将β-葡聚糖、酪蛋白酸钠和葡萄糖酸-δ-内酯按照一定比例配成复合黏合剂的研究未见报道。
本课题组根据前期工艺优化的结果，得到重组兔肉排最佳的复合黏合剂配方为：0.86%β-葡聚糖，1.5%酪蛋白酸钠以及0.25%葡萄糖酸-δ-内酯(均为质量分数)。鉴于此，该试验以伊拉兔后腿碎肉为原料，配比一定比例的猪肉制作重组兔肉排，探讨重组兔肉排在重组24 h内基本理化特性、凝胶强度、流变学特性以及微观结构的变化，并对复合黏合剂在重组过程中的作用机理进行研究，以期为黏合剂在重组兔肉排的应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
伊拉兔，购于重庆市阿兴记食品有限公司，屠宰后取后腿肉，封装于聚乙烯自封袋中，放于取样箱快速运回实验室，待肉排酸后放于-18 ℃冰箱中冷冻贮藏备用；猪肋条肉，购于重庆北碚天生路永辉超市。
复合磷酸盐，购于河南巧手食品添加剂有限公司；β-葡聚糖、酪蛋白酸钠、葡萄糖酸-δ-内酯、红曲红，购于河南三化生物科技有限公司；大豆分离蛋白、谷氨酰胺转氨酶，购于河南千志商贸有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯，购于成都市科龙化工试剂厂。
1.2 仪器与设备
5810型台式高速离心机，德国Eppendorf 公司；CM-21型斩拌机，西班牙Mainca 公司；Avanti J-301型高速冷冻离心机，美国贝克曼库尔特公司；XHF-D型高速分散器，宁波新芝生物科技股份有限公司；ZWY-2102C型恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；PB-10型酸度计，赛多利斯科学仪器有限公司；DHR-1型流变仪，美国TA公司；JSM-7800F型扫描电子显微镜，日本电子株式会社；CT-3型物性分析仪，美国Brookfield公司。
1.3 试验方法
1.3.1 基础配方
原料为100 g的兔肉和猪肉的混合肉糜(兔肉与猪肉质量比为4∶1)，辅料添加配比为大豆分离蛋白2%，食盐2%，复合磷酸盐0.3%，谷氨酰胺转氨酶0.5%(酶活100 U/g)，红曲红0.006%(均为质量分数)；黏合剂配方为β-葡聚糖0.86%，酪蛋白酸钠1.5%，葡萄糖酸-δ-内酯0.25%(均为质量分数)。
1.3.2 重组兔肉排的制备
重组兔肉排的制备工艺：
原料兔肉、猪肉在1～4 ℃解冻过夜，搅碎成肉糜→肉糜和辅料混合，加入一半水混合3 min→加入复合黏合剂后，加入另一半水斩拌混合3 min→通过3.5 mm 筛板(6目筛子)，得到均匀混合物→用馅饼制作器下压成型→聚乙烯自封袋密封→在4 ℃下储存24 h→低温重组后置于-18 ℃中保存备用。
1.3.3 基本成分的测定
水分、灰分、脂肪和蛋白质含量的测定：分别参照GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》[10]、GB 5009.4—2016《食品中灰分的测定》[11]、GB 5009.5—2016《食品中粗蛋白的测定》[12]、GB 5009.6—2016《食品中粗脂肪的测定》[13]。
1.3.4 pH的测定
根据GB 5009.237—2016[14]稍作修改。称取7.5 g KCl于1 000 mL 容量瓶中，加水溶解，用水稀释至刻度。称取2.5 g肉样剪碎，加入25 mL KCl溶液，10 000 r/min条件下均质处理，将电极插入均质液中，待数字变化稳定后读数。每个样品测定3次，结果取平均值。
1.3.5 凝胶强度的测定
凝胶强度的测定根据孙钟雷[15]的方法，稍作修改。采用物性分析仪测定样品的凝胶硬度。仪器参数设置如下：测量长度10 mm，圆柱直径20 mm，形变7 mm，始发点负载4 g，测试速度1.00 mm/s，探头TA5。
1.3.6 流变特性的测定
