真菌毒素(mycotoxins)是真菌在生长繁殖过程中产生的次级有毒代谢产物。据联合国粮农组织统计,每年全世界范围内大约有25%的农产品受到真菌毒素的污染,已经成为全球性的公共卫生健康问题[1]。截止目前,已发现400多种化学结构各异的真菌毒素[2],主要包括黄曲霉毒素 (aflatoxins,AF)、呕吐毒素 (deoxynivalenol,DON)、玉米赤霉烯酮 (zearalenone,ZEN)、伏马毒素 (fumonisin,FB)、赭曲霉毒素A (ocratoxin A,OTA) 等[3]。大多数真菌毒素可通过抑制动物体内蛋白质和相关酶的合成,破坏细胞结构,损害动物体肝脏、肾脏、神经、造血、皮肤等组织器官,具有致癌、致畸、致突变、生殖紊乱以及免疫抑制作用[4-7]。真菌毒素分布广泛、分子量小、结构以及化学性质一般均较稳定,即使高温烹任也无法使其分解[8-9],粮食、饲料以及农产品被真菌毒素污染后,通过食物链进入人体体内,严重威胁人类健康。目前，常见的真菌毒素的检测方法主要有生物鉴定法、化学分析法(薄层色谱法)、仪器分析法(高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱质谱联用法、液相色谱串联质谱法、毛细管电泳法)、免疫分析法(酶联免疫吸附法、放射免疫法、亲和层析法、胶体金免疫层析法)等,以上方法各有优缺点。随着纳米技术的发展及其材料在食品安全检测中的应用,以及应用噬菌体展示技术筛选仿真真菌毒素方法的成熟,科研工作者开发了系列快速、简便、绿色、经济、灵敏度高、特异性强、稳定性好、操作简单的真菌毒素检测方法。本文综述了近年来纳米材料及噬菌体展示技术在真菌毒素检测中的应用,以期为科研工作者进一步研究真菌毒素检测方法提供参考。
纳米材料通常指三维空间中至少有一维横向尺寸达1～100 nm的单质、化合物、混合物[10]，具有小尺寸效应、表面效应、宏观量子隧道效应、极高的反应活性、非凡的电子转移能力和高比表面积等物化特性[11-12],因而具有独特的理化性质和尺寸依赖特性,并表现出一系列独特的光学、电学、磁力学及化学催化性能[13-14]，被广泛用作识别元件的载体和放大检测信号的探针[15-16]。且纳米技术为新型纳米比色传感器的发展提供了广阔的空间[17],已成功用于多种真菌毒素的检测[18-19]。新型纳米材料主要包括金属纳米材料、碳纳米材料、磁性纳米材料、量子点、上转换荧光纳米颗粒等。
金属纳米材料包括金属氧化物和贵金属。贵金属纳米材料是纳米材料的一个重要组成部分,在对纳米材料的研究热潮中,因其具有传导性、大的比表面积、局域表面等离子体共振、较高的摩尔消光系数,优良的光、电、磁、催化性能以及良好的生物相容性和易于进行表面修饰等特点而成为应用最为广泛的纳米材料[20]。金属纳米材料在真菌毒素检测中主要发挥4种作用：生物分子的固定化、信号的产生、荧光猝灭和信号的放大。URUSOV等[21]用金纳米颗粒标记AFB1的二抗,采用间接竞争法在胶体金免疫层析试纸条上实现了对AFB1的高灵敏检测,该方法能够精确地调整特定抗体和胶体金标记所需的数量,肉眼检测限(limit of detection,LOD)为160 pg/mL,仪器检测限为30 pg/mL。与纯的金属纳米颗粒(gold nanoparticles,AuNPs)相比,双金属复合物如Ag@Au、Pt@Au、Cu@Au等极大地提高了检测的灵敏度,重现性和稳定性也得到了提高。HE等[22]用水热法合成了直径约350 nm的Fe3O4纳米颗粒,在机械搅拌下,带有氨基的亲水性聚醚酰亚胺(polyetherimide,PEI)自组装在Fe3O4纳米粒子表面,形成高度分散的Fe3O4@PEI纳米粒子。