虎杖内生真菌Aspergillus aculeatus HZ001产β-葡萄糖苷酶的酶学特性

于洁1,2,徐勤茜1,2,李子院1,2,刘红艳1,2,郝再彬1,2,李海云1,2*

1(桂林理工大学 化学与生物工程学院,广西 桂林,541004) 2(广西高校食品安全与检测重点实验室(桂林理工大学),广西 桂林,541004)

摘 要 中药虎杖含有丰富的虎杖苷,利用生物转化技术将其转化为白藜芦醇是制备天然白藜芦醇的有效方法。虎杖内生真菌Aspergillus aculeatus HZ001细胞可催化虎杖苷转化为白藜芦醇,该文对该菌株产胞内β-葡萄糖苷酶的酶学性质进行研究。结果表明:该酶的最适反应温度为60 ℃,在低于60 ℃时有较好的稳定性;最适反应pH为4.8,在pH 3.6~4.0时有较好的稳定性;Fe2+对其活力有激活作用,相对酶活力可达到120%,Ca2+、Co2+、Mg2+等离子对酶活力有明显的抑制作用,其中Co2+的抑制作用最明显;十二烷基硫酸钠、巯基乙醇、二甲基亚砜和乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)4种抑制剂对该酶活力具有抑制作用,其中EDTA的抑制效果最为明显,相对酶活力仅有10%左右。在最适催化条件下,进行酶催化动力学分析,米氏常数Km值为2.571 mmol/L,最大反应速率Vmax值为0.594 μmol/(mL·h)。

关键词 虎杖;内生真菌;刺孢曲霉;β-葡萄糖苷酶;酶学性质

白藜芦醇是一种非黄酮类多酚化合物,具有抑制肿瘤、抗癌等多种生理活性[1-4]。采用溶剂法直接从植物中提取分离白藜芦醇,是目前天然白藜芦醇最主要的生产方法[5-6]。中药虎杖中白藜芦醇含量较低,但虎杖苷含量较高,质量分数可达2.55%,因而利用微生物或酶法转化虎杖苷是制备白藜芦醇的可行途径之一[7-8]。β-葡萄糖苷酶属于纤维素酶类,能水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖键,同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基[9-10],在食品、医药和化妆品等领域中有重要的应用价值[11-12]。目前,国内外研究所用的β-葡萄糖苷酶主要来源于微生物[13-14],利用微生物制备的酶液可用于虎杖苷转化成白藜芦醇[15]。冯薇等[16]通过栀子苷平板初筛、虎杖苷摇瓶复筛,筛选得到1株能够分泌β-葡萄糖苷酶转化虎杖苷生成白藜芦醇的菌株沙福芽孢杆菌Bacillus safensis CGMCC13129,对底物虎杖苷的转化率可达90%以上;ZHOU等[17]从黑曲霉Aspergillus niger SK34.002中分离纯化了水解虎杖苷生成白藜芦醇的β-葡萄糖苷酶,并考察了其酶学性质;XUE等[18]对海栖热袍菌Thermotoga maritima中热稳定的β-葡萄糖苷酶水解虎杖苷生成白藜芦醇的性质进行了研究。

本课题组前期从虎杖中分离获得1株内生真菌Aspergillus aculeatus HZ001,其胞内提取物可水解虎杖苷生成白藜芦醇,本文探讨了该菌株产β-葡萄糖苷酶基本酶学性质,为后期该酶的分离纯化及应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

虎杖内生真菌Aspergillus aculeatus HZ001,分离自虎杖根。

马铃薯葡萄糖(potato dextrose agar,PDA)培养基:去皮马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,水1 000 mL。

发酵培养基:NaNO3 2.0 g,K2HPO4 1.0 g,KCl 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,FeSO4 0.01 g,蔗糖30 g,蒸馏水1 000 mL。

1.2 主要试剂

水杨苷,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;巯基乙醇,上海贤鼎生物科技有限公司;二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、葡萄糖、琼脂、Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4,汕头市西陇化工有限公司。所用试剂均为分析纯或生化试剂,所用水均为二次蒸馏水。

1.3 主要仪器

振荡培养箱(LRH-150-Z),珠江韶关市泰宏医疗器械有限公司;立式压力蒸汽灭菌器(BXM-30R),上海博讯实业有限公司医疗设备厂;超净工作台(CJ-1SFS),天津市泰斯特仪器有限公司;冷冻离心机(DL-5-B),德国sigma;数显恒温水浴锅(HH-S2),金坛市医疗仪器厂;可见分光光度计(VIS-722ON),北京瑞利分析仪器有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 孢子悬液的制备

