柠檬又名柠果、益母果等，为芸香科柑橘属植物，其果汁富含糖类、维生素、多种矿物质及微量元素等，具有美白、开胃、解暑、降低心血管疾病等功能。柠檬的清香可以起到提神的作用[1-2]。椰子属棕榈科椰子属，一种热带作物。椰汁是椰果果实腔内的天然汁水，含有丰富的碳水化合物、VC、VB族、多种矿物质元素(主要组分为K)，可以增强肝肾、促进血液循环等[3-4]。
固相微萃取(solid-phase micro-extraction，SPME)技术是20世纪90年代兴起的一项样品前处理技术，其中顶空固相微萃取具有操作简单、高效、灵敏度高等优点[5]，近年来SPME与气相色谱质谱联用被广泛用于食品香气组分的检测[6]，如李建勋等[7]使用顶空固相微萃取-气质联用法(HS-SPME-GC-MS)检测3种典型黑茶的香气成分，发现普洱茶和六堡茶的香气相近，富含甲氧基苯类物质，安化黑茶中富含酯类物质，具有花果香；李大雷等[8]利用电子鼻区分3种普洱茶，并用HS-SPME-GC-MS进行香气成分分析，得出了3种普洱茶香气差异的物质主要是(E)-2-辛烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛和壬醛等；李凯等[9]采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术与气相色谱-闻香法(gas chromatography olfactometry,GC-O)中时间强度法和香气活度值(odor activity value，OAV)相结合的方法，分析红心火龙果果酒中特征香气物质；周琦等[10]采用HS-SPME-GC-MS检测柑橘汁中香气物质，并用主成分分析进行比较，确定了29种特征香气；ZHANG等[11]通过SPME与气相色谱、质谱联用检测不同加工方式中芒果汁的香气成分并通过主成分分析不同加工方式对果汁香气的影响。
本实验以柠檬汁和椰汁为原料，进行一定比例的混合发酵。并用HS-SPME-GC-MS分析椰汁、椰子发酵酒、柠檬汁、柠檬发酵酒、柠檬椰子混合果酒(柠檬汁与椰汁体积比为1∶3和1∶7.5)的香气组成，利用主成分分析进行香气的特征分析，为进一步研究柠檬椰子复合型果酒的香气提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
食品级果胶酶，河南万邦实业有限公司生产；葡萄酒-果酒专用酵母SY，安琪酵母股份有限公司生产；柠檬，四川满多多农业有限公司；椰子，广东乐果鲜农业科技有限公司；白砂糖，北京糖业烟酒集团有限公司；GC—7890气质联用仪，安捷伦科技有限公司。
1.2 柠檬椰子复合果酒生产流程[12-13]
柠檬汁的制取：
柠檬→去皮、去核→软压取汁→柠檬汁
椰汁的制取：
椰子→破椰壳→取汁→过滤→椰汁
混合果汁发酵：
柠檬汁、椰汁混合→调配→接种→发酵→倒罐陈酿→装瓶
1.3 操作步骤[14-15]
1.3.1 柠檬的选择和处理
选取无损坏的新鲜柠檬洗净，削皮后去核，将柠檬果肉进行软压取汁，并用纱布过滤待用。
1.3.2 椰汁的制备
选取成熟的椰子，用开椰器破壳收集椰汁，并用100目滤布过滤待用。
1.3.3 成分调整
将获得的柠檬汁与椰汁按照1∶1、1∶2.5、1∶3、1∶5、1∶7.5、1∶10体积比混合，添加1 mL/L亚硫酸和2 g/L的果胶酶酶解8～12 h。酶解后分离上清液，用白砂糖调整糖含量至200 g/L。
1.3.4 接种酵母
酵母的添加量为0.2 g/L。称取适量的活性干酵母，在38 ℃的恒温水浴锅中活化20 min。加入果汁后轻轻搅拌。
1.3.5 发酵
将混合果汁放置恒温培养箱中，温度控制在17 ℃，发酵时间为11 d左右，还原糖含量低于4 g/L以下。
1.3.6 倒罐澄清
待发酵结束后，将上清液与沉淀分离，倒入新罐中满罐陈酿，澄清处理后装瓶保存。
1.4 相关指标检测