而后制备的带负电荷的Au种子通过静电相互作用均匀附着在带正电荷的Fe3O4@PEI表面,并在还原剂的作用下,Fe3O4@Au种子成为包覆Au壳的成核位点,制备了Fe3O4@Au NFs；再在其上修饰SH-Apt作为捕获探针,建立了一种用于检测花生油中AFB1的超灵敏表面增强拉曼光谱传感器。由于AFB1适配体及其互补链(SH-cDNA)的识别,报告探针产生了强烈的表面增强拉曼散射(surface-enhanced raman scattering,SERS)信号,而在AFB1存在条件下,AFB1适配体优先与AFB1结合,报告探针从捕获探针上释放,导致SERS强度线性下降,该SERS传感器的LOD为0.40 pg/mL,在0.000 1～100 ng/mL范围内具有较高的灵敏度。
ZHANG等[23]以锆离子为节点,铁卟啉为连接剂成功合成了PCN-223-Fe,并原位负载PtAg双金属纳米颗粒,得到了AgPt/PCN-223-Fe复合材料,由于PCN-223-Fe与AgPt的协同作用,AgPt/PCN-223-Fe修饰电极对氧还原具有良好的电催化活性。利用链霉亲和素(SA)对AgPt/PCN-223-Fe进行功能化得到了SA/AgPt/PCN-223-Fe纳米探针,通过生物素和链霉亲和素的识别作用,将SA/AgPt/PCN-223-Fe引入电极表面捕获OTA适配体,产生强烈的氧还原电化学信号。当OTA存在于溶液中时,适配体优先与OTA结合,电化学信号降低。所设计的OTA 传感器的LOD为14 fg/mL,检测范围为20～2 ng/mL,成功应用于红酒和玉米样品中OTA的检测。传统的基于20～30 nm金纳米粒子信号强度不足导致灵敏度较低,只能提供定性或半定量结果,不能同时进行多次检测。此外,用肉眼对试条上的条带进行视觉观察很容易出现人为错误[24]。但金属纳米粒子通过与碳纳米材料、磁性纳米粒子、量子点、上转换荧光纳米材料等形成复合材料以及双金属纳米材料复合物可显著提高检测灵敏度,实现高灵敏度定量检测真菌毒素。
碳纳米材料,包括碳纳米管(单臂碳纳米管和多臂碳纳米管)、碳纳米纤维、富勒烯、石墨烯量子点和石墨烯等,因其水溶性好、毒性低和可调的荧光发射特性而受到广泛关注[25]。LIU等[26]采用聚乙烯亚胺功能化的多壁碳纳米管对玻碳电极(glassy carbon electrode,GCE)进行修饰,并在其上沉积金和铂纳米颗粒(AuPt-NPs),利用葡萄球菌A蛋白(staphylococcal protein A,SPA)与Fc段结合的特性将ZEN的单克隆抗体定向固定在电极上,通过测量抗体抗原免疫复合物的物理变化所得到的生物传感器应用于ZEN的检测。在最优条件下,ZEN的线性范围为0.005～50 ng/mL,LOD为1.5 pg/mL。SHAO等[27]通过将碳量子点封装在分子印迹聚合物材料中,开发了一种新型的环保型荧光猝灭材料作为ZEN传感器,用于玉米中ZEN的灵敏检测,检测限为0.02 mg/L。LI等[28]制备了石墨烯氧化金纳米复合材料(GO/AuNCs)作为一种新型荧光猝灭平台,结合杂交链式反应扩增,用于AFB1的超灵敏检测,LOD为0.03 pg/mL,该方法可以有效地检测花生样品中AFB1的含量。尽管碳纳米材料在研究上是切实可行的,但碳纳米材料表面的粘附性仍然有待考究,在日常的应用中仍然非常有限。