参考王亚娜[16]的方法，稍作修改。仪器校准后，将肉糜样品置于流变仪的平台，采用夹具直径为50 mm平行板，间距为1 000 μm，在振荡模式及1%应变的线性黏弹性线性区域内分别进行动态频率扫描测试和动态温度扫描测试。动态温度扫描首先取适量重组兔肉排样品置于测试平台上，涂布均匀，赶走气泡并小心刮走夹具外多余样品，其测定参数为：狭缝设置为0.5 mm，频率为1 Hz，应变为1%，样品从20 ℃线性升温至85 ℃，记录肉糜的储能模量(G′)随温度升高的变化情况。
1.3.7 质构的测定
根据白登荣[17]的方法适当修改。制备好的样品从4 ℃条件下取出放于室温下静置30 min，放入蒸煮袋中，放于水浴锅加热使样品中心温度达到80 ℃，取出肉块，冷却至室温，将待测样品置于测定台上放好，用物性分析仪对肉块进行测定。测定参数设置如下：探头类型：P/36R；测前速度：5 mm/s；测中速度：1 mm/s；测后速度：1 mm/s；下压距离：7 mm；触发点负载：5.0 g，触发类型：Auto；数据攫取速率：200 Hz；停留时间：5 s；循环次数：2次。每个试样测定3次，结果取平均值。
1.3.8 微观结构的观察
参考李少博[18]的方法将煮熟的重组兔肉排凝胶切成2～5 mm的立方体，用4 ℃的体积分数为2.5%的戊二醛溶液15 mL固定24 h，然后用0.1 mol/L磷酸盐缓冲盐水(pH 6.8)洗涤3次，每次10 min。将凝胶样品在50%、70%、80%、90%和100%(体积分数)乙醇中脱水10 min，连续3次。用V(100%乙醇)∶V(叔丁醇)=1∶1置换15 min后，将凝胶样品真空冷冻干燥24 h。使用扫描电子显微镜在5 000×放大倍数，5 kV的加速电压下观察兔肉排凝胶的微观结构。
1.4 数据处理
所有数据使用SPSS 22.0软件进行显著性分析，P<0.05为显著，P>0.05为不显著。结果运用Origin 8.6软件绘图。
2 结果与分析
2.1 复合黏合剂对重组兔肉排组成成分的影响
由表1可知，在重组的12 h内处理组兔肉排水分含量显著低于对照组(P<0.05)，这可能是由于在黏合初期，复合黏合剂的加入使细胞渗透压增大，导致兔肉排失水；而在12 h后处理组与对照组的水分含量不存在显著性差异(P>0.05)，这可能是与对照组水分含量下降有关。总的来看，对照组水分含量随重组时间的延长整体呈现下降趋势，处理组水分含量较为稳定，可能是由于高黏度的β-葡聚糖和酪蛋白酸钠形成的网络状结构吸收了周围水分子，从而增强了兔肉排的保水性[19]。
加入复合黏合剂后兔肉排蛋白质含量显著高于对照组(P<0.05)，但重组时间对蛋白质无显著影响(P<0.05)，这可能是加入的酪蛋白酸钠贡献了蛋白质含量占比，这也表明酪蛋白酸钠可以作为一种蛋白质的营养补充剂加入到肉制品中[20]。
在脂肪的测定中可以看到，脂肪含量不受重组时间的影响(P>0.05)，但受到复合黏合剂添加的影响。在处理组中脂肪含量显著低于对照组(P<0.05)，这可能是由于β-葡聚糖和酪蛋白酸钠的添加使重组肉的脂肪含量占比降低。
在重组的24 h内，对照组和处理组灰分的含量没有发生显著变化(P>0.05)。但加入复合黏合剂后处理组的灰分含量显著高于对照组(P<0.05)，这可能是酪蛋白酸钠的添加增加了兔肉排中无机盐的含量。
表1 对照组和处理组兔肉排的组成成分分析表
Table 1 Composition analysis table of control and treatment
注：小写字母表示同一组样品不同时间的差异显著性，不同则表示差异显著(P<0.05)，相同则表示差异不显著(P>0.05)；大写字母表示同一时间对照组和处理组的差异显著性，不同则表示差异显著(P<0.05)，相同则表示差异不显著(P>0.05)(下同)