将试管斜面保存的菌株HZ001经PDA培养基平板活化后,接种到平板产孢培养基,于30 ℃恒温培养箱中培养4 d,待孢子形成后,用无菌水制成106~107 CFU/mL的孢子悬液。

1.4.2 摇瓶培养

取5 mL孢子悬浮液接种到灭菌冷却后的100 mL液体发酵培养基中,在30 ℃,150 r/min的条件下振荡培养4 d。

1.4.3 粗酶液的制备

培养完毕,将发酵液抽滤、水洗后,收集湿菌体加入液氮冷冻研磨后,加入4倍体积的0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH6.5),用玻璃匀浆器研磨成匀浆[18],4 ℃,10 000 r/min冷冻离心10 min,收集上清液采用质量浓度为662 g/L的(NH4)2SO4溶液盐析后,4 ℃,10 000 r/min 离心10 min,收集沉淀,用蒸馏水复溶,充分溶解后4 ℃,10 000 r/mnin 离心10 min,取上清液,透析除盐后,定容得粗酶液。

1.4.4 β-葡萄糖苷酶酶学性质的研究

1.4.4.1 最适催化温度和热稳定性的测定

以质量浓度为5.0 g/L水杨苷(溶于pH 4.8的醋酸缓冲液)为底物,分别于40、45、50、55、60、65和70 ℃反应1 h后测定酶活力。

稳定性的测定:取适量体积的粗酶液置于40、45、50、55、60、65和70 ℃水浴中保温10 h,每隔2 h取样,以未处理酶液的酶活力为100%,测定相对酶活力。

1.4.4.2 最适pH 值及pH稳定性

分别配制pH为3.2、3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.6和6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液,在最适催化温度下测定不同pH的酶活力,考察不同pH对β-葡萄糖苷酶催化反应的影响。

稳定性的测定:将粗酶液用醋酸-醋酸钠缓冲液调节pH值后,在最适催化温度下保存不同时间,以未处理酶液的酶活力为100%,测定相对酶活力。

1.4.4.3 不同金属离子对β-葡萄糖苷酶活力的影响

取适量粗酶液分别加入CaCl2、MgSO4、FeSO4和CoSO4溶液,使金属离子终浓度为 1.0 mmol /L,在最适温度和最适pH条件下,以不加金属离子的酶活力为100%,测定相对酶活力。

1.4.4.4 其他抑制剂对β-葡萄糖苷酶酶活力的影响

分别在酶反应液中加入巯基乙醇、SDS、DMSO和EDTA等常见酶抑制剂,使各抑制剂的最终浓度均为1.0 mmol/L,在最适温度和最适pH条件下,以不加抑制剂的酶活力为100%,测定相对酶活力,考察不同抑制剂对β-葡萄糖苷酶活性的影响。

1.4.4.5 酶催化动力学模型的建立

在最适催化条件下,采用不同浓度的底物溶液进行酶催化反应,测定反应初速度V,绘制V-[S]曲线,构建动力学模型,计算最大反应速率Vmax和米氏常数。

1.4.5 蛋白质含量和β-葡萄糖苷酶酶活力的测定

蛋白质含量采用考马斯亮蓝G-250法[19],β-葡萄糖苷酶酶活力的测定参照韩萍萍等[20]的方法。β-葡萄糖苷酶酶活为单位定义为:在最适温度和最适pH条件下,1 min分解底物水杨苷生成1 μmol葡萄糖所需的酶蛋白量(mg)为1个酶活力单位(U)。酶活力单位以U/mg表示。

2 结果与分析

2.1 最适反应温度和热稳定性

不同温度下虎杖内生真菌HZ001所产葡萄糖糖苷酶酶活力变化如图1所示。在温度低于60 ℃时,酶活力随着温度的升高而上升;反应温度为60 ℃时,酶活力达最大值,为134.3 U/mg;随着温度的继续升高,酶活力下降,在反应温度为70 ℃时,该酶丧失大部分活性。

图1 温度对虎杖内生真菌A.aculeatus HZ001 β-葡萄糖苷酶活性的影响
Fig.1 Effect of temperature on the activity of β-glucosidase produced by the endophytic fungi A.aculeatus HZ001 from Polygonum cuspidatum

