鲊肉粉是指将粉碎的籼米、猪肉、辣椒、盐和香辛料混匀，在微生物作用下，发酵而成的传统米肉复合制品，在我国鄂、湘、川、黔、渝等地区颇受欢迎，距今已有数千年的食用历史[1-2]。目前，鲊肉粉制作以农家传统制作方式为主，利用附着在原料表面的微生物进行发酵，无法保证产品稳定性和安全性。因此，筛选优良菌株对于鲊肉粉工业化生产、缩短发酵生产周期具有重要意义。
肉制品发酵菌种主要是乳酸菌和凝固酶阴性葡萄球菌[3]，这2类微生物与发酵肉制品的颜色、质地、风味有很大关系[4]。乳酸菌可通过降低产品的pH值而延长食品的货架期、抑制病原菌和腐败菌生长[5]、缩短发酵周期，同时还可利用碳水化合物产生有机酸，赋予发酵产品独特的酸味和口感[6]。葡萄球菌可以降解蛋白质和脂肪，形成特有的香气和风味[7-9]，还具有抑制脂肪和蛋白质氧化，延缓发酵制品酸败的作用。国内外对于葡萄球菌的研究已有诸多报道，在西式发酵香肠中木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)和肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)等是最具优势的种类[10]，而在中式发酵香肠中表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)等更具有优势[11]。此外，巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri)和沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)也是发酵肉制品中常见的种属。为了弥补单一菌株发酵的不足，通常将乳酸菌和凝固酶阴性葡萄球菌进行复配，可以使产品风味更丰富。
本研究从自然发酵鲊肉粉中筛选发酵性能优良的乳酸菌和葡萄球菌，研究葡萄球菌的安全性和耐药性、乳酸菌产酸能力和抑菌能力以及所有菌株的耐盐性、耐亚硝酸盐性等生物学特性，并通过形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析鉴定菌株，为鲊肉粉接种发酵提供优良菌株。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
1.1.1 实验原料
鲊肉粉，实验室自制；微量鉴定管，杭州滨河试剂公司；青霉素、复方新诺明、氯霉素、林可霉素、氨卡西林、卡那霉素、庆大霉素、四环素、红霉素、环丙沙星，比克曼生物科技有限公司；革兰氏染色试剂、16 g/L中性红水溶液、1 g/L甲苯胺蓝、NaCl、NaNO2等，国药集团化学试剂有限公司。
1.1.2 培养基
蛋白酶检测培养基、脂肪酶检测培养基、硝酸盐还原培养基、氨基酸脱羧酶培养基[12]；MRS琼脂培养基、MRS肉汤培养基、MSA琼脂培养基、NB肉汤培养基、DNA酶琼脂、乙酰胺肉汤、脱纤维羊血、兔血浆，青岛海博生物技术有限公司。
1.1.3 仪器设备
分析天平(BS 224 S)，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；酸度计(FE 20)，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；生化培养箱(SPX-150BⅢ)，中国泰斯特仪器有限公司；可见分光光度计(722型)，上海菁华科技仪器有限公司；单人净化工作台(SW-CJ-1D)，苏州净化设备有限公司；全自动灭菌器(Zealway GR-60DA)，武汉递热爱生物科技有限公司；荧光显微镜(Leica DM 3 000)，德国Leica 公司。
1.2 实验方法
1.2.1 菌株初筛
首先对葡萄球菌进行安全性筛选。
溶血实验：将葡萄球菌培养物接种于血平板上，37 ℃培养24 h，筛选无溶血圈的菌株。
凝固酶实验：将葡萄球菌培养物接种到兔血浆中，37 ℃培养24 h，筛选无凝固酶的菌株。
DNA酶实验：将葡萄球菌培养物接种于平板上，37 ℃培养24 h，在培养基表面滴加1 mol/L盐酸，筛选无透明环的菌株。
药敏性实验：将菌液涂布于固体培养基上，将药敏纸片放在培养基上，37 ℃培养24 h，筛选无耐药性的菌株[13]。
将筛选出的葡萄球菌和乳酸菌进行如下实验：
产黏实验：挑取单菌落进行观察，筛选不产黏的菌株。
发酵葡萄糖产气实验：滴加细菌培养物于葡萄糖产气生化管中，37 ℃培养24 h，变黄者为阳性，无变化者为阴性，筛选产酸不产气的菌株。
产氨实验：将质控菌液加入乙酰胺肉汤中，37 ℃培养24 h，滴加钠氏试剂3～5滴。呈砖红色为阳性，呈黄色为阴性，筛选不产氨的菌株。
产H2S实验：滴加细菌培养物于硫化氢生化管中，37 ℃培养24 h，变黑者为阳性，无变化者为阴性，筛选不产H2S的菌株。
过氧化氢酶实验：滴加3%(体积分数)的H2O2溶液于细菌培养物的试管中，产气泡为阳性，反之为阴性。
