食源性功能肽是指生物体从外界摄入的活性肽,以特定的氨基酸序列存在于膳食蛋白质中,蛋白质在降解过程中释放出具有生理活性的功能肽[1]。钙是人体中必不可少的矿物质元素,具有多种重要的生理功能。钙不足容易导致佝偻病、骨质疏松、高血压等疾病[2]。饮食摄入是人体骨骼补充钙的唯一来源,而钙的吸收受膳食中的植酸盐、草酸盐以及其他阳离子如锌离子、镁离子和铁离子的影响[3]。目前市面上的补钙产品多为离子钙,例如碳酸钙、乳酸钙和葡萄糖酸钙,在肠道环境中易形成沉淀,严重降低了人体对钙的吸收[4]。螯合钙因其吸收性好、生物利用度高,被认为是离子钙的替代品[5],在小肠内按照肽的吸收原理进行吸收,能够有效促进人体对钙的吸收[6]。
钙螯合肽被认为是改善钙生物利用度的新型功能性成分,到目前为止,已有大量的钙结合肽从各种食品资源中分离出来,如鱼骨[7]、乳清[8]、大豆[9]等。酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptides,CPPs)是研究最多的促钙吸收肽,通过丝氨酸的磷酸残基与钙螯合形成可溶性的稳定复合物,增加肠道对钙的吸收[10]。本文综述了近年来国内外报道的钙螯合肽的制备、分离纯化、结构分析及生物活性等内容,以期为我国功能肽的利用和开发提供参考。
蛋白质的氨基酸序列和空间结构赋予其独特的功能,为了将蛋白质降解为肽类和氨基酸,需要采用各种理化手段,打破蛋白质的多级结构[11]。酶解法因其条件温和、反应专一、安全环保等特点,广泛应用于活性生物肽的制备。
蛋白酶具有特定的酶切位点,不同蛋白酶可制备不同分子质量和生物活性的肽。一般酶解反应在蛋白酶最适条件下进行,以获取最佳的酶解效果。刘静[12]分别选用5种蛋白酶酶解牦牛骨粉,筛选出碱性蛋白酶为最优蛋白酶,当底物质量分数为3.5%,溶液pH 7.0,酶解温度50 ℃,酶底比4 000 U/g,酶解4 h,此时多肽得率为22.06%。由于蛋白酶的作用位点、活性部位及化学性质相差较大,为了得到生物活性更高的蛋白肽,也有研究采用复合酶、双酶水解方式。魏新颖[13]将木瓜蛋白酶和风味蛋白酶进行复配酶解鸡肉蛋白制备钙螯合肽,发现双酶分步酶解所得产物的钙螯合能力大于双酶同步酶解,并通过响应面实验设计优化,得到最佳酶解工艺:木瓜蛋白酶添加量0.3%,酶解3.5 h,风味蛋白酶添加量0.18%,酶解2.84 h,酶解产物钙螯合力为(61.64±1.04) mg/g(pro)。WU等[14]采用不同的酶解方式(单酶、双酶分步、双酶同步)酶解猪骨胶原蛋白,发现底物质量分数为8%,pH 9.0,50 ℃下水解4 h,酶用量为8 000 U/g(碱性与中性按1∶1同时添加),水解度显著高于其他水解方式。以上结果表明,多种蛋白酶协同作用可增加蛋白的酶解效果。还有研究报道,在高压脉冲、超声波、微波等现代技术辅助下蛋白质的水解效果会大大提高。王静雅等[15]在高压脉冲电压辅助下酶解河蚌肉,与单酶解相比水解度提高18.0%。DONG等[16]利用热压法辅助酶法提取鸡骨中的蛋白,先在(130±0.5) ℃下加热120 min,后风味蛋白酶酶解,发现水解效果显著高于单纯酶解。
蛋白质的水解程度受原料、蛋白酶、酶解条件等因素的影响较大,有必要针对不同底物确定最佳蛋白酶酶解工艺,以便在现代技术的辅助下高效制备生物活性产品。
由于酶解过程的连续性和蛋白酶的非专一性,酶解产物组成复杂,需通过分离纯化技术制备具有特定分子质量区间以及功能活性的多肽组分。为得到纯度更高的螯合肽,通常将多种分离纯化技术联合使用。以具有特定截留分子质量的超滤膜、固定化金属离子亲和层析法(immobilized metal ion affinity chromatography,IMAC)和羟基磷灰石色谱(hydroxyapatite chromatography,HAC)作为第一步将酶解产物进行粗分,然后利用葡聚糖凝胶色谱柱或离子交换色谱法(ion exchange chromatography,IEC)进一步分离,最后采用反相高效液相色谱(reversed phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)得到纯度和活性较高的组分。ZHANG等[17]通过HAC和RP-HPLC对太平洋鳕鱼骨的酶解物进行分离,得到一种新的十肽,鉴定为KGDPGLSPGK(命名为Peptide-K,分子质量:954.5 Da),其表现出高的钙结合活性(2.53±0.12) mg/g(pro)。