时间/h水分含量/%粗蛋白/%粗脂肪/%灰分/%对照组处理组对照组处理组对照组处理组对照组处理组070.97±0.19Aa68.64±0.21Bb20.96±0.99Ba23.52±0.31Aa4.52±0.21Aa2.67±0.29Ba1.79±0.18Bab2.44±0.21Aa668.62±0.38Bc69.25±0.48Aa21.45±0.92Ba23.84±0.81Aa4.65±0.98Aa2.55±0.38Ba1.67±0.24Bb2.31±0.24Aa1269.58±0.44Ab67.92±0.32Bb21.93±0.70Ba23.44±0.72Aa4.43±0.68Aa2.97±0.41Ba2.08±0.18Ba2.66±0.30Aa1868.82±0.25Ac68.35±0.54Ab21.18±0.45Ba24.22±0.27Aa3.94±0.53Aa2.57±0.25Ba1.95±0.08Bab2.78±0.33Aa2468.71±0.43Ac68.69±0.20Ab22.29±0.64Ba23.92±0.78Aa4.74±0.65Aa2.31±0.40Ba1.87±0.33Bab2.53±0.22Aa
2.2 复合黏合剂对重组兔肉排pH和凝胶强度的影响
2.2.1 pH
pH是评估肉制品品质的关键指标，与肉制品的色泽、嫩度和风味等品质的变化存在一定的相关性[21]。如图1所示，在0 h时，处理组兔肉排的pH显著低于对照组(P<0.05)，这可能是因为加入了呈酸性的葡萄糖酸-δ-内酯，故导致体系的pH下降。在重组过程中，处理组兔肉排的pH总体维持在5.87～5.91，表明重组时间对处理组pH的影响不显著(P>0.05)；而对于对照组来说，随着重组时间的延长，其pH显著降低(P<0.05)。产生这种现象的原因可能是在处理组中，葡萄糖酸-δ-内酯的添加对微生物活性和蛋白质降解具有一定抑制作用，减少了微生物产酸和蛋白质降解产酸的程度，所以其pH值相对稳定[22]。CHUN等[4]研究也表明，葡萄糖酸-δ-内酯在一定程度上可抑制微生物的活性，减少了微生物产酸的程度。而在对照组中，随着重组时间的延长，蛋白质被分解成氨基酸，氨基酸脱氨作用生成α-酮酸等酸性物质，从而导致pH下降[23]；此外，微生物在厌氧条件下可以分解肉排中的糖和淀粉等碳水化合物，无氧呼吸过程中生成的乳酸、醋酸等有机酸也会导致pH下降[24]。
图1 重组过程中对照组和处理组兔肉排的pH变化
Fig.1 pH changes in the control and treatment groups during the recombination
2.2.2 凝胶强度
凝胶强度是指凝胶崩裂或断裂时单位面积所受的力，反映凝胶内部结构的坚实程度[25]。如图2所示，在处理组中，凝胶强度在0～12 h显著增加(P<0.05)，在24 h基本保持不变(P>0.05)。而对于对照组来说，虽然凝胶强度在重组前期(0～6 h)和重组后期(16～24 h)也呈现显著增加趋势(P<0.05)，但在整个重组过程中，对照组的凝胶强度始终显著低于处理组(P<0.05)。有研究指出[26]，凝胶强度与多糖的添加量成正比，因此，在处理组中，β-葡聚糖与蛋白质在重组过程中的相互作用会促进稳定的高分子化合物的形成，进而增强了兔肉排在重组过程中的凝胶强度。
2.3 复合黏合剂对重组兔肉排质构特性的影响
由表2可知，重组兔肉排的质构特性显著受到复合黏合剂的影响。在重组的24 h内，对照组和处理组兔肉排的硬度均显著增大(P<0.05)，且处理组兔肉排的硬度的显著高于对照组(P<0.05)。这可能是由于在重组的过程中，凝胶网络结构的形成使硬度增大，而对于处理组来说，酪蛋白酸钠的加入增强了蛋白质之间的交联，导致肉排表面结构紧凑而坚硬；此外，β-葡聚糖是水溶性纤维，可以与水形成稳定的网络结构，导致整个体系自由水含量下降，从而提高了重组肉排的硬度[5]。对于弹性、内聚性、胶着性和咀嚼性来说，复合黏合剂的添加能使兔肉排胶着性和咀嚼性显著增加(P<0.05)，弹性和内聚力显著降低(P<0.05)；随着重组时间的变化，处理组中的弹性、内聚性、胶着性和咀嚼性不受重组时间的影响(P>0.05)，而在对照组中，重组兔肉排的弹性、内聚性、胶着性和咀嚼性随着重组时间的延长呈现不规律的显著性差异(P<0.05)。这种不规律的差异可能是多次重复试验所造成的，因此，这同时也表明复合黏合剂的加入能更好地维持重组兔肉排最初的质构特性，这与曹莹莹等[27]的研究一致。
