福建永春老醋，别名福建红曲陈醋，是我国四大名醋之一，其产品特点是能够产生一种令人愉快的香气，食用起来具有酸而不涩、酸中有甜和浓香醇厚的独特风味，其产品是以红曲、糯米、芝麻和白糖等为主要原料，在不同微生物共同参与下完成的生物转化的液态发酵过程中形成[1-4]，细菌和真菌的组成随着陈醋生产阶段不同而发生变化，对陈醋品质形成过程起着不同作用，在醋醅发酵过程中，菌群数量变化主要体现在酵母菌和细菌数量的变化，酵母菌和细菌数量均呈先增后减的趋势，相比之下其他菌群的数量则较小[5]。酿造过程中微生物群落的变化对食醋的风味具有重要影响，研究发现食醋酿造中细菌群落对风味的相关性高于真菌群落，表明细菌群落是醋味的主要生产者[6]。高通量测序技术具有准确、快速和高效的检测性能，已成为当前研究环境微生物群落结构和功能的主流技术[7]，该技术在食品微生物领域的研究也越来越受关注。目前，对永春老醋微生物的报道多为传统的微生物菌种构建、优势菌分离纯化以及菌种保藏等研究[8-9]，运用Illumina Miseq高通量测序技术分析永春老醋不同品质阶段细菌和真菌优势菌群变化趋势的研究尚无相关报道。
本研究采用Illumina Miseq高通量测序技术，分别以16S rRNA和18S rRNA基因为分子标记，对发酵中、1个月成品、1年陈酿和10年陈酿4个主要品质形成阶段的永春老醋中细菌与真菌群落多样性动态变化进行分析，拟获得永春老醋不同阶段具有优势作用的微生物群落组成特征，为初步探究永春老醋不同阶段微生物组成变化对食醋风味的影响提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 样品采集与处理
于福建省永春老醋醋业有限责任公司采集发酵中(Y1)、1个月成品(Y2)、1年陈酿(Y3)和10年陈酿(Y4)4个具有代表性的不同生产和保存阶段样品，分别各自混匀后，各取200 mL，用0.22 μm的水系微孔滤膜(Merck Millipore公司，美国)进行抽滤，将抽滤后收集有微生物的滤膜存放在-80 ℃下，经冻干后的样品用于总DNA提取。
1.2 样品总DNA提取
用消毒剪刀将收集有微生物的滤膜剪碎，采用FastDNA Spin Kit For Soil试剂盒(MP Biomedicals公司，美国)提取总DNA，应用核酸提取仪(MP Biomedicals公司，美国)，均质条件为18 s和4.5 m/s，提取步骤参照说明书进行。将获得的总DNA用70 μL DES溶液收集，核酸测定仪测定DNA浓度和纯度后贮存于-80 ℃下备用。
1.3 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增及测序
用带有Barcode序列[10]的引物对338F/806R[11]和817f/1196r[12]分别作为细菌16S rRNA基因和真菌18S rRNA基因引物。其中，16S rRNA基因用引物338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′和806R：5′-GGACTACHVGGTWTCTAA-3′；18S rRNA基因用引物817f：5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′和1196r：5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′。分别用16S rRNAX和18S rRNA基因引物对提取的样品总DNA进行PCR扩增。16S rRNA基因扩增条件：95 ℃、2 min，95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min(33个循环)，72 ℃、5 min。18S rRNA基因扩增条件：95 ℃、3 min，95 ℃、30 s，54 ℃、30 s，72 ℃、45 s(35个循环)，72 ℃、10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证后，取足够量送至上海美吉生物医药科技有限公司，在Illumina Miseq平台上测序。
1.4 数据分析