CAI等[18]利用凝胶过滤色谱和RP-HPLC,从裂殖壶菌属中分离纯化出一种具有特定钙结合能力的新型肽(Phe-Tyr),此肽的钙结合能力达到128.77 mg/g(pro)。酶解产物经分离纯化得到单一组分后,可以通过飞行时间质谱(time-of-flight mass spectrometer,TOF-MS)分析其氨基酸序列和分子质量。ZHAO等[8]利用阴离子交换色谱,Sephadex G-25凝胶过滤和RP-HPLC从乳清蛋白水解物中获得了一种分子质量为237.99 Da的钙结合肽,通过TOF-MS确定其氨基酸序列为Gly-Tyr,钙结合能力为75.38 mg/g(pro),与乳清蛋白水解产物复合物相比提高了122%。CHEN等[19]采用酶解和膜分离法制备钙结合肽,经过Sephadex G-15凝胶色谱和RP-HPLC分离纯化,得到一种具有较高的钙结合活性的肽(76.8±4.5 mg/g(pro)),通过TOF-MS分析确定其氨基酸序列为Glu-Pro-Ala-His,分子质量为453.3 Da。总之,有多种选择可用于分离纯化肽,但存在用时过长、效率较低等问题。从工业角度出发,需要开发更加高效的技术,大规模开发和制备附加值产品。
目前,红外光谱和核磁共振等已被广泛的用于研究螯合物的化学键、结合位点、组成等问题。虽然钙螯合肽的构效关系尚未完全建立,但已经确定了一些可能影响螯合活性的结构特征,包括肽的分子质量、氨基酸组成及序列和特定的氨基酸基团。
蛋白质的水解产物通常为不同分子质量产物的混合物。研究显示,肽的螯合能力与分子质量大小具有一定的相关性,大多数情况下,分子质量越小的螯合肽活性越强。分子质量大的肽其内部活性基团与螯合位点无法最大程度的暴露,与钙离子的接触机率低,螯合能力较低。TAM等[20]首次从日本青蟹蛋白酶解物中鉴定出一种分子质量为948.4 Da的新型钙结合肽,对比10 k~30 kDa,3~10 kDa,1~3 kDa和<1 kDa的4个肽段的钙结合活性,发现<1 kDa的肽段钙亲和力最高为(277.96±20.93) mg/g(pro)。刘丽莉[21]利用超滤膜将发酵液逐步分离,发现不同分子质量肽螯合钙的能力相差很多,10 kDa以上肽段螯合能力较低,2~4 kDa 肽段的螯合率最高达41.23%。李超楠[22]以米蛋白为原料,研究不同分子质量的多肽(未分级肽段、<3 kDa、3 k~5 kDa、5 k~10 kDa 和 >10 kDa)对钙螯合能力的影响,结果表明3 k~5 kDa肽段螯合能力最强。BUDSEEKOAD等[23]利用超滤法将绿豆蛋白水解物分离为8个组分,测定钙的结合性能,发现<5 kDa的肽钙结合活性最强。但是也有研究显示,高分子质量的钙结合肽同样具有较强的活性。LV等[24]研究大豆促钙吸收肽对钙的吸收作用时表明,分子质量为10~30 kDa的肽比 3~10 kDa及 1~10 kDa的肽结合活性更强。
上述研究结果所存在的差异,可能是多方面原因导致:(1)蛋白来源、组成结构不同所致;(2)评估肽段大小的方法不同;(3)分离纯化方法的不同。因此有待进一步深入探索关于不同分子质量对螯合活性的影响。
除了分子质量外,多肽的氨基酸组成及序列也对钙螯合能力起着重要的作用。研究表明,某些螯合活性好的促钙吸收肽中通常存在半胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、丝氨酸(Ser)。CHEN等[25]从罗非鱼鱼鳞的酶解液中分离出一种高钙螯合肽,并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定出该肽的序列为 Asp-Gly-Asp-Asp-Gly-Glu-Ala-Gly-Lys-Ile-Gly,Asp、Gly 和 Glu 这3种氨基酸残基在该多肽的含量最高,其中Asp和Glu存在,会为钙离子提供有力的配位环境。同时LIU等[26]采用双酶复合工艺对大西洋鲑鱼骨头进行酶解,利用RP-HPLC对肽螯合钙进行分离纯化,通过四极杆飞行时间质谱确定其分子质量及氨基酸序列,发现鱼骨中鉴定出的22种肽中有17种肽具有Glu和Asp残基,推测Glu和Asp残基可能对钙螯合肽的结合活性起作用。另外,在没有Glu和Asp残基的5种肽中,有4个肽具有Ser或Thr残基,所以认为Ser、Thr同样对钙离子的螯合活性贡献较大。这与JUNG等[27]和KIM等[28]报道一致,认为Ser、Thr、Met和Tyr可能有助于钙结合。此外,据报道,含有组氨酸(His)残基的肽对钙离子也具有高亲和力。HUANG等[29]从虾加工副产物中分离出了一种含有组氨酸的三肽Thr-Cys-His,具有高钙结合能力,推断可能是His残基存在的原因。