柠檬椰子复合果酒糖度、酸度测定和感官评价的方法，参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。
1.5 HS-SPME-GC-MS
分别吸取8 mL不同酒样放于20 mL顶空瓶，加入3 g NaCl，置于恒温磁力搅拌加热平台上。45 ℃预热酒样10 min，将萃取头伸入顶空部分，于45 ℃下吸附40 min后拔出，插入气相色谱进样口，于230 ℃热解析3 min。
色谱条件：DB-WAX毛细管色谱柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)；载气为高纯度氦气；流速为1 mL/min；进样口温度为230 ℃；手动无分流进样；升温程序：起始柱温35 ℃，保持3 min，以6 ℃/min的速率升温到150 ℃，保持1 min，再以12 ℃/min的速率升温到230 ℃，保持3 min；质谱条件：电子轰击离子源(EI)；电子能量70 eV；扫描质量20～550 u；离子源温度230 ℃；接口温度230 ℃
顶空针吸取酒样气体所使用的色谱柱信息Agilent 112-1334UI：采用EI电离源，电子能量为70 eV，扫描范围45～500 amu，质谱接口温度280 ℃，离子源温度230 ℃。载气为He，流速1 mL/min。程序升温条件：后运行温度85 ℃，以8 ℃/min速率升温至100 ℃，并保持5 min。以12 ℃/min的速率升至220 ℃，保持 5 min。
1.6 数据分析
本实验的数据采用Chromeleon 7.2.7.10369对物质进行定量和定性分析，SPSS 18.0进行主成分分析和Microsoft office Excel 2016进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 混合发酵酒的感官品评
将柠檬汁与椰汁按照1∶1、1∶2.5、1∶3、1∶5、1∶7.5、1∶10体积比混合，补糖至200 g/L，在17 ℃下发酵11 d，对发酵结束的复合型果酒进行感官评价，按照评分标准进行打分，结果如表1所示。
表1 不同比例发酵酒的感官评分
Table 1 Sensory scores of fermented liquor in different proportions
混合体积比可滴定酸/(g·L-1)残糖/(g·L-1)感官评分/分感官描述色泽香气滋味1∶133.41.675淡黄色果香味和酒香味良好,柠檬香气浓郁,椰香不明显味道较酸,口感干净,回味时间短1∶2.520.51.477淡黄色果香味和酒香味良好,柠檬香气浓郁,椰香不明显味道较酸,口感干净,回味时间短1∶317.51.684淡黄色香气平衡感较好,柠檬味略重,气味清爽味道微酸,酒体均匀1∶511.81.294略显黄色香气舒适,柠檬香与椰香较为协调口感柔和,回味绵延,酒体层次感好,风格独特1∶7.58.30.885近似无色,色泽透亮椰香较浓、纯正,柠檬味较淡酸度略低,回味有明显的椰香,酒体丰满1∶106.50.667近似无色,色泽透亮椰香浓郁,柠檬香气不明显,有令人不愉快的气味口感较差,有异味
经过感官特点综合分析，其中柠檬汁与椰汁体积比1∶1的发酵酒，其柠檬果香和发酵香气浓郁，口感爽净，酸度较高，适合用做调配酒基酒；混合体积比1∶3和1∶5的发酵酒，柠檬果香和椰香较协调平衡，搭配均衡，其中1∶3体积比发酵酒口感酸度较高，适合调整工艺，酿造甜型果酒；1∶5体积比发酵酒柠檬果香和椰香均衡，香气细致优雅，酸感稍重，适合酿造半甜型或半干型果酒；1∶7.5体积比发酵酒果香细致，柠檬香优雅，椰香突出，口感爽净平衡协调，适合酿造干型果酒。
2.2 柠檬汁、椰汁与酒样中香气成分的HS-SPME-GC-MS检测分析
样品中共检测出157种物质，其中酯类48种、醇类42种、萜烯类14种、酸类12种、烷类12种、醛酮类8种、苯类5种、酚类4种和其他类12种，柠檬汁、柠檬发酵酒、椰汁、椰子发酵酒、1∶3 混合发酵和1∶7.5混合发酵中共检测出39、53、58、57、65和64种物质，总的相对含量为69.53%、61.28%、91.4%、82.88%、70.17%和81.36%，如表2所示。
