黑蒜是对新鲜生蒜在高温高湿环境下通过发酵得到的产品，即在既定环境中将蒜体本身破坏后，通过生蒜固有成分的理化反应而产生的。在黑蒜加工过程中，热处理会引起各种化学反应，如酶促褐变和美拉德反应，使大蒜的颜色从白色变为黄色再变为深褐色。黑蒜的含糖量、总酸含量以及多酚和类黄酮的含量均高于新鲜生蒜[1-2]。JUNG等[2]发现黑蒜比新鲜生蒜具有更强的抗氧化活性。此外，黑蒜中半胱氨酸(S-allylcysteine，SAC)的含量约是生蒜的5倍[3-4]。
传统的黑蒜加工工艺相对简单，但发酵时间长，一般为60～90 d，生产成本高，产品周期长。液态黑蒜的发酵还包括蒜瓣的预处理和后期真空包封等操作，其发酵时间为16～19 d[5]。虽然与传统黑蒜发酵工艺相比，黑蒜的液态发酵时间大大缩短，但预处理繁琐且工艺条件必须严格控制。与此同时，三段变温恒湿发酵法也可用于制作黑蒜，该工艺发酵时间一般为41 d，比传统发酵工艺时间短，发酵所得产品质量好。鉴于这些优点，本研究采用三段式变温恒湿发酵法制备黑蒜。
近年来微波-超声波辅助技术被广泛应用于植物有效成分提取，能够加快细胞释放多糖，提高多糖提取率。YU等[6]研究明确微波-超声辅助技术下植物多糖的提取率比于自然浸出提高了6.67%。
本文以单头大蒜和多瓣大蒜为原料，采用微波-超声波辅助技术和三段变温发酵法生产黑蒜。通过对加工过程中黑蒜品质指标的测定，建立品质评价模型，为优化和控制黑蒜加工过程中的品质提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
生鲜新蒜，购自广东省河源市本地农贸市场。
超纯水(Milli-Q系统)，马萨诸塞州比勒利卡市密理博公司；NaOH，中国北京百灵威科技有限公司；无水葡萄糖，中国上海博奥生物科技有限公司；3,5-二硝基水杨酸，中国上海萨恩化学技术有限公司；其他有机、无机试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
BPS-50CL恒温恒湿箱，中国上海亿恒科学仪器有限公司；CR-400比色计，日本美能达；GY-4硬度计，浙江拓普仪器公司;MesoMR23-040H-1低场核磁共振(LF-NMR)分析仪，苏州纽迈分析仪器股份有限公司。
1.3 样品制备
选择表皮微黄、斑点正常、无物理损伤或异常软化且成熟度相同的新鲜大蒜鳞茎进行加工。将鳞茎分为4组：单头黑蒜实验组(A)、多瓣黑蒜实验组(B)、单头黑蒜对照组(CA)和多瓣黑蒜对照组(CB)。各组按表1所示进行处理。预处理后，将各组样品放入恒温恒湿箱中，并在指定温度和湿度下进行加工(第一阶段：50～60 ℃，75～85%；第二阶段：60～70 ℃，75～85%；第三阶段：40～50 ℃，40～50%)。每天对加工后各组鳞茎的特性进行评估。测量分3次进行，同时进行评估，直到各组鳞茎的食物价值呈最大化(与市面上出售的黑蒜相比较)。
表1 黑蒜的加工处理组
Table 1 Processing treatments for the black garlics
预处理生蒜样品单头黑蒜多瓣黑蒜微波-超声波辅助预处理AB未处理CACB
1.4 理化性质测定
1.4.1 色差分析
参考POEL等[7]的方法并稍作修改，通过评估每组的3个鳞茎来检测色差。使用CR-400比色计在鳞茎的一致位置(从黑蒜体的外表面和黑蒜体凹线的内表面选择)评估表皮颜色。黑蒜样品的颜色使用L*a*b*色度坐标，以“a”为起始色度坐标进行定量测定，其中L*表示亮度，a*表示红绿色，b*表示黄蓝色。每组测定分3次进行。
1.4.2 硬度分析
参考文献[8]，将硬度计预热10 min并设置为零数值，将硬度计平行放置在测量台上，随后选择鳞茎上3个点，按照恒定速度按下手柄以读取峰值，峰值读数记录即为硬度值，单位为kg/cm2。
1.4.3 还原糖分析