通过对比多肽与钙螯合前后的光谱图变化,可以证明螯合物的产生、解决螯合物的化学键问题,分析其反应基团,对多肽螯合钙结构鉴定和螯合机制的研究具有重要意义。研究发现,钙螯合肽可以通过特定的氨基酸基团和残基,如羧基、羰基、氨基、亚氨基和含硫巯基参与配位反应。ZHANG等[30]采用胰蛋白酶和中性蛋白酶从太平洋鳕鱼骨中制备钙结合肽(CBP),经紫外光谱和傅立叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)显示,CBP通过羧基和氨基与Ca2+结合,形成肽钙复合物。HOU等[31]用胰蛋白酶对南极磷虾水解,产物经HAC、RP-HPLC分离纯化、TOF-MS确定其氨基酸序列为VLGYIQIR,分子质量为960.58 Da,并根据FTIR结果推测,钙离子的螯合位点可能涉及Gln、Ile和Arg残基的羰基。WANG等[32]报道小麦胚芽蛋白水解物中的钙螯合肽,通过FTIR,X射线衍射和核磁共振波谱研究肽钙的螯合机理,结果显示羧基的氧原子与酰胺基的氮原子提供主要的结合位点。CUI等[33]通过肽组学鉴定了海参卵中新型七肽钙(NDEELNK)复合物的钙结合模式,发现NDEELNK肽以1∶1的化学计量比自发地结合钙,并且位点可能涉及NDEELNK肽中2个Glu和1个Asp残基的羧基氧和氨基氮原子。SUN等[34]通过蛋白的结构和热力学特性,阐明了蛋清水解产物五肽(DHTKE)与钙离子之间的结合方式,DHTKE肽以1∶1的化学计量比自发地结合钙,且位点对应于肽的羧基氧,氨基氮和咪唑氮原子。
此外还发现螯合反应与蛋白质的磷酸化位点有关。CPPs中的磷酸化丝氨酸残基能够与钙离子结合形成可溶性复合物,将钙包裹其中避免钙在人体肠道内形成沉淀,有效提高钙的吸收利用率。且磷酸丝氨酸残基的数量和位置对于结合活性有重要作用。SATO等[35]发现磷酸化丝氨酸基团与钙螯合肽的结合成正相关,并证明了酪蛋白分子的磷酸盐部分对增强人体小肠吸收钙离子是非常必要的。ZONG等[36]研究磷酸丝氨酸的位置对于钙结合的重要性,研究表明含有3个Ser的磷酸肽结合钙能力最强,有效抑制磷酸钙沉淀,磷酸肽中的不连续Ser结合钙能力弱,更容易释放钙。虽然已经报道了一些特定的基团是螯合物形成的必须形式,但仍需要进一步研究钙螯合肽的螯合机理,包括肽链上螯合位点的位置、分子结构和动态过程。
肽钙螯合物具有良好的溶解度、吸收性和稳定性,在胃肠道的弱碱性环境中能够有效地运输钙离子通过肠上皮细胞,被机体吸收和利用。CHEN等[37]研究鳕鱼皮源螯合肽在体外胃肠道消化过程中的稳定性,发现只有少量肽发生降解,约75%的肽表现出良好的稳定性。GAO等[38]研究CPP和可溶性膳食纤维模拟胃肠道中的理化性质,结果表明该共聚物的最大钙结合水平达到了46.8%,比原来的CPP高35.17%。
目前,评价肽钙螯合物生物利用度的方法主要有体外细胞模型(Caco-2、HT-29 细胞模型)和体内动物试验。Caco-2 细胞来自人体结肠癌细胞株,在体外培养时自动分化形成类似于人体小肠上皮细胞的结构特征,且与小肠上皮细胞具有相似的转运系统和标志酶的功能表达。CAI等[1]从海洋微生物中分离得到一种肽YL,利用Caco-2细胞体外促钙吸收转运显示YL-Ca具有良好的热稳定性和溶解性,与氯化钙相比可将钙在 Caco-2 细胞中的吸收率提高3倍,并保护钙离子免受营养抑制剂如单宁酸、草酸盐、植酸盐等影响。SUN等[34]使用Caco-2细胞研究蛋清肽钙复合物的体外吸收,结果表明与不含钙的对照相比,肽钙复合物可使跨Caco-2细胞单层的钙吸收提高7倍以上。这些结果证明钙螯合肽在促钙吸收转运过程中起重要作用。HT-29细胞系由于具有不同细胞分化模式的能力而常被用于研究钙的体外吸收模型。COSENTINO等[39]证明CPPs能通过增加HT-29细胞中的钙浓度来改善钙的吸收。