磁性纳米材料是一种同时具有纳米效应和磁性能的材料,一般由磁芯和包裹在磁芯上的高分子量聚合物/硅/羟基磷灰石壳层组成,其中包括铁、钴或镍等金属氧化物。最常见的核心层是由Fe3O4或γ-Fe2O3制成,具有超顺磁性或铁磁性[29]。磁性纳米材料由于其表面积大、传质性好、具有独特的物理化学性质、选择性吸附能力好、与生物分子的生物相容性好、易于分离、表面修饰和生产等特点,近年来人们对其进行了大量的研究。氧化铁纳米粒子被广泛用于食品分析、蛋白质纯化和酶固定化中[29],并且Al2O3、Au和Ag可用于修饰磁性纳米粒子(magnetic nanoparticles,MNPs)的表面[30]。WANG等[31]以Au@Fe3O4复合纳米材料为模拟酶建立了检测谷物和豆类食品中OTA的比色传感器,LOD可达到 30 pg/mL。URUSOV等[32]通过共沉淀法制备了MNPs,再和抗体通过物理吸附法形成非共价复合物,形成的复合物与存在于测试溶液中的抗原结合,然后用磁场分离抗原,以达到快速检测受污染食品中AFB1的目的,LOD为20 pg/mL,实现了在有机萃取剂含量较高的环境中测定AFB1。HAO等[33]用金纳米粒子(AuNPs)功能化硅包覆氧化铁磁性纳米粒子(mSiO2@Au)和碲化镉量子点(CdTe QDs)修饰的石墨烯/AuNPs纳米复合材料(GAu/CdTe) 制备了一种超灵敏的OTA电化学传感器,线性范围为0.2～4 pg/mL,LOD为0.07 pg/mL，该方法在食品安全监测和临床诊断中具有很大的潜力。HENDRICKSON等[34]采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(N1-((ethylimino)methylene)-N3,N3-dimethylpropane-1,3-diamine,EDC)法制备了磁性铁纳米粒子与ZEN的抗体复合物,在ZEN的存在下,结合传统的过氧化物酶标记物并催化高灵敏度的化学发光底物,实现对葡萄酒中ZEN的测定,LOD为0.06 ng/mL。但磁性纳米材料与其他纳米材料相比,更易氧化和团聚,导致吸附量大大降低。
量子点(guantum dots,QDs)作为半导体纳米晶体,一般是由Zn、Cd和Te、Se组成的化合物,表现出独特的光学和电子性质,如高量子产率、高摩尔消光系数、高耐光漂白、宽吸收光谱、窄而对称的发射带、大小可调、化学降解等优良性能,在分析化学领域极具吸引力[3,35-36]；并且量子点由于其物理特性而成为理想的显像剂,还为基因分析、诊断和药物发现提供了新的工具[37]，并在许多情况下,它们通常结合高特异性的生物分子,如抗体和适配体,而不影响其发射特性或适配体/抗体特异性。DUAN等[38]通过微乳液法合成了量子点微球,将激发在575和615 nm的CdSe/ZnS QDs包裹在量子点微球中,合成了具有黄色、橙色和红色发光特性的3种量子点荧光微球,将之分别与抗ZEN、OTA、FB1的单克隆抗体偶联,在10 min内对ZEN、OTA、FB1的LOD分别达到10、5、20 ng/mL,实现了对玉米样品中ZEN、OTA和FB1这3种真菌毒素的定性联检。GUO等[39]将分子印迹技术与量子点技术相结合,合成了基于MIP@CdTe QDs的新型荧光传感器,用于对AFB1的快速特异性识别,LOD达到4 ng/g。该方法成功地应用于实际样品中AFB1的定量测定。ZHANG等[40]用氨基功能化的核/多壳量子点(QDs)和抗DON的单克隆抗体偶联物作为荧光检测探针,建立了一种灵敏可靠的直接竞争荧光标记免疫吸附法,在优化条件下,LOD为12.2 μg/kg,实现了在玉米样品中DON的快速、灵敏、高效检测。但量子点目前没有比较完善的合成技术,种类不多,与生物大分子结合会存在非特异性吸附,其稳定性、生物毒性和性能还有待于研究与开发。