虎杖内生真菌HZ001所产β-葡萄糖苷酶的热稳定性,其结果如图2所示。当温度低于60 ℃时,β-葡萄糖苷酶稳定性较好;当温度超过60 ℃时,β-葡萄糖苷酶稳定性下降;当70 ℃保存6 h时,其酶活力基本完全丧失。

图2 虎杖内生真菌A.aculeatus HZ001 β-葡萄糖苷酶的热稳定性
Fig.2 Thermal stability of β-glucosidase produced by the endophytic fungi A.aculeatus HZ001 from Polygonum cuspidatum

2.2 最适反应pH和pH稳定性

pH 会影响酶的构象,还会影响酶与底物的解离状态,从而影响酶的活性和稳定性。由图3可知,在pH为4.8条件下,酶活力最高,为133.6 U/mg,在pH低于4.8条件下,随着pH值的增加,酶活力逐渐上升;而当pH值高于4.8时,酶活力随着pH值的升高而显著降低。

图3 pH对虎杖内生真菌A.aculeatus HZ001 β-葡萄糖苷酶活性的影响
Fig.3 Effect of pH on the activity of β-glucosidase produced by the endophytic fungi A.aculeatus HZ001 from Polygonum cuspidatum

虎杖内生真菌HZ001所产β-葡萄糖苷酶在不同pH下的稳定性如图4所示。该酶在pH为3.6~4.0时有较高的残留酶活力,此条件下相对酶活力随着保温时间的增加而逐渐趋于平缓,相对酶活力维持在80%左右;当pH值不断升高时,随着保温时间的增加,相对酶活力逐渐降低,β-葡萄糖苷酶酶活力逐渐丧失。

图4 虎杖内生真菌A.aculeatus HZ001 β-葡萄糖苷酶的热稳定性
Fig.4 Thermal stability of β-glucosidase produced by the endophytic fungi A.aculeatus HZ001 from Polygonum cuspidatum

2.3 金属离子对β-葡萄糖苷酶活力的影响

在最适条件下,金属离子对虎杖内生真菌HZ001所产β-葡萄糖苷酶酶活力的影响如表1所示。当体系中金属离子浓度为1.0 mmol/L 时,Fe2+对β-葡萄糖苷酶具有一定的激活作用,相对酶活力达120.36%;而Co2+、Ca2+和Mg2+对该酶有一定的抑制作用,其中Co2+的抑制作用最明显,在反应液中加入该离子后,相对酶活力仅为19.65%。

表1 金属离子对虎杖内生真菌A.aculeatus HZ001 β-葡萄糖苷酶活性的影响
Table 1 Effect of metal ions on the activity of β-glucosidase produced by the endophytic fungi A.aculeatus HZ001 from Polygonum cuspidatum

金属离子/(mmol·L-1)相对酶活力/%Co2+19.65±6.54Fe2+120.36±10.76Ca2+38.36±8.72Mg2+39.46±9.21

2.4 抑制剂对β-葡萄糖苷酶活力的影响

在最优条件下,常见酶抑制剂对虎杖内生真菌HZ001所产β-葡萄糖苷酶酶活的影响如图5所示。其中,EDTA、DMSO、巯基乙醇和SDS等4种抑制剂对该酶都有一定的抑制作用,因 EDTA与该酶催化所需的金属离子发生络合作用,加入EDTA后,β-葡萄糖苷酶的相对酶活力最低,仅10%左右。

图5 抑制剂对虎杖内生真菌Aspergillus aculeatus HZ001 β-葡萄糖苷酶活性的影响
Fig.5 Effect of inhibitors on the activity of β-glucosidase
produced by the endophytic fungi A.aculeatus HZ001 from Polygonum cuspidatum

2.5 β-葡萄糖苷酶动力学分析

酶的动力学参数是酶学中的一个重要指标,是作为评估酶与底物亲和力的重要参考。通过考察不同底物浓度对虎杖内生真菌HZ001所产β-葡萄糖苷酶催化反应速度的影响,以底物浓度[S]的倒数为横坐标,初速度V的倒数为纵坐标作Lineweaver-Burk双倒数图,得到一条直线,其回归方程为 y=4.332 1x+1.684 8(R2=0.991 4),该直线在X轴的截距为1/Km的绝对值,在Y轴的截距为1/Vmax,据此计算出米氏常数Km值为2.571 mmol/L,Vmax值为0.594 μmol/(mL·h)。