动物模型被广泛用于体内生物利用度研究,据报道钙螯合肽能促进钙吸收,增加骨矿物质密度和强度,降低骨质疏松症的风险。HUA等[40]研究小球藻蛋白肽钙螯合物对低钙饮食喂养大鼠钙吸收代谢的影响,发现肽钙螯合物能显著增加大鼠体重,提高大鼠血清钙、骨矿物质密度和骨矿物质含量的水平,降低血清碱性磷酸酶,并抑制骨骼的形态变化。ZHANG等[7]通过建立去卵巢大鼠骨质疏松模型来验证,太平洋鳕鱼骨制备的钙结合肽具有抗骨质疏松的生物活性,结果表明该螯合肽可以提高钙的生物利用度和血清钙,降低骨转换率,从而改善骨质疏松症。QU等[41]研究乌耳蛋白水解产物肽钙复合物对治疗废用性骨质疏松症的保护作用,结果表明木耳肽钙复合物有助于改善小鼠的骨矿物质密度,骨矿物质和有机物含量,并有效减轻与骨有关酶的改变代谢,以避免更严重的骨质流失。
肽钙螯合物不仅可以促进机体对钙元素的生物利用度,还具有抗氧化、抑菌等生物活性作用。王梦娅等[42]利用复合酶解法得到大竹蛏源钙螯合肽,通过硫代巴比妥酸和抑菌圈试验结果表明钙螯合肽有良好的抗氧化活性和抑菌活性。蒲传奋等[43]探究玉米醇溶蛋白肽制备的多肽螯合钙的抗氧化和抗菌活性,结果表明肽钙螯合物的 DPPH自由基清除率为85.6%,相当于α-生育酚的89.53%,能有效地抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌,说明此肽钙螯合物具有一定的抗氧化和抑菌活性。丁利君等[44]利用木瓜蛋白酶和风味蛋白酶酶解罗非鱼,将多肽酶解液与氯化钙进行螯合,实验结果发现该螯合物对多种微生物,如肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、荧光假单胞菌、啤酒酵母、白色念珠菌、黑曲霉等都有一定的抑制作用,特别是对细菌的生长抑制效果更加明显。钙螯合肽的抗氧化活性是由于其能够螯合钙离子从而阻止自由基的生成,还与其自身的一些活性基团有关,如酪氨酸、组氨酸和半胱氨酸的吲哚基、咪唑基和巯基,这些基团在肽的抗氧化中起到重要作用。
食源性的钙螯合肽营养价值高、吸收性好,不仅可以解决钙元素在人体内吸收差和生物活性低的问题,同时也具有抗氧化、抑菌、免疫调节等生理作用,可用作医药产品和保健食品的开发等,也可以用于抗氧化剂、抑菌剂、食品添加剂、有机肥料、动物饲料等产品的工业化生产,具有很高的应用价值和开发前景。但目前的研究尚存在一些问题,例如:(1)对其安全性评价的研究较少,目前只是在体外模拟或小鼠实验,有必要在有缺钙风险的人群中对肽钙螯合物及其作为钙补充剂的应用进行进一步研究;(2)肽钙螯合物的构效关系和活性机制不完全明确;(3)游离态的矿质元素和螯合态的矿质元素很难准确分离;(4)螯合物的高效分离与纯化技术还有待提高;(5)生物活性的进一步挖掘与研究等问题还有待解决。上述诸多方面问题应得到各方的联合关注,以期为相关副产物的研究开发提供科技理论支撑。
[1] CAI X,QIAN Y,JIAPING L,et al.A specific peptide with calcium-binding capacity from defatted Schizochytrium sp.protein hydrolysates and the molecular properties[J].Molecules,2017,22(4):544.
[2] CHIANG J H,LOVEDAY S M,HARDACRE A K,et al.Effects of enzymatic hydrolysis treatments on the physicochemical properties of beef bone extract using endo-and exoproteases[J].International Journal of Food Science & Technology,2019,54(1):111-120.
[3] GLOUX A,LE R N,BRIONNE A,et al.Candidate genes of the transcellular and paracellular calcium absorption pathways in the small intestine of laying hens[J].Poultry Science,2019,98(11):6 005-6 018.