上转换纳米粒子(up-conversion nanoparticles,UCNPs)是一种新型的发光材料,能将低能量的近红外辐射转化为高能量的可见辐射。其以低背景噪声、高光稳定性、低毒性、对组织的信号穿透能力强、吸收能力弱等特点,受到了各领域的广泛关注[41]。WU等[42]采用戊二醛法制备了人工抗原修饰的氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒和抗体功能化上转化纳米颗粒作为信号探针,建立了一种新型的、灵敏的联检食品样品中AFB1和OTA的免疫分析方法,竞争模式下AFB1和OTA在最佳条件下的LOD均为0.01 ng/mL,线性范围为0.01～10 ng/mL，该方法已成功应用于测定天然污染玉米样品中的AFB1和OTA。SUN等[43]用单克隆抗体修饰NaYF4∶Yb,Er(NaYF)纳米颗粒,其中NaYF4作为基质材料,Yb3+作为敏化剂,Er3+作为激活剂,制备了荧光探针,用抗原修饰磁性纳米粒子制成免疫传感探针,对AFB1进行检测,线性范围为0.2～100 ng/mL,LOD为0.2 ng/mL,该方法可用于花生油或其他谷物中真菌毒素的快速筛查。张莹莹等[44]制备了水溶性的上转换荧光纳米材料,并在其表面修饰了OTA适配体作为能量供体探针,在金纳米粒子表面修饰了OTA适配体互补链作为能量受体探针,建立了荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)的传感方法检测OTA,其线性范围为0.001～10 ng/mL,检出限为0.001 ng/mL,且显示能特异性地检测实际样品啤酒中的OTA。但想要得到尺寸和形貌可控、发光性能好的上转换荧光纳米颗粒的有效合成方法和表面修饰功能化方法不多,且发光效率在很大程度上取决于上转换的基质材料,限制了其在真菌毒素检测中的应用。
此外,金属有机骨架(metal orgaic framework,MOF)和共价有机框架(covalentorganic framework,COF)因其独特的性质在真菌毒素中也得到了广泛的应用。BAGHER等[45]通过在片状MOF的纳米孔内制备银纳米粒子(AgNPs),合成了AgNPs@ZnMOF复合材料,以展青霉素为模板,通过3-氨基丙基三乙氧基硅烷和正硅酸四乙酯单体的共聚合,在AgNPs@ZnMOF表面形成分子印迹聚合物(molecular imprinted polymer,MIP)层,利用MIP的选择性识别特征和新型AgNPs@ZnMOF纳米复合材料优异的过氧化物活性,以及灵敏的荧光检测系统,设计了一种可靠的展青霉素探针,并成功用于展青霉素的选择性测定。其线性范围为0.1～10 μmol/L,LOD为0.06 μmol/L。该方法能够选择性地在复杂介质中测量展青霉素,不受类似物的干扰。Gu等[46]首次研制了基于金纳米粒子(AuNPs)掺杂分子印迹层和共价有机骨架复合物(COFs-AuNPs)的石英晶体微平衡传感器用于检测AFB1,其线性范围为0.05～75 ng/mL,LOD为2.8 pg/mL。目前,MOFs的水稳定性差,结构在溶液中容易坍塌,选择性有限,因此有研究者结合MOFs和COFs的优点实现对酶的包封,大大提高酶的装载率以及酶活性[47]。
噬菌体展示技术是20世纪80年代逐步建立并发展起来的一项分子生物学新技术。该技术可以构建抗体库、随机肽库、蛋白质突变体库和cDNA文库等，不仅广泛用于单链抗体的筛选、人源单克隆抗体的制备、先导化合物的筛选、药物筛选、细胞信号传导、基因表达调控、疫苗的研制、制药、免疫学、蛋白质工程、医学诊断、抗肿瘤[48]等研究领域,还已成为寻找高亲和力生物活性配体分子、探索受体与配体之间的相互作用位点、检测未知蛋白空间结构表位的工具[49]。目前,用于构建展示文库的噬菌体主要有丝状噬菌体、λ噬菌体、T4噬菌体和T7噬菌体。单链丝状噬菌体展示系统为pⅢ、pⅧ展示系统及其他展示系统；λ噬菌体展示系统中gpD可作为外源序列融合的载体,这种展示一般为N端展示；T4噬菌体展示系统为SOC位点的C末端和HOC位点的N末端；T7噬菌体展示系统是通过C端融合表达蛋白,插入片段被克隆到T7噬菌体载体基因10的C端,各系统各有优缺点。