将5.00 g黑蒜于150.00 mL去离子水中搅拌均匀，随后在60 ℃条件下不断搅拌3 h。使用吸滤器过滤，3,5-二硝基水杨酸(DNS)方法计算还原糖含量[9]。使用双光束紫外可见分光光度计监测pH值，并在540 nm波长下读取吸光度。大蒜溶液的还原糖含量按公式(1)计算。
(1)
式中：m，还原糖含量，mg/g；ρglucose solution，按吸光度值计算出的葡萄糖溶液质量浓度，mg/mL；N，物质的量；mblack garlic，黑蒜样品质量，mg。
1.4.4 低场核磁共振分析
使用磁场强度为20.00 MHz的低场核磁共振分析仪进行核磁共振测序， Carr-Purcell-Mei-Boom-Gill(CPMG)脉冲序列从32次重复扫描中获得2 000次回波横向驰豫数据(T2)。每次测序重复3次。
采用Multi-Exp-Inv分析软件对CPMG的衰减曲线进行分布指数拟合。利用软件算法对弛豫数据进行多指数拟合分析，得到单个弛豫过程的弛豫幅度与弛豫时间的关系曲线，从峰值位置计算出各过程的时间常数，同时峰下面积(相当于水分子的弛豫时间峰面积)通过积分得出。此外，弛豫总体宽度计算作为给定峰值的观察弛豫时间的标准偏差。
1.4.5 感官评价
选取10名专业人员对加工过程中不同时间的黑蒜样品进行感官评估。评估基于5个预先定义的特征(颜色、干燥度、质地、气味和味道)。得分范围为0～20，其中0是最差的特征，20是最好的特征(表2)。将样品冷却至室温，在测试前30 min准备一小盘的样品，随后给每个小组成员取一茶匙量进行感官评价。
表2 感官吸引力评分规则
Table 2 Sensory appeal scoring rubric
分数颜色干燥度质地气味味道16～20均匀的深褐色很好触碰无黏性柔软不粘牙没有大蒜气味酸甜11～15内外颜色不均匀的深褐色一般触碰有点黏柔软有点粘牙轻微大蒜气味酸甜伴随更明显的苦味6～10不均匀的棕色差触碰很黏稍硬粘牙适度的大蒜气味苦味明显略带酸甜0～5黄色浅黄色白色差触碰很黏坚硬粘牙强烈的大蒜气味苦味明显没有酸甜
1.4.6 统计分析
利用ANOVA进行方差分析。通过Duncan多重极差或最小二乘差(LSD)检验数据中各项平均差(P<0.05)。采用SPSS 13.0进行统计所有试验重复3次。
2 结果与分析
2.1 还原糖
图1显示，在加工过程中随着时间增加，黑蒜的还原糖含量不断提高。从第6天开始，A组(图1-c)的还原糖含量与CA组有显著差异(P<0.05)，而B组(图1-f)从第8天开始与CB组相比还原糖含量有显著差异(P<0.05)。因此，微波-超声波辅助预处理提高了黑蒜中还原糖的含量。加工至第三阶段结束时，还原糖含量仍然很高，主要来源于蔗糖、葡萄糖和果糖，有可能是大蒜中多糖(如果聚糖和半乳糖)降解的产物。黑蒜中增加的还原糖(果糖和葡萄糖)含量分别促进了酸味和甜味，赋予了黑蒜果味[10]。加工至第11天，黑蒜的颜色和味道都得到了显著改善。由此推断，美拉德反应在第11天左右最为强烈。
图1 黑蒜加工1(D1)、6(D6)、11(D11)和41(D41)d的LF-NMR T2弛豫时间分布
a-单头黑蒜实验组;b-单头黑蒜对照组;d-多瓣黑蒜实验组;e-多瓣黑蒜对照组(每条线代表每个采样时间的9条曲线的
平均值,3个样本中的每一个都有3个测量值)；c-单头黑蒜加工过程中还原糖变化;
f-多瓣黑蒜加工过程中还原糖含量的变化
Fig.1 Distribution of LF-NMR T2 relaxations times in black garlic processed for 1(D1), 6(D6), 11(D11), and 41(D41) day
*表示显著差异(P<0.05)(下同)
2.2 色差数据分析