3 结论

本文以虎杖内生真菌A.aculeatus HZ001所产β-葡萄糖苷酶为目标,考察了温度、pH、金属离子和其他抑制剂等对该β-葡萄糖苷酶酶活力及稳定性的影响。该酶最适温度为60 ℃、最适pH 4.8,在低于60 ℃、pH 3.6~4.0条件下较稳定。在选取的4种金属离子中,Fe2+可以促进该酶催化,相对酶活力达到了120.36%;而Co2+等离子明显抑制该酶催化,相对酶活仅有19.65%。巯基乙醇、SDS、DMSO、EDTA等4种抑制剂均对该酶有抑制作用,其中EDTA的抑制作用最明显,在该抑制剂作用下相对酶活力仅有10%左右。以水杨苷为底物时,该酶催化反应的米氏常数Km值为2.571 mmol/L,Vmax值为0.594 μmol/(mL·h)。

参考文献

[1] 陈旭, 李风录,邢晓艺,等.白藜芦醇的药理活性研究进展[J].药学研究,2020,39(5):284-288.

CHEN X,LI F L,XING X Y,et al.Research progress on pharmacological activity of resveratrol[J].Journal of Pharmaceutical Research,2020,39(5):284-288.

[2] 孙治刚, 李志娜,李敏.白藜芦醇的药理作用研究进展[J].淮海工学院学报(自然科学版),2017,26(2):40-43.

SUN Z G,LI Z N,LI M.Research progress on pharmacological effects of resveratrol[J].Journal of Huaihai Institute of Technology(Natural Science Edition),2017,26(2):40-43.

[3] PARK E J,PEZZUTO J M.The pharmacology of resveratrol in animals and humans[J].Biochimica Et Biophysica Acta,2015,1852(6):1 071-1 113.

[4] MOHAMED E,CHEN Y,WANG X J,et al.Resveratrol:An overview of its anti-cancer mechanisms[J].Life Sciences,2018,207:340-349.

[5] 张颖, 刘义梅.虎杖中白藜芦醇提取工艺研究进展[J].食品安全质量检测学报,2019,10(7):1 884-1 889.

ZHANG Y,LIU Y M.Research progress on the extraction process of resveratrol from Polygonum cuspidatum[J].Journal of Food Safety & Quality,2019,10(7):1 884-1 889.

[6] AL BALKHI M H,MOHAMMAD M A,TISSERANT L P,et al.Development of a liquid-liquid extraction method of resveratrol from cell culture media using solubility parameters[J].Separation & Purification Technology,2016,170:138-145.

[7] XU Z,TIAN J,GAN L,et al.Discovery of the endophytic fungi from Polygonum cuspidatum and biotransformation of resveratrol to pterostillbene by the endophyte Penicillium sp.F5[J].Applied Biochemistry and Microbiology,2020,56(3):313-320.

[8] MEI Y Z,LIU R X,WANG D P,et al.Biocatalysis and biotransformation of resveratrol in microorganisms[J].Biotechnology Letters,2015,37(1):9-18.

[9] 周林芳, 江波,张涛,等.糖苷水解酶第3家族β-葡萄糖苷酶的研究进展[J].食品工业科技,2017,38(14):340-345.

ZHOU L F,JIANG B,ZHANG T,et al.Research progress of β-glucosidases of glycoside hydrolase family 3[J].Science and Technology of Food Industry,2017,38(14):340-345.

[10] 刘震, 朱秋享,石贤爱,等.β-葡萄糖苷酶体外分子改造研究进展[J].福州大学学报(自然科学版),2015(4):565-571.

LIU Z,ZHU Q X,SHI X A,et al.Development in molecular modification of β-glucosidase in vitro[J].Journal of Fuzhou University (Natural Science Edition),2015(4):565-571.

[11] 张媛媛, 苏敏,朴春红,等.微生物来源的β-葡萄糖苷酶在食品工业中应用进展[J].食品工业科技,2019,40(16):329-335.

ZHANG Y Y,SU M,PIAO C H,et al.Progress on the β-glucosidase from microorganisms and its applications in food industry[J].Science and Technology of Food Industry,2019,40(16):329-335.

[12] SINGH G,VERMA A K,KUMAR V.Catalytic properties,functional attributes and industrial applications of β-glucosidases[J].3 Biotech,2016,6(1):1-14.

[13] AHMED A,NASIM F U H,BATOOL K,et al.Microbial β-glucosidase:Sources,production and applications[J].Journal of Applied & Environmental Microbiology,2017,5(1):31-46.

[14] 常治帅, 兰辉,包亚莉,等.微生物产β-葡萄糖苷酶研究进展[J].微生物前沿,2018,7(2):79-86.

