食用植物酵素(edible plant Jiaosu)是以一种或多种新鲜蔬菜、水果和谷豆类、海藻类、食药两用本草类等食材为原料，经长时间有益菌发酵而产生的功能性微生物发酵产品，具有丰富的活性成分、益生菌及次生代谢产物等。研究表明该类产品不仅具有抗氧化、抗炎的作用，而且具有增强机体免疫能力及抗癌等多种保健功能[1-4]。

酵母菌是一类以芽殖为主的单细胞真核微生物，在自然界分布广泛，主要生活在偏糖和偏酸环境中，广泛应用于发酵工业中。在葡萄酒工业中酿酒酵母的最适pH值通常在3.0～3.6[5]，在酵素发酵过程中其发酵液具有高糖低pH的特点。所以酵母菌耐受性的强弱直接影响到了产品的周期和风味[6]。从自然发酵的酵素产品中分离出酵母菌，研究其在高糖和低pH条件下的耐受性对于研究酵素的发酵机理、功能成分、产品生产、饮料及发酵产品的开发、生产、质量控制等方面具有重要意义。

本研究从茶叶酵素，乌饭树叶酵素，铁皮石斛花酵素，紫苏酵素和火龙果酵素原液中分离出7株酵母菌，通过形态学鉴定、生理生化实验及 26S rDNA 序列分析等，对筛选菌株进行菌种鉴定，通过耐高糖实验和耐低 pH 实验，对分离出菌株的耐受性进行考察，旨在为植物酵素的发酵过程研究、工业化生产提供菌种方面基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

发酵一年半的茶叶酵素、乌饭树叶酵素、铁皮石斛花酵素、火龙果酵素和紫苏酵素原液，由浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室提供。

酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、溴钾酚紫、海藻糖、甘露糖、果糖、棉子糖、可溶性淀粉、半乳糖、鼠李糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；固蓝B、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、NaCl，国药集团化学试剂有限公司(上海，中国)；氮源基础培养基和碳源基础培养基，美国BD公司。

MB-150CL恒温恒湿培养箱，青岛明博环保科技有限公司；SW-CJ超净工作台，无锡易纯净化设备有限公司；TS-2102C小型立式恒温摇床，上海天呈实验仪器制造有限公司；SMART光学显微镜，重庆奥特光学仪器有限公司；Allegra X-12R冷冻离心机，美国贝克曼库尔特有限公司；Spectra Max 190酶标仪，美国Molecular Devices公司。

1.2 培养基的配制

YEPD培养基：酵母浸出粉1 g，蛋白胨2 g，葡萄糖2 g，纯水100 mL，pH 6.0，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。

糖发酵培养基：蛋白胨1 g，水100 mL，16 g/L溴甲酚紫乙醇溶液0.2 mL，pH 7.6，20 g 碳源(海藻糖、甘露糖、果糖、棉子糖、可溶性淀粉、半乳糖、鼠李糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖)，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。

无维生素培养基：葡萄糖2 g，(NH4)2SO4 0.5 g，KH2PO4 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，CaCl2·2H2O 0.01 g，NaCl 0.01 g，加水至100 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min[7]。

300、450、600、750、900 g/L高糖培养基的配制：酵母浸粉1 g，蛋白胨2 g，分别加入葡萄糖30、45、60、75、90 g，水定容至100 mL，pH 5.0，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。

低pH培养基：酵母浸出粉1 g，蛋白胨2 g，葡萄糖2 g，水100 mL，分别调pH至1.5、2.0、2.5、3.0、3.5后，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种的分离纯化

吸取茶叶酵素、乌饭树叶酵素、火龙果酵素、紫苏酵素、铁皮石斛花酵素原液，用梯度稀释法稀释后涂布于YEPD培养基上进行培养，用划线分离法将酵母菌分离纯化至单菌落，直至在显微镜下观察到纯菌株为止，将纯化好的菌株于斜面低温冷藏保存。

1.3.2 形态培养特征观察

将单菌落接种到YEPD固体、液体培养基中于28 ℃培养48 h，观察菌落大小、颜色，菌落凹凸程度，菌落的质地，记录菌体所在位置，有无菌醭、沉淀、浑浊，并于光学显微镜1 000倍油镜下观察其菌体形态、形状、繁殖方式并且测量其菌体大小。