去除原始序列中的引物序列与Barcode序列，得到PE-reads，利用Flash软件[13]将所得到的PE-reads拼接成一条序列，并用QⅡME v.1.7.0软件进行分析[14]。运用Uclust软件[13]以97%的阈值进行操作分类单位(operational taxonomic unit，OTU)划分，从而实现对序列聚类。然后通过核糖体数据库项目(ribosomal database project，RDP)Classifier软件[15]和SILVA数据库[16]将提取出来的每个OTU序列的分类信息进行注释。利用Mothur v1.30.1软件对相似水平高于97%的OTUs进行α-多样性分析，内容包括覆盖率(Coverage)、Chao指数和Shannon指数，从而评估单样品内微生物群落的丰富度和多样性。通过R语言统计和作图工具来进行物种组成分析，包括物种Venn图和群落组成分析[17]，运用R语言软件进行层级聚类分析，对微生物的β-多样性进行分析。获得的16S rRNA和18S rRNA基因DNA序列已收录于NCBI数据库的Sequences Read Archive(SRA)，登录号分别为SRP222992和SRP222989。
2 结果与分析
2.1 α-多样性分析
由表1可知，4个阶段永春老醋样品中微生物Coverage指数均大于0.99，说明样品中绝大多数DNA序列都被测出，即测序深度可以反映出样品中微生物的真实情况。就细菌而言，除在10年陈酿(Y4)样品中未检测到外，前3个阶段样品之间细菌的OTU总数区别不大，其中1个月成品(Y2)的OTU数量相对较高；1个月成品(Y2)的Chao指数最大，物种丰富度最大；3个样品的Shannon指数区别不大，说明前3个阶段的细菌生物多样性差别较小。就真菌而言，1年陈酿(Y3)的OTU数量最少，而且1个月成品(Y2)、1年陈酿(Y3)与发酵中(Y1)、10年陈酿(Y4)的OTU总数相差较大；1个月成品(Y2)的Chao指数最小，物种丰富度最小，发酵中(Y1)、1个月成品(Y2)和1年陈酿(Y3)的Shannon指数差别不大，但是10年陈酿(Y4)比其他样品高很多，说明前3个阶段样品的真菌多样性差别较小，10年陈酿(Y4)的真菌多样性较好。以上可以得出，永春老醋前3个阶段中细菌物种丰度显著高于真菌，而在10年陈酿(Y4)中，真菌生物的丰度大幅增加，可能是由于贮存10年后老醋中的优势菌群为酵母菌。
表1 永春老醋不同阶段α-多样性指数
Table 1 The α-diversity index of Yongchun aged vinegar at the different stages
注：“-”表示无
样品名称16S rRNA基因18S rRNA基因CoverageChaoShannonOTU数量CoverageChaoShannonOTU数量发酵中(Y1)0.9922.331.11221.0016.000.2116成品1月(Y2)0.9926.251.18260.9911.500.0811成品1年(Y3)0.9924.331.00240.9913.000.0810成品10年(Y4)----1.0016.001.3316
2.2 物种Venn图分析
如图1-a所示，发酵中(Y1)、1个月成品(Y2)和1年陈酿(Y3)样品中的OTU数一共为27个。3个样品共有的OTU数为19个，除发酵中(Y1)特有1个OTU外，其他样品无特有OTU存在。说明3个样品物种组成较为相似，单独存在于各样品的物种极少；真菌OUT数量如图1-b所示，4个阶段样品中的OTU数一共为24个，4个样品中共有的OTU数为8个，单独存在于发酵中(Y1)、1个月成品(Y2)和10年陈酿(Y4)的OTU数分别为5、1和7，相比较而言，发酵中(Y1)和10年陈酿(Y4)的真菌群落组成较为特殊。
a-OTU水平下细菌韦恩图；b-OTU水平下真菌韦恩图
图1 OTU水平下永春老醋不同阶段中细菌和真菌韦恩图
Fig.1 Venn diagram of bacterial and fungal OTU number at the different stages of Yongchun aged vinegar
2.3 微生物群落结构组成分析
2.3.1 细菌群落结构组成
在门水平下，永春老醋在发酵中(Y1)、1个月成品(Y2)和1年陈酿(Y3)样品中共检测出2类细菌物种。