噬菌体展示技术是一种快速、经济、有效的新型分子探针技术,它可以从一个巨大的随机文库中筛选特定的配体,并产生独特的多肽、蛋白和抗体,这些蛋白和抗体能够高亲和力和高特异性地与目标结合。何庆华等[50]以抗ZEN单克隆抗体为配体,利用噬菌体七肽库经3轮淘选后成功淘选到ZEN的模拟表位,其氨基酸序列分别为DAVILLM及HHCHWWH,ELISA显示2种序列均为阳性克隆,对ZEN毒素的抑制率达90%以上,检测线性范围为0.1～10 mg/L。HE等[51]以OTA为模型系统,通过二代肽文库筛选,分离得到1株十二肽型寡聚体,建立了OTA的化学发光ELISA检测方法,线性范围为0.006～0.245 ng/mL,并将其用于试纸条中,肉眼可视截止水平为1 ng/mL。ZOU等[52]利用商品化的7肽肽库经过4轮生物鉴定完成后,鉴定出30个克隆为阳性噬菌体颗粒,这些噬菌体的颗粒DNA测序结果显示了6种不同的肽序列,其中肽序列为GMVQTIF的噬菌体颗粒对OTA检测的敏感性最高。因此设计了生物素化的12聚体肽GMVQTIF-GGGSK-biotin作为竞争性抗原,建立竞争性肽ELISA。LOD为0.001 ng/mL,线性范围为0.005～0.2 ng/mL,其作为竞争性抗原的效率大约是OTA-HRP偶联物的5倍。反应动力学表明,生物素化12聚体肽对抗OTA单克隆抗体的亲和力低于常规化学OTA抗原。该方法可用于食品安全监测中其他有毒小分子的敏感检测。
目前,利用噬菌体展示技术制备抗真菌毒素单链抗体的真菌毒素有玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1、橘霉素等。噬菌体显示抗体片段制备简单、毒性低,包括重链可变区域(VHH)、单链可变片段(scFv)和抗原结合片段(Fab),VHH具有毒性低、溶解度高、易于遗传编辑、产量高、重折叠能力强等特点,与Fab和scFv相比,Fab和scFv更容易聚集,对目标亲和力较低,具有相当或更高的敏感性和亲和力,且具有优越的物理化学稳定性[53]。HE等[54]构建了筛选AFB1 抗体(Nb)的噬菌体展示文库,选择了2种AFB1特异性纳米体Nb26和Nb28进行ELISA,线性范围分别为0.117～5.676和0.171～6.431 μg/kg。WANG等[53]以羊驼VHH噬菌体展示文库中的抗ZEN单克隆抗体(mAb)作为模板,经过4轮循环筛选,分离得到1个与抗ZEN单克隆抗体高度亲和的抗独特型抗体VHH噬菌体Z1。基于Z1的ZEN噬菌体ELISA检测结果显示,线性范围为0.11～0.55 ng/mL,LOD为0.08 ng/mL。此外,将Z1的噬菌体颗粒应用于免疫聚合酶链反应(immuno-polymerase chain reaction,PD-IPCR)中,提供了检测抗原和DNA模板。与噬菌体ELISA相比,Z1在PD-IPCR的基础上LOD提高了12倍,LOD为6.5 pg/mL,线性范围为0.01～100 ng/mL。液相色谱-串联质谱验证了该方法的有效性,结果表明,PD-IPCR法用于谷物样品中ZEN的测定是可靠的,利用抗独特型VHH噬菌体作为无毒代物和PCR的信号扩增功能,使其在实际谷物ZEN分析中具有广阔的应用前景。