表2 HS-SPME-GC-MS香气物质分析结果 单位：%
Table 2 Analysis result of HS-SPME-GC-MS aroma substances
香气物质相对含量柠檬汁柠檬酒椰子酒椰汁1∶3体积比混合1∶7.5体积比混合正十五烷0.02-----正十六烷0.01-----乙氧基三乙基硅烷---0.08--硝基乙烷--0.01---十四烷0.04-----十四甲基七硅氧烷-0.010.020.030.020.01十二甲基二氢六硅氧烷-0.020.11---六甲基环三硅氧烷-0.080.130.27--甲基硅烷--0.59---八甲基环四硅氧烷0.060.170.1 0.620.070.072,4-二甲基-1,3-二氧杂环己烷-----0.011,1-二乙氧基乙烷----3.317正己酸乙酯-2.476.412.211.321.25月桂酸乙酯0.030.240.080.450.040.04异戊酸乙酯-0.07--0.01-异丁酸乙酯--0.01---乙酸异戊酯-0.330.4 1.060.160.12乙酸异丁酯-0.04-0.1 0.030.02乙酸香叶酯-----0.03乙酸苯乙酯--0.02---亚麻酸乙酯0.01-----辛酸异戊酯--0.160.080.20.46辛酸异丁酯--0.04--0.18辛酸乙酯-7.1126.39 20.37 10.2716.97 辛酸甲酯---0.04--辛酸丙酯-----0.13十四酸乙酯0.010.050.020.04--十六酸乙酯0.040.040.120.3 0.020.01十八酸乙酯--0.01---乳酸異丁酯-----0.1乳酸乙酯-0.070.03-0.05-壬酸异戊酯-----0.01壬酸乙酯0.020.260.240.330.330.79甲酸辛酯----0.08-甲酸庚酯--0.2 0.150.070.07己酸异丁酯--0.01---癸酸异戊酯--0.010.010.010.02癸酸乙酯0.021.491.823.260.751.23庚酸乙酯--0.16---对甲氧基肉桂酸异辛酯--0.01---对甲氧基肉桂酸辛酯--0.02---丁位辛内酯---0.07-0.01丁位十一内酯----0.02-丁位十二内酯---0.030.01-丁位癸内酯-----0.02
续表2
香气物质相对含量柠檬汁柠檬酒椰子酒椰汁1∶3体积比混合1∶7.5体积比混合丁酸乙酯-0.140.20.260.060.05丁二酸二乙酯-2.850.5---丙酮酸乙酯-----0.02丙酸乙酯-0.160.36---丙二酸二乙酯-0.01----苯乙酸乙酯--0.01--0.03苯甲酸乙酯-1.530.01-1.070.5L(-)-乳酸乙酯---0.7--γ-丁内酯-0.08--0.02-DL-2-羟基-4-甲基戊酸乙酯---0.05--9-十六碳烯酸乙酯--0.010.03--2-糠酸乙酯-0.01----2-甲基丁酸乙酯-0.060.07-0.010.012-甲基丁基乙酸酯-0.060.090.20.030.02(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇乙酸酯0.11-----正己醇0.01--0.280.020.02异戊醇0.5 12.2938.812.44 10.87 