1.3.3 生理生化特征鉴定

酵母菌生理生化特征鉴定:依据《酵母菌的特征及鉴定手册》和《微生物学实验手册》设计，主要包括：糖发酵鉴定[8]、碳源同化实验[9]、氮源同化实验[10]、无维生素培养基上的生长实验、耐高渗透压的测试、产生类淀粉化合物测定、单宁分解利用实验[11]、脲酶实验[12]、重氮基蓝B实验[13]等。

1.3.4 分子生物学鉴定

1.3.4.1 26S rDNA 序列测定

在上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.3.4.2 同源性分析与系统发育树的构建

根据测序结果，从https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/[14]中选择DNA数据库进行同源序列搜索(basic local alignment search tool)，匹配得到与供试菌菌株的序列相似的已知菌株的序列。根据同源序列搜索结果，使用bio-edit软件将供试菌序列和已知菌株序列进行多序列对位排列，并采用MEGA 7.0软件中Neighbour-Joining方法[15]构建系统发育树。

1.3.5 耐受性试验

1.3.5.1 高糖耐受性试验

将菌种在液体YEPD培养基中活化12～16 h，制成106 CFU/mL的菌悬液，按3%的接种量，分别接种于起始葡萄糖质量浓度为300、450、600、750、900 g/L的YEPD液体培养基中，pH 5.0，于28 ℃，150 r/min 条件下培养5 d，每12 h取1次样，将样品于10 000 r/min 4 ℃离心10 min，弃上清液，用无菌水重悬沉淀旋涡混匀后测定OD600，每个浓度重复 3 次。

1.3.5.2 低pH耐受性试验

将菌种在液体YEPD培养基中活化12～16 h，制成106 CFU/mL的菌悬液，按3%接种量接种于pH值为3.5、3.0、2.5、2.0、1.5的YEPD 液体培养基中[16]。于28 ℃，150 r/min培养5 d，每12 h取1次样，将样品于10 000 r/min 4 ℃离心10 min，弃上清液，用无菌水重悬沉淀旋涡混匀后测定OD600，每个浓度重复3次。

1.3.5.3 数据分析

对于得到的OD600 使用Microsoft Office Excel 2010处理，结果表示为Mean±SD形式。

2 结果与分析

2.1 分离纯化、形态及培养特征观察

从高糖、低 pH 的发酵液中，筛选具有典型酵母菌特征的菌落，通过形态学观察和显微镜检，从茶叶酵素中分离到2株菌Y1、Y2，从铁皮石斛花酵素中分离到1株菌Y3，从乌饭树叶中分离到2株菌Y4、Y5，从紫苏酵素中分离到1株菌Y6，从火龙果酵素中分离出1株菌Y7。7 株供试菌在固体、液体培养基上的菌落形态见表1，显微镜检图片如图1所示。初步表明该菌株符合酵母菌细胞形态特征。

2.2 菌株鉴定结果

2.2.1 菌株的生理生化特征

7株菌的生理生化特征见表2。综合上述生理生化实验结果，根据《酵母菌的特征鉴定手册》和《真菌鉴定手册》，初步判断Y1、Y2、Y3、Y5属于接合酵母属，Y4、Y6属于酵母属，Y7属于毕赤酵母属。

2.2.2 分子生物学鉴定

利用NL-1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAA AG-3′)和NL-4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)一对引物扩增7株供试菌26S rDNA近5′端的D1/D2 区域，得到约590～1 420 bp片段，供试菌的26S rDNA D1/D2区电泳结果见图2。

7株菌序列结果在GenBank数据库进行比对，结果显示Y1、Y2、Y3与鲁氏接合酵母的同源相似性均高于99%，Y4、Y6与酿酒酵母的同源相似性均高于99%，Y5与二孢接合酵母的同源相似性高于99%，Y7与异常威克汉姆酵母的同源相似性高于99%。同源菌株基因用MEGA7软件处理得到系统进化树，如图3所示。

从图3可以看出，Y1、Y2和Y3与鲁氏接合酵母形成一个分支，验证可信度达到100%，Y4、Y6与酿酒酵母形成一个分支，验证可信度达100%，Y5与二孢接合酵母形成一个分支，验证可信度达100%，Y7与异常威克汉姆酵母形成一个分支，验证可信度达100%，初步确定Y1、Y2、Y3是鲁氏接合酵母，Y4、Y6是酿酒酵母，Y5是二孢接合酵母，Y7是异常威克汉姆酵母。