采用比色计对鳞茎的一致位置进行测量，并通过色度坐标记录不同组的颜色参数。表3显示了颜色参数(Δa、Δb、ΔL和ΔE)的平均值。O代表外表面，I代表内表面。8组的亮度具有显著差异性(P<0.05)。单头黑蒜表皮在加工过程中亮度均下降，多瓣黑蒜表皮亮度先升高后降低(表3)，说明随着加工时间延长，蒜瓣的亮度降低可能是褐变减少的结果。
参数1)时间/d样品2)AOAICAOCAIBOBICBOCBIΔa133.61±0.04c,D40.21±2.42d,C30.40±0.16b,D27.61±0.38a,C54.36±0.23f,D46.42±0.12e,D46.83±0.08e,C41.33±0.11d,D621.63±0.38b,C39.99±0.64e,C19.74±0.01a,C36.49±0.80d,D45.84±0.25f,C35.57±0.45c,C47.01±0.03g,C40.10±0.02e,C116.76±0.21c,B14.10±0.05d,B5.22±0.07b,B-0.48±0.11a,B19.28±0.12f,B21.51±0.27g,B18.59±0.12e,B25.06±0.34h,B41-5.76±0.04b,A-3.01±0.24d,A-6.65±0.05a,A-4.90±0.30c,A0.76±0.07e,A4.54±0.20g,A8.50±0.03h,A3.83±0.16f,AΔb17.78±0.11d,B3.75±1.39c,A8.44±0.13de,B8.87±0.14e,D-2.37±0.03a,A-1.15±0.04b,A-1.67±0.06ab,A-1.66±0.03ab,A611.43±0.02g,D3.26±0.21d,A12.14±0.03h,D3.68±0.16e,A2.83±0.07c,B5.77±0.29f,B1.51±0.06a,B1.84±0.03b,B1110.09±0.11d,C11.26±0.03e,D9.78±0.03c,C7.94±0.09a,C11.35±0.01e,D9.11±0.12b,C10.32±0.01d,C9.08±0.36b,C414.11±0.02b,A8.95±0.20f,C2.73±0.06a,A5.56±0.11c,B8.10±0.05d,C8.66±0.01e,C11.74±0.02h,D10.14±0.05g,DΔL128.31±0.11g,D23.93±2.24e,D26.47±0.11f,D27.90±0.27g,D12.12±0.09a,B21.09±0.02d,B19.48±0.05c,C16.46±0.03b,B622.02±0.10e,C19.59±0.13a,C21.32±0.03c,C21.70±0.12d,C22.24±0.09e,D27.36±0.43g,C22.63±0.10f,D20.17±0.10b,D119.33±0.07b,B17.51±1.15c,B8.07±0.02a,B9.83±0.21b,B16.90±0.04c,C20.23±0.12e,B17.05±0.02c,B19.37±0.75d,C41-0.03±0.04b,A5.76±0.46d,A-1.92±0.03a,A-0.01±0.08b,A3.28±0.01c,A10.41±0.03f,A11.36±0.01g,A8.77±0.33e,AΔE144.63±0.12c,D47.03±0.84d,D41.19±0.22b,D40.24±0.48a,C55.74±0.22f,D51.00±0.11e,D50.75±0.09e,C44.52±0.09c,C632.91±0.32b,C44.64±0.51d,C31.50±0.03a,C42.62±0.61c,C51.03±0.18f,C45.25±0.09e,C52.20±0.03g,D44.92±0.03de,D1115.32±0.13c,B25.61±0.01d,B13.72±0.03b,B12.65±0.11a,B28.04±0.10f,B30.90±0.08g,B27.25±0.09e,B32.96±0.29h,B417.08±0.04a,A11.07±0.34d,A7.44±0.06b,A7.41±0.12b,A8.78±0.04c,A14.28±0.07f,A18.41±0.01g,A13.94±0.20e,A