17.74异胡薄荷醇----0.14-乙醇--0.99---香叶醇0.13--0.15--香茅醇--0.04-6.33-十一醇---0.21--十二醇---0.08--合成右旋龙脑2.36-----金合欢醇---0.01--红没药醇0.02---0.030.01芳樟醇0.730.15-0.431.151.61反-2-十一烯醇-0.01----橙花醇----0.16-苯乙醇--4.260.78-4.29桉叶油醇1.430.62-0.190.290.09S-(-)-2-甲基-1-丁醇0.16-7.34---4-萜烯醇---0.17--4-甲基-1-己醇0.01-----3-戊烯-2-醇0.02-----3-甲硫基丙醇--0.02---3-甲基-2-丁烯-1-醇---0.1--3-甲基-1-戊醇-----0.022-乙基己醇--0.050.650.050.052-戊醇---0.01--2-十一醇---0.08--2-十三醇---0.09--2-壬酮--0.050.290.020.022-壬基醇--0.041.48--2-甲基丁醇-1.94--2.314.242-茨醇-1.64--0.840.352,3-丁二醇---1.07-0.291-异丙氧基-2-丙醇-----0.041-壬醇--0.010.02--1-对孟烯-6,8-二醇----0.26-1,2,3-丁三醇-0.02----(S)-(+)-2-庚醇---0.26--(R)-3,7-二甲基-6-辛烯醇-0.38---7.14(2S,3S)-(+)-2,3-丁二醇-0.8 0.0713.460.040.04(2R,3R)-(-)-2,3-丁二醇-0.12--0.27-
续表2
香气物质相对含量柠檬汁柠檬酒椰子酒椰汁1∶3体积比混合1∶7.5体积比混合(+)-α-松油醇19.9412.24 -0.3115.47 8.56(-)-4-萜品醇17.176.37--8.815.28正癸酸--0.030.730.020.02月桂酸---0.07--硬脂酸--0.01---异戊酸--0.030.08--辛酸--0.744.690.760.72酮丙二酸----0.07-己酸-0.060.321.140.180.17L-乳酸---4.1 --L-高胱氨酸--0.01---2-辛烯酸--0.01---2-羟基十四烷酸-----0.01(E)-11-二十烯酸----0.02-莰烯0.020.01--0.020.01蒎烯-1.47--0.940.23萜品油烯----1.8 0.52月桂烯----0.040.03反式石竹烯0.26-----苯乙烯---0.02--阿斯利多-0.08----γ-萜品烯,松油烯1.221.37--0.490.123-蒈烯-----0.042-蒎烯0.02-----2-蒈烯0.07---0.08-1-甲基-1,4-环己二烯0.060.02----(+)-柠檬烯4.010.82---0.29巴伦西亚橘烯0.22---0.04-邻-异丙基苯0.470.4--0.110.03丁苯----0.11-2-乙基对二甲苯----0.03-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)苯-0.04----1,2,4,5-四甲苯-0.14----左旋樟脑0.360.07-0.020.070.04邻甲基苯乙酮0.33-----香芹酮0.12-----5-甲基-2-己酮----0.01-3-羟基-2-丁酮---8.360.13-苯乙醛0.01-----苯甲醛-----0.013-糠醛-0.02----4-乙烯基-2-甲氧基苯酚----0.02-4-乙基苯酚9.44-----4-乙基-2-甲氧基苯酚7.15---0.050.012,4-二叔丁基苯酚--0.020.10.020.021,2,3,4-四氢-1,1,6-三甲基萘-----0.06四氢-4-甲基-2-(2-甲基-1-丙烯基)-2H-吡喃-0.02----(2S-顺)-四氢化-4-甲基-2-(2-甲基-1-丙烯基)-2H-吡喃-0.03----甲酰胺--0.01---对二甲酚酞--0.01---乙酐-0.01----4-羟基丁酸肼----0.04-4,4'-二氯二苯砜--0.07---2,6-二叔丁基苯醌--0.10.230.050.0315-冠醚-5---0.04--1,4-桉叶素2.922.77----1,3-丙二醇单乙醚-0.02--0.050.03合计69.53 61.28 91.482.8870.17 81.36