2.3 耐受性试验

2.3.1 高糖耐受性试验

Y1～Y7七株菌的高糖耐受性试验如表3所示，7株菌的生长趋势基本符合微生物的生长曲线，随着葡萄糖浓度的增大，7株菌的延滞期不断延长且7株菌均不能在900 g/L葡萄糖培养基中生长。Y1～Y7分别在经过了60、48、72、84、72、60 h的延滞期后，可在750 g/L葡萄糖培养基中生长。Y4仅能在经过了24 h的延滞期后，可在450 g/L葡萄糖培养基中生长。

WANG等[17]考察了高糖环境对鲁氏接合酵母生长的影响，发现随着糖含量的增加，鲁氏接合酵母的生长速率降低，培养基中菌体浓度也降低，表明菌种的生长受到抑制；YALÇIN等[18]研究表明，酿酒酵母可以在20～300 g/L高糖环境下生长，初始糖浓度越高，酿酒酵母的干重越低，表明菌种的生长受到抑制程度越高；李梦琦等[19]的研究表明400 g/L葡萄糖对鲁氏接合酵母的生长产生了一定的抑制作用。

2.3.2 低pH耐受性试验

Y1～Y7七株菌的低pH耐受性试验如表4所示，7株菌整体基本符合微生物的生长曲线，随着pH的降低，7株菌的延滞期不断延长，且仅Y6、Y7在经过了96、84 h的延滞期后能在pH 1.5的培养基中生长。Y1、Y2分别在经过了36、12 h的延滞期后，可在pH 2.5的培养基中生长。Y3、Y4、Y5仅能在经过12 h 的延滞期后，在pH 3.0的培养基中生长。

YAN等[20]发现随着培养基酸度的增加，酿酒酵母的生物量越低；AKINORI等[21]研究表明，培养基pH<2.5，pH越低酿酒酵母的生长受抑制程度越高，其延滞期越长；章之柱等[22]研究表明pH<3.5时，pH对菌株生长影响较大，与本研究结果基本一致。

3 结论

从茶叶酵素中筛选到2株菌Y1、Y2；从铁皮石斛花酵素中筛选到1株菌Y3；从乌饭树叶中筛选到2株菌Y4、Y5；从紫苏酵素中筛选到1株菌Y6；从火龙果酵素中筛选出1株菌Y7。Y1、Y2、Y3与鲁氏接合酵母的同源相似性均高于99%；Y4、Y6与酿酒酵母的同源相似性均高于99%；Y5与二孢接合酵母的同源相似性高于99%；Y7与异常威克汉姆酵母的同源相似性高于99%。Y1、Y2、Y3、Y5的最高耐受初始葡萄糖质量浓度为750 g/L，Y4最高耐受初始葡萄糖质量浓度为450 g/L，Y6、Y7的最高耐受初始葡萄糖质量浓度为600 g/L；初始葡萄糖含量越高，酵母菌的延滞期越长，酵母菌生长受到抑制程度越高，所有菌株均不能在初始葡萄糖质量浓度为900 g/L时生长。Y1、Y2的最低耐受初始pH值为2.5，Y3、Y4、Y5的最低耐受初始pH值为3.0、Y6、Y7的最低耐受初始pH值为1.5，培养基初始pH越低，酵母菌延滞期越长，酵母菌生长受到抑制程度越高。

参考文献

[1] 毛建卫, 吴元锋, 方晟.微生物酵素研究进展[J].发酵科技通讯, 2010, 39(3):42-44.

MAO J W, WU Y F, FANG S.Research progress of microbial Jiaosu[J].Bulletin of fermentation science and technology, 2010, 39(3):42-44.

[2] 王珍珍, 沙如意, 蔡成岗, 等.树莓酵素中耐高渗酵母菌的分离鉴定及生长特性研究[J].食品工业科技, 2017, 38(8):178-182;188.

WANG Z Z, SHA R Y, CAI C G, et al.Screening, identification and properties of osmophilic yeast from raspberry Jiaosu during natural fermentation process[J].Science and Technology of Food Industry, 2017, 38(8):178-182;188.

[3] 张浩然, 范昊安, 顾逸菲, 等.沙棘酵素发酵过程中代谢产物及抗氧化活性研究[J].食品工业科技, 2020, 41(11):125-133.

ZHANG H R, FAN H A, GU Y F, et al.Study on metabolites and antioxidant activity of sea buckthorn Jiaosu during fermentation[J].Science and Technology of Food Industry, 2020, 41(11):125-133.