注：同一栏中不同大写字母标注表示平均值有显著差异 (P<0.05);同一列中不同小写字母标注表示平均值有显著差异 (P<0.05)(下同)
加工第一、第二阶段固有成分的美拉德反应引起黑蒜褐变，加工第三阶段进行酶促褐变。黑蒜加工第二阶段中美拉德反应加快，类黑素等反应产物迅速积累。AO、AI、CAO、CAI、BO、BI组蒜瓣表皮颜色亮度呈下降趋势，CBO和CBI组蒜瓣表皮颜色亮度先升高后降低。实验组褐变程度高于对照组，说明微波-超声波辅助预处理对酶促反应引起表皮颜色变化有影响。大蒜样品的总色差(ΔE)随着热处理时间的延长而增大[11]。黑蒜样品的褐变程度由加工时间的延长而增加，41 d后表皮呈黑褐色。
1)Δa 代表红色和绿色的色差，Δb 代表蓝色和黄色的色差，ΔL代表亮度差异, 其中正值表示蒜皮较明亮，负值表示蒜皮较暗.ΔE代表总色差, 差别越大，颜色变化越明显
2)样品:AO=单头黑蒜实验组外表皮, AI=单头黑蒜实验组内表皮， CAO=单头黑蒜对照组外表皮, CAI=单头黑蒜对照组内表皮, BO =多瓣黑蒜实验组外表皮, BI=多瓣黑蒜实验组内表皮, CBO=多瓣黑蒜对照组外表皮, CBI =多瓣黑蒜对照组内表皮
2.3 水分含量分析
利用低场核磁共振进行核磁共振测序，并采用CPMG序列反演法测定样品的横向弛豫时间，其中样品的积分面积(标准化质子密度)与样品中给定成分的含量成正比[12]。图1显示了黑蒜样品在加工过程中CPMG弛豫衰减曲线，由于其他类型的水信号太弱而无法检测，图像中仅观察到一种水类型，被定义为T2且指定为自由水[13]。随着处理时间的延长，CPMG信号衰减变得缓慢，这说明在处理过程中水的流动性增加。如图1-a、b、d、e所示，T2反演图的波峰代表大蒜的水分状态，对应的峰积分面积为A2(T2的峰面积)。
结果发现，各组处理前T2峰面积均小于加工后，说明鳞茎在加工过程中自由水含量降低。在高温高湿条件下，黑蒜自由水含量降低，但黑蒜实验组自由水含量高于对照组。由此合理推测微波-超声波辅助预处理破坏了黑蒜的组织和细胞，促进了自由水在高湿度环境中的进出。
由于黑蒜中的自由水含量只受环境湿度和试验条件的影响[14]。随着加工时间的延长，T2弛豫时间逐渐缩短，这说明水的流动性降低，推测延长加工时间可以降低自由水的活性，并进一步限制其自由度。
图2显示了黑蒜的核磁共振图像。在加工的第一和第二阶段，明亮区域从蒜瓣的外部到内部逐渐增加，说明水正处于持续释放状态。在加工的第三阶段，单头黑蒜组的明亮区域再增加，而多瓣黑蒜对照组的明亮区域亮度正逐渐减弱，结果发现除了CB组以外其他组的自由水均转移到了蒜瓣表面。
图2 加工过程中1, 6, 11和41 d的黑蒜外观
Fig.2 Appearance of black garlic processed for 1, 6, 11 and 41 d
2.4 感官评价
感官评价结果如图3所示。B组和CB组样品的干燥度随着时间增长而迅速下降。单头黑蒜组的味觉得分高于多瓣黑蒜组，其中实验组样品的味觉得分高于对照组。每组在加工第一阶段的嗅觉评估中均高于15分；在加工的第二阶段，样品颜色得分均保持不变，单头黑蒜组味觉得分增加，而干燥度得分相似，维持在10～15分。
a-1 d;b-6 d;c-11 d;d-41 d
A-单头黑蒜实验组；CA-单头黑蒜对照组;
B-多瓣黑蒜实验组;CB-多瓣黑蒜对照组