由图2可知，3个阶段样品主要优势细菌物种均为变形菌门(Proteobacteria)，相对丰度分别为67.44%、68.46%和75.14%；其次是厚壁菌门(Firmicutes)，相对丰度分别为32.53%、31.51%和24.85%。结果表明，3个阶段的细菌群落结构组成相近，只是1年陈酿(Y3)样品的组成比例与前两个阶段稍有差异。变形菌门中大部分为好氧型或自养型细菌，永春老醋发酵和前期贮存过程中搅拌通氧、产酸环境为这些细菌提供了有利的生长环境，使这类细菌相对丰度较高；厚壁菌门中大多数为厌氧细菌，这类细菌能在高酸环境下生长并且对维持食醋酸度具有重要作用[18]，因而永春老醋发酵和前期贮存过程中存在相对丰度低于变形菌门的厚壁菌门细菌群落。
图2 门水平下永春老醋发酵中(Y1)、1个月成品(Y2)和1年陈酿(Y3)3个阶段细菌群落结构
Fig.2 Bacterial communities of Yongchun aged vinegar in three stages of fermentation, 1-month product and 1-year storage at the phylum level
在纲水平下，永春老醋在发酵中(Y1)、1个月成品(Y2)和1年陈酿(Y3)样品中共检测出4类细菌物种。相对丰度>1%的物种如图3所示，3个阶段的优势菌纲分别是α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)和芽孢杆菌纲 (Bacilli)，α-变形菌纲的相对丰度分别为67.41%、68.25%和75.04%，芽孢杆菌纲的相对丰度分别为32.53%、31.51%和24.85%。3个阶段中α-变形菌纲的相对丰度与变形菌门的相对丰度非常接近，说明3个阶段细菌物种在变形菌门水平下主要为α-变形菌纲，同时包含少量其他物种；芽孢杆菌纲的相对丰度与厚壁菌门的相对丰度完全一致，说明细菌物种在厚壁菌门水平下均为芽孢杆菌纲。α-变形菌纲菌群多为专性好氧菌，是食醋酿造中将糖类和醇类物质氧化为有机酸的主要微生物[19]；芽孢杆菌纲菌群为兼性厌氧菌，这类微生物含有的特殊酶系能够将大分子糖类物质和蛋白质分解为葡萄糖和简单肽段，为α-变形菌纲菌群提供可利用的有机物质。
图3 纲水平下永春老醋发酵中(Y1)、1个月成品(Y2)和1年陈酿(Y3)3个阶段细菌群落结构
Fig.3 Bacterial communities of Yongchun aged vinegar in three stages of fermentation, 1-month product and 1-year storage at the class level
在属水平下，永春老醋前3个阶段样品一共检测出13类细菌物种。图4显示的是丰度水平前2的物种，其他物种合并为others。发酵中(Y1)样品的优势细菌物种分别是相对丰度为66.58%的醋酸杆菌属(Acetobacter)和31.74%的乳杆菌属(Lactobacillus)，在1个月成品(Y2)和1年陈酿(Y3)样品中醋酸杆菌属相对丰度分别为68.21%和74.84%，乳杆菌属相对丰度分别为30.88%和24.72%。3个阶段中的绝对优势菌醋酸菌属是一类好氧微生物[20]，氧化生成的醋酸是食醋中有机酸的主要成分，因此食醋发酵阶段主要添加醋酸菌；在1年陈酿(Y3)中醋酸菌属丰度达到最高，可能是发酵结束后食醋中存在充足的氧气和有机物质，更利于这类微生物生长；乳酸菌属为兼性厌氧菌，在低氧环境下仍能快速生长繁殖，所以发酵过程中乳酸菌属的相对丰度要高于成品贮存阶段。乳酸菌是调和食醋终产品风味的重要组成部分，可能来源于醋醅中。此外乳酸菌还具有蛋白质分解酶，把蛋白质分解为肽和氨基酸，但酶活相比其他微生物则较弱，需要更长时间来分解蛋白质[21]，乳酸菌的存在可增加食醋中多种有机酸和胞外多糖等功能性成分的含量，提高食醋风味和营养价值[22]。从永春老醋前3个阶段乳酸菌属和醋酸菌属各自所占比例来看，3个阶段中2个菌属都以接近1∶3的比例共存，可能是形成永春老醋独特风味的重要原因。
图4 属水平下永春老醋发酵中(Y1)、1个月成品(Y2)和1年陈酿(Y3)3个阶段细菌群落结构
Fig.4 Bacterial communities of Yongchun aged vinegar in three stages of fermentation, 1-month product and 1-year storage at the genus level
2.3.2 真菌群落结构组成