SOMPUNGA等[55]报道了利用噬菌体展示抗体技术筛选到1株对游离 ZEN具有特异性的scFv克隆yZEN2A8,将编码yZEN2A8 scFv的基因亚克隆到pET-21 d(+)和pKP300 III载体中,分别生成重组scFv和scFv-Ap抗体,在优化条件下,竞争性ELISA检测结果显示,重组yZEN2A8 scFv抗体和scFv-Ap融合抗体的IC50分别为90 ng/mL和14 ng/mL,LOD分别为20 ng/mL和2 ng/mL。同源模型显示了重组抗体与ZEN的特异性结合,并证明了在抗体-抗原相互作用中,可变重链和轻链的互补决定区的作用。
近年来,噬菌体展示技术与纳米技术的结合在医学领域已经取得了巨大进展,如医学诊断和监测、分子成像、靶向药物和基因传递、疫苗开发以及骨和组织修复等技术。噬菌体这种感染细菌的病毒是进行纳米操作的理想材料,利用DNA合成、定点诱变和分子克隆等方法,可以很容易地对其进行工程设计,并将其作为制造纳米材料的多功能支架。Ngo-Duc等[56]利用噬菌体与氯仿的反复混合使900 nm的丝状噬菌体浓缩成为直径60 nm的球状,转化后的病毒保留了金的结合和矿化特性,用于组装金胶体团簇和合成金纳米结构。YI等[57]展示了基因工程的多功能M13噬菌体的p8主要外壳蛋白用来组装荧光单壁碳纳米管,p3次要外壳蛋白用于前列腺肿瘤的靶向荧光成像。NGUYEN等[58]利用噬菌体展示技术在pVIII衣壳蛋白上显示了富含半胱氨酸的多肽,其作为硫醇供体被还原生成活性硫醇基团,并与金包覆磁性纳米粒子高度凝聚结合,形成磁性噬菌体模板；再将特异性抗体和拉曼染料生物偶联在纳米颗粒表面制备成SERS基底,通过抗体和抗原的特异性结合实现对脓毒症的检测。HUANG等[59]将M13病毒作为一种多功能的生物支架,在其病毒衣壳上以分子精度装配荧光团,开发了M13病毒、花青素3染料和银纳米颗粒的联合装配；通过调节纳米颗粒大小以及纳米粒子与染料之间的距离,实现了高达24倍的花青素3的增强发射；且荧光随着病毒衣壳上染料表面密度的增加而增强,从而创建了一种能够精确结合分子并具有高发射率的荧光探针。GUO等[60]利用噬菌体的抗体片段的克隆化和表达系统成功筛选到能够特异性识别炭疽芽孢杆菌的单克隆抗体8G3,将其插入到噬菌体M13KO7的gp3蛋白基因上；gp8蛋白基因上插入金结合肽序列VSGSSPDS；得到的噬菌体颗粒同时在噬菌体末端展示抗体及多个结合金肽拷贝,构建了一个双功能噬菌体；将银增强技术应用于噬菌体酶联免疫吸附检测信号,结果显示炭疽芽孢杆菌灵敏度为5×103 CFU,比传统的噬菌体免疫试验提高10倍。目前,纳米材料与噬菌体展示技术在食品中的应用主要集中在食源性致病菌、病原菌检测等方面,在真菌毒素检测中的应用还较少报道。
综上所述,纳米材料可以通过疏水作用、氢键作用、静电作用、共价作用和π-π堆叠作用等有效地捕获真菌毒素。虽然各种纳米材料都各有其优缺点,但不同种类的纳米材料组合起来能明显提高真菌毒素的检测灵敏度。利用噬菌体展示技术淘选真菌毒素模拟表位肽,用这些模拟表位肽替代检测中的毒素标品,降低抗体制备成本,减轻对操作人员和环境的危害,最重要的是噬菌体还可作为纳米材料的支架,制备多种检测探针,检测食源性致病菌、病原菌。虽然纳米材料与噬菌体展示技术分别在真菌毒素检测中都有很广泛的应用,但其结合技术在真菌毒素检测方面还处于实验室阶段,然而实验结果已昭示新型纳米材料与噬菌体展示技术的结合无疑会引导未来对真菌毒素绿色、经济、高灵敏检测的潮流。
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