图3 黑蒜在加工过程中的T2加权图像
Fig.3 T2 weighted images of black garlic processed
结果显示，在加工第41天，实验组的干燥得分均高于15分，单头黑蒜对照组的干燥得分在10～15分之间，多瓣黑蒜对照组的干燥得分在5～10分(图3-e)。在加工41 d后，实验组的5项感官得分均超过15分(图3-e)，而对照组均低于15分，说明微波-超声波辅助预处理操作能够将黑蒜的加工时间缩短至41 d。
2.5 黑蒜加工理化指标的相关性研究
图4显示，A组和CA组理化指标变化规律非常明显(图4-a)，说明黑蒜的品质随着三段发酵过程(第一阶段：1～5 d，第二阶段：6～9 d，第三阶段：10～41 d)的进行而变化。在第一、二段发酵期间，实验组和对照组理化数据相对接近，而A组和CA组的理化性质在第9天开始有了显著差异。多瓣蒜B、CB组在三段发酵法试验初期品质变化与单头蒜A、CA组差异显著(图4-b)，但理化数据无明显变化。
a-单头蒜品质参数气泡图;b-和多瓣蒜品质参数对比;c-黑蒜的自由水含量的箱式分析;d-颜色;e-气味;f-口感
图4 黑蒜加工理化指标
Fig.4 Physicochemical indexes during black garlic processing
在三段发酵过程中，不同阶段的黑蒜品质不同。发酵第一阶段中，实验组与对照组的水分含量相似，而发酵第二阶段A组的水分含量明显高于CA组。B组水分含量也高于CB组，两组间差异不显著。发酵第三阶段与前两个阶段相比(图4-c)，各组的水分含量显著降低。第1～8天，4组大蒜外观色泽得分较低，蒜体呈白色或黄褐色。第9～12天，A组和CA组的物理性质数据相对集中且较高， B组和CB组的物理性质数据相对较低。A组在发酵第三阶段中数据相对集中稳定，与CA组相似。B组和CB组数据也相似，但由于样品个体差异，数据分布并不集中(图4-d)。在嗅觉方面，第一阶段各组得分有显著差异，数据不集中，但总体呈上升趋势；第二阶段，A组的气味数据比CA组更集中且更高，而B组的气味数据高于CB组；第三阶段，4组气味数据波动较大，分布不集中(图4-e)。在口感方面(图3-f)，3个阶段各组数据相对集中，A组味道得分高于CA组，B组得分高于CB组，可见黑蒜实验组的感官品质优于对照组。
从图5-a可以看出，水分含量与黑蒜干燥度关系最为密切，与其他指标关系不大。还原糖含量与气味、味道和颜色3个方面密切相关，其次与大蒜质地有关。从图5-b可以看出，影响黑蒜味道的最大因素是颜色，其次是鳞茎质地、还原糖含量和气味(图5-b1)。除硬度外，其他指标与气味有关且比例相似(图5-b2)。影响黑蒜颜色相关系数最大的是味道与还原糖含量，其次与质地、水分含量与气味等方面有关，与干燥度和硬度无关(图5-b3)。鳞茎质地与味道、色泽、还原糖含量、气味这4个因素呈正相关，相关系数分别为0.45、0.49、0.28和0.25(图4-c)。味道与颜色(0.66)、还原糖含量(0.37)、气味(0.24)呈正相关；颜色与还原糖含量(0.58)和气味(0.26)呈正相关；还原糖含量与气味(0.30)呈正相关。气味与干燥度呈负相关(-0.26)。此外，水分含量与气味(-0.21)、还原糖含量(-0.37)、颜色(-0.27)和鳞茎质地(-0.16)呈负相关。
Venn图结果显示，17的数据可以直接使用单头蒜的化学性质表示(图6-a)，只有10的数据可以使用多瓣蒜的化学性质表示(图6-b)，推测单头蒜的颜色与其化学性质有较高的相关性。
a-聚类热图分析;b-弦图分析;b1-味道串图分析;b2-气味串图分析;b3-颜色串图分析;c-黑蒜品质参数相关系数图
图5 黑蒜品质参数的图形分析
Fig.5 Graphic analysis of quality parameters of black garlic