在门水平下，4个阶段永春老醋样品中共有7类真菌物种。图5显示的是相对丰度水平>1%的优势物种，子囊菌门(Ascomycota)皆为4个阶段永春老醋的优势菌种，相对丰度分别为98.90%、99.98%、99.96%和97.12%，说明其对永春老醋不同阶段风味和品质的形成皆起着重要作用；发酵中(Y1)和10年陈酿(Y4)还检测到相对丰度分别为1.03%和1.01%的担子菌门(Basidiomycota)，说明担子菌门对食醋的发酵和后期贮存过程中风味和品质的形成也具有一定作用；此外，10年陈酿(Y4)中还存在1.72%为分类不明的真菌(norank_k_Fungi)。
图5 门水平下永春老醋发酵中(Y1)、1个月成品(Y2)、1年陈酿(Y3)和10年陈酿(Y4)4个阶段真菌群落结构
Fig.5 Fungal communities of Yongchun aged vinegar in four stages of fermentation, 1-month product, 1-year and 10-year storage at the phylum level
在纲水平下，4个阶段的永春老醋样品共有13类真菌物种，图6显示的是相对丰度水平前3的物种，其他物种合并为others。发酵中(Y1)、1个月成品(Y2)和1年陈酿(Y3)样品的优势菌纲为酵母纲(Saccharomycetes)，相对丰度分别达到96.84%、98.85%和98.93%，其次是散囊菌纲(Eurotiomycetes)，相对丰度分别为1.80%、1.09%和0.98%；10年陈酿(Y4)的优势菌纲为散囊菌纲，相对丰度为50.36%，酵母菌纲相对丰度只占46.43%。以上说明，发酵中(Y1)、1个月成品(Y2)和1年陈酿(Y3)样品的优势菌群除了相对丰度略显差异外，其群落结构组成较为相近；10年陈酿(Y4)中优势菌群的结构组成和比例均与前3个阶段存在明显差异。原因可能是由于永春老醋在生产和前期贮存过程中存在充足的糖类物质供酵母类菌群降解为乙醇和CO2，所以酵母类菌群能够大量存活；而贮存10年后的老醋随着贮存时间延长，食醋中有机物质含量下降，水分活度降低，渗透压升高，优势菌群由酵母菌纲转变为易于在低水分活度和高渗透压环境中生长的散囊菌纲。
图6 纲水平下永春老醋发酵中(Y1)、1个月成品(Y2)、1年陈酿(Y3)和10年陈酿(Y4)4个阶段真菌群落结构
Fig.6 Fungal communities of Yongchun aged vinegar in four stages of fermentation, 1-month product, 1-year and 10-year storage at the Class level
在属水平下，4个阶段永春老醋样品共有17个真菌物种，图7显示的是相对丰度水平前5的物种，其他物种合并为others。发酵中(Y1)、1个月成品(Y2)和1年陈酿(Y3)样品中绝对优势菌群均为酵母目未分类属(unclassified_o_Saccharomycetales)，相对丰度分别为96.37%、98.80%和98.73%。酵母菌是食醋酿造过程中主要功能微生物，发酵过程中的酵母菌大部分源于醋醅，酵母菌不仅能发酵糖类产生乙醇，而且能代谢产生丰富的风味成分，例如生香酿酒酵母、假丝酵母和产酯的毕赤酵母等[23]。10年陈酿(Y4)中真菌群落的组成和比例发生一定变化，优势菌群主要由相对丰度为50.36%的发菌科未分类属(unclassified_f_Trichocomaceae)、28.07%的酵母目分类不明属(norank_o_Saccharomycetales)以及17.68%的毕赤酵母属(Pichia)组成。永春老醋在发酵和前期贮存中存在充足的糖类有机物质，非常适于酵母菌属菌群生长，所以酵母菌属在永春老醋发酵阶段和成品前期贮存中均占绝对优势；10年陈酿中酵母菌属比例明显减少，可能是由于老醋在长期贮存中糖类物质含量降低，使得酵母菌属生长被抑制。10年陈酿(Y4)中存在了一定比例的毕赤酵母属，毕赤酵母是食醋发酵中常见的产香酵母，具有增加食醋香味的作用[24]。这类微生物在低pH、高渗透压等不利环境下适应能力较强[25]。
图7 属水平下永春老醋发酵中(Y1)、1个月成品(Y2)、1年陈酿(Y3)和10年陈酿(Y4)4个阶段真菌群落结构
Fig.7 Fungal communities of Yongchun aged vinegar in four stages of fermentation, 1-month product, 1-year and 10-year storage at the genus level
2.4 β-多样性分析