CHANG Z S,LAN H,BAO Y L,et al.Progress of β-glucosidase from microorganisms[J].Advances in Microbiology,2018,7(2):79-86.

[15] 周林芳. 酶法提取虎杖中白藜芦醇及白藜芦醇酯的合成研究[D].无锡:江南大学,2019.

ZHOU L F.Study on enzymatic extraction of resveratrol from Polygonum cuspidatum and synthesis of resveratrol esters[D].Wuxi:Jiangnan University,2019.

[16] 冯薇, 胡小妍,马明娜,等.产β-葡萄糖苷酶细菌的筛选及转化白藜芦醇的研究[J].生物技术通报,2017,33(11):130-135.

FENG W,HU X Y,MA M N,et al.The screening of β-glycosidase-producing strain and the transforming of resveratrol[J].Biotechnology Bulletin,2017,33(11):130-135.

[17] ZHOU L,LI S,ZHANG T,et al.Properties of a novel polydatin-β-D-glucosidase from Aspergillus niger SK34.002 and its application in enzymatic preparation of resveratrol[J].Journal of the Science of Food & Agriculture,2016,96(7):2 588-2 595.

[18] XUE Y,ZHANG Z,HOU J,et al.Resveratrol and arctigenin production from polydatin and arctiin respectively by a thermostable β-glucosidase from Thermotoga maritima[J].Journal of Carbohydrate Chemistry,2018,37(7-8):414-430.

[19] BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Analytical Biochemistry,1976,72:248-254.

[20] 韩萍萍, 祝旭君,陈虹.微生物转化虎杖苷生成白藜芦醇的研究[J].浙江树人大学学报(自然科学版),2012,12(1):25-28.

HAN P P,ZHU X J,XHEN H.Study on the biotransformation from polydatin to resveratrol[J].Journal of Zhejiang Shuren University(Acta Scientiarum Naturalium),2012,12(1):25-28.

Enzymatic characteristics of β-glucosidase produced by endophytic fungus Aspergillus aculeatus HZ001 from Polygonum cuspidatum

YU Jie1,2,XU Qinqian1,2,LI Ziyuan1,2,LIU Hongyang1,2,HAO Zaibin1,2,LI Haiyun1,2*

1(College of Chemistry & Bioengineering,Guilin University of Technology,Guilin 541004,China) 2(Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Food Safety and Detection,Guilin University of Technology,Guilin 541004,China)

ABSTRACT Polydatin is abundant in the traditional Chinese medicine Polygonum cuspidatum, and the conversion of polydatin to resveratrol by biotransformation technology is an effective method to prepare natural resveratrol products. The cells of endophytic fungus Aspergillus aculeatus HZ001, which isolated from P. cuspidatum, can catalyze polydatin to resveratrol. The enzymatic characteristics of intracellular β-glucosidase produced by this strain were studied. The results showed that the optimum reaction temperature was 60 ℃, good stability was obtained below 60 ℃; and the optimum reaction pH was 4.8 with good stability at pH 3.6-4.0. The β-glucosidase could be activated by Fe2+ with a relative enzyme activity of 120% and significantly inhibited by Ca2+, Co2+, and Mg2+. SDS, mercaptoethanol, and dimethyl sulfoxide also inhibited the enzyme activity, and the highest inhibitory rate of 90% was obtained with EDTA. Under the optimal catalytic conditions, the kinetic parameters of the enzymatic reaction were established with the Km of 2.571 mmol/L and the Vmax of 0.594 μmol/(mL·h).

Key words Polygonum cuspidatum; endophytic fungus; Aspergillus aculeatus; β-glucosidase; enzymatic characteristics

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.025689

引用格式:于洁,徐勤茜,李子院,等.虎杖内生真菌Aspergillus aculeatus HZ001产β-葡萄糖苷酶的酶学特性[J].食品与发酵工业,2021,47(3):31-35.YU Jie,XU Qinqian,LI Ziyuan,et al.Enzymatic characteristics of β-glucosidase produced by endophytic fungus Aspergillus aculeatus HZ001 from Polygonum cuspidatum[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(3):31-35.

第一作者:硕士研究生(李海云教授为通讯作者,E-mail:xglihaiyun@126.com)

基金项目:国家自然科学基金项目(31460409);广西自然科学基金项目(2016GXNSFAA380014);广西科技基地和人才专项项目(桂科AD18050004);广西壮族自治区特聘专家项目(农产品精深加工关键技术与质量安全,厅发[2018]39)

收稿日期:2020-09-22,改回日期:2020-10-19