图2 重组过程中对照组和处理组兔肉排凝胶强度的变化
Fig.2 Binding strength in the control and treatment groups during the recombination
表2 重组过程中兔肉排质构特性变化
Table 2 Textural profile analysis changes in the restructuring process
时间/h对照组处理组硬度/g弹性/mm内聚性胶着性/g咀嚼性/mJ硬度/g弹性/mm内聚性胶着性/g咀嚼性/mJ011 119.68±774.32Bd0.89±0.025Ab0.82±0.026Aa9 480.69±1 992.33Bb8 468.99±1 998.68Bb11 908.42±772.86Ac0.93±0.042Aa0.73±0.049Ba12 275.59±831.50Aa11 490.69±1 222.99Aa612 580.99±951.72Bc0.88±0.005 1Ab0.77±0.072Aa11 603.43±748.87Ba10 265.87±716.96Bab15 997.77±983.90Ab0.92±0.052Aa0.74±0.057Ba11 940.15±2 657.31Aa11 035.31±3 039.46Aa1214 802.25±625.43Bb0.95±0.039Aa0.73±0.065Ba12 571.01±295.562Aa11 925.50±776.61Aa16 830.76±47.93Aab0.94±0.020Aa0.75±0.059Aa11 990.77±1 522.90Ba11 320.33±1 672.60Ba1815 804.89±674.18Bb0.91±0.039Bab0.76±0.057Aa11 787.02±448.5Ba12 466.66±2 188.29Ba17 926.15±1 235.43Aa0.94±0.044Aa0.75±0.071Aa13 620.37±1123.14Aa12 890.61±1 556.93Aa2417 203.80±262.99Ba0.95±0.002 7Aa0.82±0.044Aa9 151.46±1 117.05Bb8 651.64±1 033.34Bb18 301.05±1 328.40Aa0.91±0.026Ba0.77±0.063Ba13 181.49±2 506.63Aa12 012.27±2 596.35Aa
2.4 复合黏合剂对重组兔肉排流变特性的影响
2.4.1 频率扫描
如图3所示，在相同的振荡频率下，随着重组时间的延长，兔肉的储能模量G′呈增长趋势。重组过程使肉糜中蛋白质发生交联，肉糜蛋白分子之间形成比较稳定的凝胶网络结构，从而促使肉糜剪切应力τ增加，导致储能模量G′上升[28]。对照组与处理组类似，但储能模量显著低于处理组，这可能是由于加入的黏合剂使处理组体系变稠，李可等[29]的研究也表明，β-葡聚糖可促使其纤维结构中亲水基团与水结合，促使蛋白质之间发生交联，形成稳定的三维网络结构，增强蛋白质凝胶的流变特性。
a-对照组；b-处理组
图3 重组过程中兔肉排储能模量G′随频率的变化
Fig.3 Change of energy storage modulus G′ of rabbit steak with frequency during recombination
2.4.2 动态温度扫描
吴满刚[30]在对肌原纤维蛋白的加热过程中，发现储能模量变化一共经历3个过程，分别为：“gel setting”、“gel weakening”和“gel strengthening” 3个区域。25～50 ℃，即“gel setting”区，由于低温区域肌球蛋白头部发生结合，蛋白分子之间交联，通过氢键作用初步形成蛋白质分子网络结构，导致储能模量G′缓慢增加；50～60 ℃，即“gel weakening”区，储能模量G′呈现出明显的降低趋势，可能是因为肌肉中内源性蛋白水解酶在此区域有较高活性，可将蛋白质水解，也可能是肌动蛋白-肌球蛋白网络结构的解离和肌球蛋白尾部的变性，导致肌球蛋白的头部结合部位崩溃瓦解[31]，或者温度的升高使初步形成蛋白网状结构的氢键因加热受到破坏。60～90 ℃，即“gel strengthening”区，使初步形成蛋白网状结构的蛋白之间通过头部二硫键和疏水相互作用联结，尾部的横向连接等方式发生聚集和其他变性蛋白的沉积，形成富有高度黏弹性的凝胶网络结构，从而促使G′急剧增加。