[4] 蒋增良, 毛建卫, 黄俊, 等.蓝莓酵素在天然发酵过程中抗氧化性能的变化[J].食品工业科技, 2013, 34(2):194-197;201.

JIANG Z L, MAO J W, HUANG J, et al.Changes in antioxidant activity of blueberry-ferment during natural fermentation Process[J].Science and Technology of Food Industry, 2013, 34(2):194-197;201.

[5] 刘增然. 工业葡萄酒酵母的适应进化和工程菌构建策略[J].食品研究与开发, 2011, 32(6):125-130.

LIU Z R.Adaptive evolution and engineering strategies of commercial Saccharomyces cerevisiae[J].Food research and development, 2011, 32(6):125-130.

[6] 田甜甜, 孙军勇, 蔡国林, 等.基于转录组学的酿酒酵母耐酸机制解析[J].食品与发酵工业, 2020, 46(6):1-7.

TIAN T T, SUN J Y, CAI G L, et al.Transcriptomic profiling reveals the acid-tolerance mechanism of Saccharomyces cerevisiae[J].Food and Fermentation Industries, 2020, 46(6):1-7.

[7] 周德庆. 微生物学实验手册[M].上海:上海科学技术出版社, 1986.

ZHOU D Q.Microbiology Experiment Manual[M].Shanghai:Shanghai Science and Technology Press, 1986.

[8] 冯炘, 何凯翔, 解玉红.葡萄中酵母菌的筛选及菌株鉴定[J].价值工程, 2020, 39(13):270-273.

FENG X, HE K X, XIE Y H.Screening and identification of yeasts in grapes[J].Value Engineering, 2020, 39(13):270-273.

[9] CAMARGO J Z, NASCIMENTO V M, Stefanello I, et al.Biochemical evaluation, molecular characterization and identification of novel yeast strains isolated from Brazilian savannah fruits, chicken litter and a sugar and alcohol mill with biotechnological potential for biofuel and food industries[J].Biocatalysis and Agricultural Biotechnology,2018, 16:390-399.

[10] LOPES M R, LARA C A, MOURA M E F, et al.Characterisation of the diversity and physiology of cellobiose-fermenting yeasts isolated from rotting wood in Brazilian ecosystems[J].Fungal Biology, 2018, 122(7):668-676.

[11] 杨露, 张晓丽, 高迪, 等.降解石榴皮单宁菌株的筛选及鉴定[J].湖北农业科学, 2017, 56(12):2 266-2 269.

YANG L, ZHANG X L, GAO D, et al.Screening and identification of the pomegranate husk tannin-degrading strains[J].Hubei Agricultural Sciences, 2017, 56(12):2 266-2 269.

[12] 沈琼雯. 贵州喀斯特地貌土壤产脲酶细菌种群资源及其促生作用研究[D].南宁：广西大学,2019.

SHEN Q W.Research on the urease producing bacterial population resources and their promoting growth in Guizhou karst topography[D].Nanning:Guangxi University,2019.

[13] 张倩, 杨涛, 姚灿, 等.郫县豆瓣中一株耐盐酵母菌的分离鉴定及其发酵性能[J].天然产物研究与开发, 2018, 30(9):37-42;48.

ZHANG Q, YANG T, YAO C, et al.Isolation and identification of a salt-tolerant yeast in Pixian douban and its fermentation characteristics[J].Natural Product Research and Development, 2018, 30(9):37-42;48.

[14] KHIN T M, MITSUO O, AIRI O, et al.Isolation and identification of flower yeasts for the development of mixed culture to produce single-cell protein from waste milk[J/OL].Bioresource Technology Reports, 2020.DOI:10.1016/j.biteb.2020.100401.

[15] AZUSA S, TOKUMA F, SHUNTARO M, et al.Screening and isolation of the liamocin-producing yeast Aureobasidium melanogenum using xylose as the sole carbon source[J].Journal of Bioscience and Bioengineering, 2020, 129(4):428-434.

[16] 李豪, 章霞, 张静, 等.草莓果酒酵母菌的筛选、鉴定及耐受性研究[J].中国酿造, 2017, 36(2):85-88.

LI H, ZHANG X, ZHANG J, et al.Screening, identification and tolerance research of the yeasts from strawberry wine China[J].China Brewing, 2017, 36(2):85-88.

[17] WANG H X, SUN H M. Assessment of different antimicrobials to inhibit the growth of Zygosaccharomyces rouxii cocktail in concentrated apple juice[J].Food Microbiology, 2020, 91:103 549.