[4] BARBOZA G D D,GUIZZARDI S,TALAMONI N T D J W J O G.Molecular aspects of intestinal calcium absorption[J].World Journal of Gastroenterology,2015,21(23):7 142-7 154.
[5] GAFFNEY-STOMBERG E,MARSZEWSKI P,MACARTHUR M,et al.Paracellular calcium flux across Caco-2 cell monolayers:Effects of individual amino acids[J].Jurnal of Nutritional Biochemistry,2018,59:114-122.
[6] TORRES-FUENTES C,CONTRERAS M d M,RECIO I,et al.Identification and characterization of antioxidant peptides from chickpea protein hydrolysates[J].Food Chemistry,2015,180:194-202.
[7] ZHANG K,LI B,CHEN Q,et al.Functional calcium binding peptides from pacific cod (Gadus macrocephalus) bone:Calcium bioavailability enhancing activity and anti-osteoporosis effects in the ovariectomy-induced osteoporosis rat model[J].Nutrients,2018,10(9):1 325.
[8] ZHAO L,HUANG Q,HUANG S,et al.Novel peptide with a specific calcium-binding capacity from whey protein hydrolysate and the possible chelating mode[J].Agricultural and Food Chemistry,2014,62(42):10 274-10 282.
[9] LV Y,BAO X,LIU H,et al.Purification and characterization of caclium-binding soybean protein hydrolysates by Ca2+/Fe3+ immobilized metal affinity chromatography (IMAC)[J].Food Chemistry,2013,141(3):1 645-1 650.
[10] PEREGO S,DEL FAVERO E,DE LUCA P,et al.Calcium bioaccessibility and uptake by human intestinal like cells following in vitro digestion of casein phosphopeptide-calcium aggregates[J].Food & Function,2015,6(6):1 796-1 807.
[11] 张志胜,韩晴,齐文聪,等.胶原多肽螯合钙的研究进展[J].食品安全质量检测学报,2016,7(8):3 222-3 227.
ZHANG Z S,HAN J,QI W C,et al.Research progress of collagen polypeptide chelated calcium[J].Journal of Food Safety & Quality,2016,7(8):3 222-3 227.
[12] 刘静.牦牛骨胶原多肽螯合钙的制备研究[D].雅安:四川农业大学,2016.
LIU J.Preparation of yak bone collagen peptide chelated calcium[D].Ya’an:Sichuan Agricultural University,2016.