注：-表示未检出或小于0.01
所有样品中醇类的相对含量最高，是构成香气的主要成分。在椰汁和酒样中酯类的含量仅次于醇类，对香气形成起着重要的作用，酯类物质大多具有浓郁的果香[16]，对酒的香气具有较大的影响[17]。酮类物质在椰汁中占一定的比例，经过发酵后在酒的香气物质中未检测出。萜烯类物质是柠檬果香中的主要成分[18]，具有果香、花香、种子以及根茎等香气[19]，使酒具有柠檬独特的清香。而酸类、烷类、醛酮类、苯类、酚类和其他类检测含量较低，对酒的香气起着重要的修饰作用，如图1所示。
图1 各类香气物质的总量
Fig.1 The total amount of various aromatic substances
2.3 主成分分析
用SPSS软件对表2的数据进行分析，由表3得出,主成分分析得到5个主成分，其中第1主成分～第5主成分的贡献分别为32.354%、21.022%、18.446%、15.543%、12.615%。
表3 主成分分析中解释的总方差
Table 3 The total variance explained in PCA
成分初始特征值旋转平方和载入合计方差的/%累积/%合计方差的/%累积 /%151.12032.35432.35449.40431.26831.268233.21521.02253.37632.78820.75252.020329.17718.46671.84228.78818.22070.241424.55815.54387.38523.99215.18585.425519.93112.615100.00023.02814.575100.00063.28E-152.08E-15100
表4中的成分矩阵表明，因子载荷量>0.750的物质共有89种，在第1主成分中有47种，其中有45种在椰子类的样品种检测出，有24种在含柠檬的酒样品中测出，在柠檬汁中只检测出5种，但其中(-)-4-萜品醇和(+)-α-松油醇占柠檬汁香气物质总含量的24.28%，而在椰汁中只占0.31%，且未在椰子酒中检测出；第2主成分中共有4种，均在椰子和柠檬香气中检测出；而在第3主成分中共有6种，在含柠檬的酒样品中均检测出，在椰子和柠檬中各检测出2种；第4主成分中有17种均在含柠檬的酒样品中检测出，其他样品中未检测出；第5主成分中共有13种，同第4主成分，只在含柠檬的酒样品中检测出。由此推出第1主成分主要是由椰子香、柠檬香和发酵香共同组成，以柠檬香为主导，椰香和发酵香为辅，第2主成分则由柠檬与椰子香气共同组成，第3主成分为混合香气，以发酵香主导，果香为辅，第4和第5主成分主要是柠檬汁发酵产生的独特香气。其主成分的分布见图2。
图2 旋转空间中的成分图
Fig.2 A composition diagram in rotation space
表4 成分矩阵
Table 4 Component matrix
变量成分12345异戊酸0.9819-十六碳烯酸乙酯0.980己酸0.9782-甲基丁基乙酸酯0.9782,6-二叔丁基苯醌0.975乙酸异戊酯0.9731-壬醇0.973十六酸乙酯0.9622-壬酮0.960癸酸乙酯0.955六甲基环三硅氧烷0.9542,4-二叔丁基苯酚0.945辛酸0.9442-乙基己醇0.933正癸酸0.9262-壬基醇0.922八甲基环四硅氧烷0.916十二醇0.9132-戊醇0.913月桂酸0.9133-甲基-2-丁烯-1-醇0.913苯乙烯0.9132-十一醇0.913辛酸甲酯0.913十一醇0.913DL-2-羟基-4-甲基戊酸乙酯0.913乙氧基三乙基硅烷0.913金合欢醇0.9134-萜烯醇0.9132-十三醇0.913(S)-(+)-2-庚醇0.913L(-)-乳酸乙酯0.913L-乳酸0.91315-冠醚-50.9133-羟基-2-丁酮0.912(2S,3S)-(+)-2,3-丁二醇0.912丁位辛内酯0.907