层级聚类分析可以直观地将样品间相似或差异程度反映在层级聚类树图上，如果样品间物种组成越相似，在层级聚类树图中距离数值就越接近。如图8-a所示，3组样品间都相差一定距离，说明发酵中(Y1)、1个月成品(Y2)和1年陈酿(Y3)样品细菌群落都有一定差异。其中，1个月成品(Y2)和1年陈酿(Y3)优先聚类，二者的距离为0.101 6，细菌群落差异程度较小；发酵中(Y1)与1个月成品(Y2)和1年陈酿(Y3)的距离分别为0.269 0和0.267 7，说明发酵中(Y1)与2个成品细菌群落的差异程度较大。由图8-b可知，除10年陈酿(Y4)外，前3个阶段样品优先聚类，1个月成品(Y2)和1年陈酿(Y3)距离最短，几乎没有差异，说明两者真菌群落相似性很高；发酵中(Y1)样品与1个月成品(Y2)和1年陈酿(Y3)的距离分别为0.024 9和0.023 8，说明发酵中Y1样品与2个成品的真菌群落组成也较为相近；前3个阶段样品与10年陈酿(Y4)的距离分别为0.973 9、0.984 3和0.983 6，说明前3个阶段样品与10年陈酿(Y4)真菌群落之间差异非常明显。综上可知，发酵中(Y1)、1个月成品(Y2)和1年陈酿(Y3)之间的细菌群落相似性要低于真菌群落，说明永春老醋在发酵和产品前期贮存过程中，醋液中细菌群落的变化大于真菌群落。
a-OTU水平下细菌层级聚类树;b-OTU水平下真菌层级聚类树
图8 OTU水平下永春老醋不同阶段中细菌和真菌群落层级聚类分析
Fig.8 Bacterial and fungal communities hierarchical clustering analysis of Yongchun aged vinegar in different stages at the OTU level
3 讨论与结论
本研究应用Illumina Miseq高通量测序技术对形成永春老醋品质的微生物多样性进行了分析。研究结果表明了永春老醋发酵中、1个月成品、1年陈酿和10年陈酿4个阶段主要的优势菌相对含量和组成均有所不同，说明了不同阶段不同微生物对老醋品质的形成可能起着不同的作用。丰度(Chao)和多样性(Shannon)指数分析显示，发酵中、1个月成品和1年陈酿永春老醋中细菌和真菌的丰富度与多样性差别较小，且相同时期下细菌丰富度与多样性均显著高于真菌；10年陈酿永春老醋中真菌丰度和多样性指数增加明显。菌群OTU数量显示发酵中、1个月成品和1年陈酿永春老醋细菌群落组成较为相似，发酵中和10年陈酿永春老醋真菌群落组成较为特殊。永春老醋发酵过程中和成品前期贮存阶段(1个月和1年)以醋酸杆菌属(Acetobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)和酵母目未分类属(unclassified_o_Saccharomycetales)为优势菌，这3个阶段中乳酸菌代谢产物为醋酸菌和酵母菌提供充足的糖类、氨基酸和维生素等营养物质，酵母菌发酵糖类物质产生的醇类和醛类物质进一步被醋酸菌发酵生成有机酸[26-27]。种类不同的乳酸菌和酵母菌共培养时相互作用不同，某些特殊酵母菌和乳酸菌共培养时会产生愉悦香味，而另一些则会产生异味[28-29]。这3类优势菌共同保证了永春老醋发酵中和成品前期贮存阶段的独特风味和品质。随着贮存时间延长，10年陈酿永春老醋中优势菌由发菌科未分类属(unclassified_f_Trichocomaceae)、酵母目分类不明属(norank_o_Saccharomycetales)和部分毕赤酵母属(Pichia)组成，却无法检测到细菌类微生物。说明经过长期贮存和物质转化，其微生物组成发生了变化。10年永春老醋由于长时间密闭贮存，醋液中含氧量和营养物质急剧下降，已不适合细菌类微生物在老醋溶液环境中生存，此时主要存在维持老醋品质的酵母菌和易于低pH和高渗透压环境中生长的发菌。1个月成品和1年陈酿2个阶段细菌群落组成相近，但与发酵中的样品存在较大差异；发酵中、1个月成品和1年陈酿3个前期生产和保存阶段的永春老醋真菌群落相似度高，皆与10年陈酿有明显差异，细菌与真菌群落组成在不同阶段的变化趋势不同，细菌在发酵过程中的变化大于贮存前期，说明细菌可能在生产前期对老醋品质形成作用较大，而随着时间的延长减小甚至消失，而真菌刚好相反，发酵过程中和贮存前期(1个月和1年)的群落组成变化小于长期贮存的(10年)样品，随着贮存时间的延长，真菌多样性提高，可能对老醋品质形成起着重要作用。
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