[13] 魏新颜. 鸡肉蛋白钙螯合肽的制备及螯合性质研究[D].广州:华南理工大学,2019.
WEI X Y.Preparation and chelation properties of chicken protein calcium chelating peptide[D].Guangzhou:South China University of Technology,2019.
[14] WU W,HE L,LIANG Y,et al.Preparation process optimization of pig bone collagen peptide-calcium chelate using response surface methodology and its structural characterization and stability analysis[J].Food Chemistry,2019,284:80-89.
[15] 王静雅, 安苏苏,等.响应面法优化高压脉冲电场辅助酶解河蚌肉工艺[J].肉类研究,2019,33(2):25-31.
WANG J Y,AN S S,et al.Optimization by response surface methodology of high-voltage pulsed electric field-assisted enzymatic hydrolysis of freshwater mussel meat[J].Meat Research,2019,33(2):25-31.
[16] DONG X B,LI X,ZHANG C-h,et al.Development of a novel method for hot-pressure extraction of protein from chicken bone and the effect of enzymatic hydrolysis on the extracts[J].Food Chemistry,2014,157:339-346.
[17] ZHANG K,LI J,HOU H,et al.Purification and characterization of a novel calcium-biding decapeptide from Pacific cod (Gadus macrocephalus) bone:Molecular properties and calcium chelating modes[J].Journal of Functional Foods,2019,52:670-679.
[18] CAI X,LIN J,WANG S J M D.Novel peptide with specific calcium-binding capacity from schizochytrium sp.protein hydrolysates and calcium bioavailability in caco-2 cells[J].Marine Drugs,2016,15(1):3.
[19] CHEN M,JI H,ZHANG Z,et al.A novel calcium-chelating peptide purified from Auxis thazard protien hydrolysate and its binding properties with calcium[J].Journal of Functional Foods,2019,60:103 447.
[20] TAM DINH LE V,KHOA TRONG P,LINH TRUC L,et al.Identification of a new calcium-binding peptide from enzymatic proteolysate of Acetes japonicus[J].Journal of Food Processing and Preservation,2018,42(12):e13 837.1-e13 837.6.
[21] 刘丽莉. 牛骨降解菌的筛选及其发酵制备胶原多肽螯合钙的研究[D].武汉:华中农业大学,2010.
LIU L L.Research on screening the bovine bone degrading bacteria and preparation of collagen polypeptide chelated calcium by fermentation[D].Wuhan:Huazhong Agricultural University,2010.
[22] 李超楠. 米蛋白肽-钙螯合物的制备及其性质研究[D].大庆:黑龙江八一农垦大学,2019.
LI C N.Preparation and properties of rice protein peptide-calcium chelate[D].Daqing:Heilongjiang Bayi Agricultural University,2019.
[23] BUDSEEKOAD S,YUPANQUI C T,SIRINUPONG N,et al.Structural and functional characterization of calcium and iron-binding peptides from mung bean protein hydrolysate[J].Journal of Functional Foods,2018,49:333-341.
[24] LV Y,BAO X L,YANG B C,et al.Effect of soluble soybean protein hydrolysate-calcium complexes on calcium uptake by Caco-2 cells[J].Journal of Food Science,2008,73(7):H168-H173.
[25] CHEN D,MU X,HUANG H,et al.Isolation of a calcium-binding peptide from tilapia scale protein hydrolysate and its calcium bioavailability in rats[J].Journal of Functional Foods,2014,6:575-584.
[26] LIU W,LU J,GAO F,et al.Preparation,characterization and identification of calcium-chelating Atlantic salmon (Salmo salar L.) ossein oligopeptides[J].European Food Research & Technology,2015,241(6):851-860.
[27] JUNG W K,RESEARCH S-K K J E F,Technology.Calcium-binding peptide derived from pepsinolytic hydrolysates of hoki (Johnius belengerii) frame[J].European Food Research and Technology,2007,224(6):763-767.
[28] KIM S B,LIM J W J A A J O A S.Calcium-binding peptides derived from tryptic hydrolysates of cheese whey protein[J].Asian Australasian Journal of Animal Sciences,2004,17(10):1 459-1 464.