[18] YALÇIN S K, ÖZBAS Z Y.Effects of different substrates on growth and glycerol production kinetics of a wine yeast strain Saccharomyces cerevisiae Narince 3[J].Process Biochemistry, 2004, 39(10):1 285-1 291.

[19] 李梦琦, 赵一凡, 郑飞云, 等.耐高糖产香酵母菌的分离鉴定及其应用[J].食品与发酵工业, 2019, 45(24):45-51.

LI M Q, ZHAO Y F, ZHENG Y F, et al.Isolation, identification and application of high sugar tolerant aroma yeast[J].Food and Fermentation Industries, 2019, 45(24):45-51.

[20] YAN D J, WANG C X, ZHOU J M, et al.Construction of reductive pathway in Saccharomyces cerevisiae for effective succinic acid fermentation at low pH value[J].Bioresource Technology, 2014, 156:232-239.

[21] AKINORI M, TOSHIHIRO S, TETSUYA G, et al.Evaluation of Saccharomyces cerevisiae GAS1 with respect to its involvement in tolerance to low pH and salt stress[J].Journal of Bioscience and Bioengineering, 2017, 124(2):164-170.

[22] 章之柱, 尹金彦, 孟洋, 等.桑葚果园中酿酒酵母的分离鉴定及特性研究[J].食品与发酵工业, 2020, 46(14):148-155.

ZHANG Z Z, YIN J Y, MENG Y, et al.Isolation and characterization of Saccharomyces cerevisiae in mulberry orchard[J].Food and Fermentation Industries, 2020, 46(14):148-155.

Isolation, identification and tolerance of yeast in edible plant Jiaosu

XU Chenglong1,WANG Zhenzhen1,YU Zhan1,WANG Gaojian1,FENG Zhexiao1,SHI Wenchao1,SHA Ruyi1*,MAO Jianwei1,2*

1(School of Biological & Chemical Engineering, Zhejiang University of Science & Technology, Zhejiang Provincial Key Lab for Chem & Bio Processing Technology of Farm Product, Zhejiang Provincial Collaborative Innovation Center of Agricultural Biological Resources Biochemical Manufacturing, School of Biological and Chemical Engineering, Hangzhou 310023, China)2(Zhejiang Industry Polytechnic College, Shaoxing 312000, China)

ABSTRACT To study the yeast in edible Jiaosu and its resistance to high sugar and low pH, yeasts from perilla Jiaosu, pitaya Jiaosu, tea Jiaosu, Vaccinium bracteatum Thunb leaves Jiaosu and Dendrobium candidum flower Jiaosu were isolated and identified by morphological characteristics, physiological and biochemical indicators and 26S rDNA sequence analysis. Besides, growth characteristics were investigated under the condition of high sugar concentration and low pH. Seven strains Y1-Y7 were isolated from different Jiaosu. The identification results showed that the homology similarities between strains Y1, Y2, Y3 and Zygosaccharomyces rouxii, Y4, Y6 and Saccharomyces cerevisiae, Y5 and Zygomyces bisporus, and Y7 and Wickerhamomyces anomalus were all higher than 99%.The highest tolerable initial glucose concentrations for Y1-Y7 were 750, 750, 750, 450, 750, 600 and 600 g/L, respectively; with the lowest tolerable initial pH of 2.5, 2.5, 3.0, 3.0, 3.0, 1.5 and 1.5. All seven strains can grow under the conditions of high sugar and low pH.

Key words edible plant Jiaosu;yeast;physiological and biochemical experiments;tolerance;growth characteristics

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.025001

引用格式:徐成龙，王珍珍，余瞻，等.食用植物酵素中酵母菌的分离鉴定及耐受性研究[J].食品与发酵工业,2021,47(4):80-86.XU Chenglong,WANG Zhenzhen,YU Zhan, et al.Isolation, identification and tolerance of yeast in edible plant Jiaosu[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(4):80-86.

第一作者：硕士研究生(沙如意副教授和毛建卫教授级高工为共同通讯作者，E-mail：kevinsha_0204@163.com；zjhzmjw@163.com)

基金项目：浙江省重点研发计划项目(2017C02009)；中国博士后科学基金项目(2018M632475)；金华市农业类重大项目(2018-2-001a)；省属高校基本科研业务费专项资金项目(2019JL10)

收稿日期：2020-07-10，改回日期：2020-09-25