如图4所示，可以看到随着重组时间的增加，重组兔肉排储能模量都呈现增加的趋势。处理组的重组兔肉排在开始加热之前的储能模量明显高于对照组，且储能模量在20～25 ℃有所降低。处理组兔肉排的第1个G′峰值在50～51 ℃，而对照组的第1个G′峰值大致在49 ℃出现。试验表明，处理组兔肉排的第1个G′峰有明显滞后的现象，说明加入了复合黏合剂可能改变了肌球蛋白的二级结构或空间构象。在55 ℃时对照组和处理组兔肉排的G′开始迅速增加，在75～85 ℃出现第2个峰。处理组兔肉排的G′峰值出现在75 ℃左右，对照组G′的峰值出现在接近80 ℃的位置，而后2组的G′随着温度上升显著下降。这可能是由于高温使聚集交联的蛋白质分子之间再次解链[32]，导致G′升高后再降低。在振荡温度扫描过程中，处理组兔肉排的G′显著高于对照组，这表明加入黏合剂后的重组兔肉排的黏弹性和凝胶网络完整度要优于对照组，但在高温时的热稳定较差。
a-对照组；b-处理组
图4 重组过程中兔肉排储能模量G′随温度的变化
Fig.4 Change of energy storage modulus G′ of rabbit steak with temperature during recombination
2.5 复合黏合剂对重组兔肉排微观结构的影响
图5所示为兔肉排在重组过程中微观结构变化，可以发现其在网络的完整性、密度以及均匀程度方面具有明显的肉眼可见的结构差异。在前12 h内对照组和处理组中兔肉排的微观结构呈现疏松到紧密的趋势，肉糜的缝隙逐渐缩小，孔径也更加均匀。随着重组时间的继续增加，在18 h时，对照组中这种紧密均匀的结构开始瓦解，肉排缝隙开始变大，在24 h时缝隙继续变大，并且出现聚集结块现象；相反，在处理组中，肉排在18和24 h时仍能较好地维持紧密均匀的结构。结果表明，复合黏合剂的更好地维持了重组肉排紧密均匀的微观结构，这可能是由于复合黏合剂的加入，增强了肉排的保水性，避免了水分的流失，防止肉糜结块。此外，黏合剂的加入可以促进重组肉排三维凝胶网络结构的形成，使重组肉排的空间结构更加紧密均匀[33]。总体来看，加入黏合剂的兔肉排缝隙较小且分布均匀，表明复合黏合剂的添加改善了重组肉排凝胶质地，更好地维持了三维空间结构。综上所述，0.86% β-葡聚糖，1.5% 酪蛋白酸钠以及0.25% 葡萄糖酸-δ-内酯的复合黏合剂可以作为一种品质改良剂应用于重组兔肉排。
图5 重组过程中对照组和处理组兔肉排的微观结构
Fig.5 Microstructure of rabbit steak in control group and treatment group during recombination
3 结论
复合黏合剂的加入对兔肉排重组过程中的基本理化性质、质构特性、凝胶强度、流变学特性以及微观结构影响显著。结果表明，加入复合黏合剂能较好地保持重组兔肉排的水分、提高蛋白含量，降低脂肪含量和维持pH的稳定；对质构特性和凝胶强度来说，复合黏合剂可以使兔肉排的硬度和凝胶强度增大，弹性、内聚性、胶着性以及咀嚼性保持稳定；流变学特性的结果表明，重组时间的延长和复合黏合剂的加入都能使兔肉排的储能模量增大；扫描电镜的结果表明，复合黏合剂可以使兔肉排的结构更加紧密均匀，并防止因重组时间延长而引起的孔隙变大和结块现象。综上所述，复合黏合剂的加入会影响兔肉排的基本理化性质、质构特性、凝胶强度、微观结构和流变学特性，从而改善兔肉排的贮藏和食用品质，表明复合黏合剂可以作为一种品质改良剂应用于重组兔肉排。
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