a-单头黑蒜化学特性及其色泽Venn图;b-多瓣黑蒜化学特性;c-单头黑蒜的NMDS分析;
d-多瓣黑蒜NMDS分析;e-味觉品质评价模型;f-气味品质评价模型
图6 黑蒜的化学性质
Fig.6 Chemical quality of black garlic
采用非计量多维标度分析(NMDS)对黑蒜的化学性质和色泽进行分析，发现单头蒜的化学性质在整个发酵过程中呈规律性变化。从散点图(图6-c)结果可见，三段发酵工艺提高了单头黑蒜的品质。多瓣蒜在发酵过程中数据变化不明显，数据分布分散(图6-d)，差异明显。
在此基础上，本文建立了2种黑蒜品质分级模型。首先，我们建立了黑蒜味觉品质分级模型(见图5-e)。最为相关的因素是大蒜内部颜色的亮度(LI)。当LI>32.09时，评定为低质量；当LI≤32.09时，需要考察次要相关因素硬度(Hn)(表4)。
表4 黑蒜样品(n=3)的硬度 单位：g
Table 4 Hardness values of black garlic samples (n=3)
时间/dACABCB15.47±0.87a,A6.61±1.15a,A5.22±0.99a,A6.93±1.70b,A68.94±1.59b,B6.01±1.91a,A5.51±1.21a,A5.81±1.40ab,A116.81±0.77a,A7.68±1.09a,A6.50±1.20a,A7.12±1.03b,A417.13±0.83ab,B7.17±0.35a,B8.87±1.07b,C4.20±0.26a,A
当Hn≤5.37时，为中等硬度；Hn>5.37时，为高硬度。第二个模型(见图5-f)与黑蒜气味有关，与前一个模型类似，与黑蒜味道最相关的因素是LI。当LI≤32.09时，黑蒜为优质；当LI>32.09时，需考察水分活度的次要相关因子(由核磁共振成像后峰面积确定)；当FW>10 171.91时，黑蒜为中等品质；当FW≤10 171.91时，为劣质大蒜。
3 总结与讨论
为改善黑蒜品质，本文以单头大蒜和多瓣大蒜为原料，采用微波-超声波辅助技术预处理和三段发酵工艺进行加工得到单头黑蒜以及多瓣黑蒜。结果显示，在加工制成黑蒜的过程中，热处理会引起各种化学反应，如酶促褐变和美拉德反应，使大蒜的颜色从白色变为黄色再变为深褐色。采用比色计及L*a*b*色度坐标进行定量测定，发现黑蒜样品的褐变速率在加工第二阶段最快，第三阶段最慢，且黑蒜实验组的褐变程度高于对照组。通过CPMG驰豫衰减曲线分析发现黑蒜样品自由水含量随着加工时间的增长而降低。感官评价雷达图结果显示，加工41 d后黑蒜品质达到最佳，黑蒜实验组的感官品质明显优于对照组，说明微波-超声波辅助技术不仅缩短了加工时间，对黑蒜品质也有较大提高。
结合黑蒜品质与水分变化、硬度、色差、还原糖含量及感官评价等方面的相关性分析结果，发现三段发酵工艺提高了单头黑蒜品质，但对多瓣黑蒜品质影响不大。通过热图、不同性质相关串图以及NMDS综合评价了黑蒜不同性质的相关性，其中黑蒜颜色与味道相关性系数达0.66，并还原糖含量和气味都呈极强正相关，由此推测黑蒜性状与其化学性质有关。YOU等[15]比较了4种不同类型的黑蒜，发现已发酵且陈化的黑蒜还原糖含量为25.90%，总酚含量为0.72 mg/mL，两者均高于其他3种黑蒜，其抗氧化能力也显著高于其他3种黑蒜。HYEON等[16]概述了黑蒜的理化性质和功能活性，表明黑蒜在陈化过程中总酚、总糖、类黄酮含量增加，从而提高了黑蒜的抗氧化活性。
最后根据上述结果以LI为主要因素建立简单品质评定模型参数间相关关系，为改善黑蒜品质，提高黑蒜生产速度提供依据。今后的工作重点是将品质与功能活动相结合，建立更全面的黑蒜品质评价模型。
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