续表4
变量成分12345正己醇0.896丁酸乙酯0.8942,3-丁二醇0.885十四甲基七硅氧烷0.848(+)-α-松油醇-0.838丁位十二内酯0.835月桂酸乙酯0.832莰烯-0.816乙酸异丁酯0.789(-)-4-萜品醇-0.775异戊醇-0.881苯乙醇-0.831香叶醇0.799桉叶油醇0.780芳樟醇0.8842,4,5-三甲基-1,3-二氧戊环0.8431,1-二乙氧基乙烷0.829月桂烯0.796丙酸乙酯-0.771壬酸乙酯0.7512-甲基丁醇0.751蒎烯0.9132-茨醇0.898γ-丁内酯0.893乳酸乙酯0.879苯甲酸乙酯0.868异戊酸乙酯0.858乙酐0.796(2S-顺)-四氢化-4-甲基-2-(2-甲基-1-丙烯基)-2H-吡喃0.7962-糠酸乙酯0.7961,2,4,5-四甲苯0.796丙二酸二乙酯0.796反-2-十一烯醇0.7963-糠醛0.796四氢-4-甲基-2-(2-甲基-1-丙烯基)-2H-吡喃0.7961-甲基-4-(1-甲基乙烯基)苯0.7961,2,3-丁三醇0.796阿斯利多0.796丁二酸二乙酯0.771香茅醇0.816异胡薄荷醇0.814酮丙二酸0.814甲酸辛酯0.8144-乙烯基-2-甲氧基苯酚0.814(E)-11-二十烯酸0.8141-对孟烯-6,8-二醇0.814丁苯0.814丁位十一内酯0.8145-甲基-2-己酮0.8142-乙基对二甲苯0.814橙花醇0.8144-羟基丁酸肼0.814
主成分分析得到的5个主成分为4类香气，其中第1主成分为一类香气，为混合香，主要是柠檬香气；第2主成分为二类香气，主要是柠檬与椰子的果香；第3主成分为混合香气，主要是发酵香；第4和第5主成分为柠檬发酵香。
如表5所示，一类香气在1∶3和1∶7.5混合体积比中占比分别为26.79%和17.31%，但其中(-)-4-萜品醇和(+)-α-松油醇占比之和为24.28%和13.84%，二者主要存在于柠檬汁香气中，其中4-萜品醇主要存在于柑橘类的果皮香气中[20]，α-松油醇是柠檬烯的降解产物[21]，具有果香和木香气味。二类香气中异戊醇的含量分别为10.87%和17.74%，是二类香气的主体，主要存在于椰汁中，所以二类香气是以椰香为主的果香，异戊醇具有苹果白兰地香气和辛辣味，当含量过高时会有令人不愉快的气味。三类香气主要是1,1-二乙氧基乙烷、2-甲基丁醇、芳樟醇和壬酸乙酯，其两者为发酵香，后两者存在于果汁中，但经过发酵后占比略有增加。四类香气为柠檬发酵产生的独特香气，其中第4主成分主要存在于1∶3体积比混合发酵中，主要香气物质为2-茨醇、苯甲酸乙酯和蒎烯，第5成分只存在于1∶3体积比混合发酵中，主要香气物质为香茅醇和异胡薄荷醇。
表5 各类香气物质占比
Table 4 Proportion of various aroma substances
香气类别1∶3体积比混合/%1∶7.5体积比混合/%一类香气26.7917.31二类香气11.1622.12三类香气7.313.67四类香气10.221.08总计55.4754.18
3 结论
本文以柠檬汁与椰汁为原料，进行混合比例的发酵。通过感官评价得出，将2种果汁混合，补糖至200 g/L，温度为17 ℃，发酵11 d，体积比为1∶1的混合果酒口感清爽，体积比为1∶5的发酵酒香气协调，口感柔和，具有独特的风格。通过HS-SPME-GC-MS法检测出柠檬汁、柠檬酒、椰汁、椰子酒和体积比1∶3、1∶7.5混合发酵酒的香气物质，使用主成分分析法得到4类香气：以柠檬香为主的混合香气、以椰香为主的果香、混合香气和柠檬的发酵香。柠檬椰子复合果酒的特征香气为(-)-4-萜品醇、(+)-α-松油醇、异戊醇、1,1-二乙氧基乙烷、2-甲基丁醇、芳樟醇、壬酸乙酯、2-茨醇、苯甲酸乙酯和蒎烯。这些香气使柠檬椰子复合果酒具有独特的风味。
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