[29] HUANG G,REN L,JIANG J.Purification of a histidine-containing peptide with calcium binding activity from shrimp processing byproducts hydrolysate[J].European Food Research and Technology,2011,232(2):281-287.
[30] ZHANG K,LI B,CHEN Q,et al.Functional calcium binding peptides from pacific cod (Gadus macrocephalus) bone:Calcium bioavailability enhancing activity and anti-osteoporosis effects in the ovariectomy-induced osteoporosis rat model[J].Nutrient,2018,10(9):1 325.
[31] HOU H,WANG S,ZHU X,et al.A novel calcium-binding peptide from Antarctic krill protein hydrolysates and identification of binding sites of calcium-peptide complex[J].Food Chemistry,2018,243(MAR.15):389-395.
[32] WANG L,DING Y,ZHANG X,et al.Isolation of a novel calcium-binding peptide from wheat germ protein hydrolysates and the prediction for its mechanism of combination[J].Food Chemistry,2018,239:416-426.
[33] CUI P,SONG Y L,ZI Q J,et al.In vitro digestion profile and calcium absorption studies of sea cucumber ovum derived heptapeptide-calcium complex[J].Food & Function,2018,239(15):416-426.
[34] SUN N,JIN Z,LI D,et al.An Exploration of the calcium-binding mode of egg white peptide,Asp-His-Thr-Lys-Glu,and in vitro calcium absorption studies of peptide-calcium complex[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry,2017,65(44):9 782-9 789.
[35] RYUICHIRO,SATO,TADASHI,et al.The necessity for the phosphate portion of casein molecules to enhance ca absorption from the small intestine[J].Agricultural & Biological Chemistry,1983,47(10):2 415-2 417.
[36] ZONG H,PENG L J,ZHANG S S,et al.Effects of molecular structure on the calcium-binding properties of phosphopeptides[J].European Food Research and Technology,2012,235(5):811-816.
[37] CHEN Q,GUO L,DU F,et al.The chelating peptide (GPAGPHGPPG) derived from Alaska pollock skin enhances calcium,zinc and iron transport in Caco-2 cells[J].International Journal of Food Science & Technology,2017,52(5):1 283-1 290.
[38] GAO A,SHUANG D,YUE C,et al.In vitro evaluation and physicochemical characteristics of casein phosphopeptides-soluble dietary fibers copolymers as a novel calcium delivery system[J].Food Hydrocolloids,2018,79:482-490.
[39] COSENTINO S,GRAVAGHI C,DONETTI E,et al.Caseinphosphopeptide-induced calcium uptake in human intestinal cell lines HT-29 and Caco2 is correlated to cellular differentiation[J].Journal of Nutritional Biochemistry,2010,21(3):247-254.
[40] HUA P,XIONG Y,YU Z,et al.Effect of chlorella pyrenoidosa protein hydrolysate-calcium chelate on calcium absorption metabolism and gut microbiota composition in low-calcium diet-fed rats[J].Marine Drugs,2019,17(6):348.
[41] QU H,YI J,GAO X,et al.Anti-disuse osteoporosis activity of a complex of calcium-binding peptide from Auricularia auricula protein hydrolysates[J].Journal of Food Science,2019,84(7):1 909-1 919.
[42] 王梦娅, 陈媛媛,钱文举.大竹蛏源多肽与钙螯合物的制备工艺及生物活性研究[J].2017,56(8):1 530-1 533;1 540.
WANG M Y,CHEN Y Y,QIAN W J.The bioactivity and preparation technology for peptides-Ca2+ from solen grandis proteins[J].Hubei Agricultural Sciences,2017,56(8):1 530-1 533;1 540.
[43] 蒲传奋,唐文婷.玉米醇溶蛋白肽钙螯合物的制备及其抑菌性能研究[J].食品科技,2015,40(12):246-250.
PU C F,TANG W T.Preparation and antibacterial properties of zein peptide-calcium chelate[J].Food Science and Technology,2015,40(12):246-250.
[44] 丁利君,危雪如.罗非鱼蛋白酶解液的多肽与钙复合物的制备及其抑菌分析[J].食品科学,2009,30(20):198-202.
[45] DING L J,WEI X R.Preparation and antibacterial activity of chelate complex of Ca2+ and polypeptides from tilapia proteins[J].Food Science,2009,30(20):198-202.