氨基酸脱羧酶实验：37 ℃培养接种物24 h，呈紫色者为氨基酸脱羧酶试阳性，呈黄色为阴性，同时做氨基酸脱羧酶对照试验，筛选无氨基酸脱羧酶的菌株。
1.2.2 菌株复筛
硝酸盐还原酶实验[14]：将培养物接种到培养基中，阴性仍为紫色，阳性则变成砖红色，筛选硝酸盐还原酶阳性菌株。
蛋白酶和脂肪酶水解实验：蛋白酶和脂肪酶活性实验参考赵俊仁等[15]的方法进行测定。
抑菌试验：将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌涂布在MRS培养基上，打孔器打孔，加入50 μL乳酸菌离心上清液，37 ℃培养24 h，观察抑菌圈大小。
拮抗实验：在平板上进行十字交叉划线，37 ℃培养24 h，观察菌株生长情况。
1.2.3 优良菌株的生物学特性
生长曲线和产酸能力：参考潘晓倩等[16]的方法测定菌株生长曲线及产酸能力。
葡萄球菌耐酸性测定：将菌株分别接种到pH值为4、5、6、7、8、9的NB液体培养基中，37 ℃培养24 h后测其OD600值。
菌株耐盐性测定：将菌株分别接种到含0%、2%、4%、6%、8%、10%(质量分数)NaCl的MRS、NB培养基，37 ℃培养24 h后测其OD600值。
菌株耐亚硝酸盐性测定：将菌株接种到含0、50、100、150 mg/kg NaNO2的MRS、NB培养基，37 ℃培养24 h后测其OD600值。
1.2.4 优良菌株的鉴定
形态学鉴定：观察培养基平板上的菌落形态，包括形状、大小、颜色等。
16S rDNA鉴定：采用PCR扩增方法，送至江苏金唯智有限公司测序，将测序序列与GenBank核酸序列数据库进行BLAST同源性对比分析。
1.2.5 统计分析
每个实验3次平行，用Origin 8.5软件进行数据处理，MEGA 7.0软件构建菌株的系统发育树。
2 结果与分析
2.1 菌株筛选结果
从鲊肉粉中共分离纯化出52株葡萄球菌和62株乳酸菌。首先对葡萄球菌进行安全性检测，其中溶血阴性、血浆凝固酶阴性、DNA酶阴性、不具耐药性的葡萄球菌36株。按照肉制品发酵剂筛选标准，对葡萄球菌和乳酸菌做一系列筛选实验，筛选出不产黏、不产H2S、发酵葡萄糖不产气、氨基酸脱羧酶阴性、硝酸盐还原酶阳性的菌株，最终得到2株产细菌素、抑菌效果好的乳酸菌菌株，2株具有蛋白酶和脂肪酶活力的葡萄球菌菌株，筛选得到的4株菌株的实验结果如表1所示。
表1 筛选葡萄球菌菌体形态及生理生化实验结果
Table 1 Results of mycelia morphology and
physiological biochemical test
实验项目A1C7S6S7革兰氏染色++++溶血//--血浆凝固酶//--DNA酶//--耐药性----过氧化氢酶++--产黏----产H2S----产气----氨基酸脱羧酶精氨酸----鸟氨酸----赖氨酸----抑制金黄色葡萄球菌++++//抑制沙门氏菌+++++//抑制大肠杆菌++++//硝酸盐还原++++蛋白酶--++脂肪酶--+++++抑菌++++++//与其余3株菌拮抗----
注：/,未做此实验;+,阳性;-,阴性;+数量表示性能强弱
葡萄球菌的脂肪酶和蛋白酶活性有助于发酵肉制品特殊风味的形成；发酵肉制品中的乳酸菌需要无脂肪酶和蛋白酶活性[17]，如果其具有蛋白质降解活性，则可能缩短产品的货架期，产生腐败现象[18]，而具有脂肪降解活性的乳酸菌会使产品在储存销售过程中出现酸败味[19]。实验发现，S6、S7、A1、C7之间无拮抗作用，可作为鲊肉粉发酵菌株使用，将葡萄球菌与乳酸菌复配制成复合发酵剂，来弥补单一菌种发酵的不足。
2.2 优良菌株的生物学特性
2.2.1 菌株生长及产酸情况
将筛选得到的4株菌进行培养，分析生长情况，生长曲线如图1-a所示，乳酸菌A1、C7和葡萄球菌S6、S7表现出相似的生长趋势，0～2 h内为延滞期，从2 h后进入对数生长期，在10 h后进入生长平稳期，这表明筛选得到的乳酸菌和葡萄球菌具备良好的生长特性。快速产酸是衡量乳酸菌发酵剂品质的重要指标之一。产酸速率快可缩短发酵生产周期，并使乳酸菌迅速成为优势菌群，抑制有害菌及致病菌的生长，提高产品的生物安全性[20]。由图1-b可知，2株乳酸菌产酸能力较强，24 h内pH值由5.7下降至3.6，主要是对数期产酸较多。pH值迅速降低有利于抑制腐败微生物的生长，保证肉制品品质。从生长性能和产酸速度2方面考虑，可以将乳酸菌A1和C7作为鲊肉粉的发酵菌种。
a-生长曲线；b-产酸能力
图1 菌株的生长曲线和产酸能力
Fig.1 Growth curve and acid-producing capacity of strains
2.2.2 葡萄球菌耐酸性测定
在发酵肉制品中，通常需要将乳酸菌与葡萄球菌进行复配，制成复合发酵剂。因此，筛选的葡萄球菌应具有一定的耐酸性能，适应低pH值[21]。葡萄球菌在不同酸性条件的生长情况如图2所示。
图2 不同pH值下菌株的吸光度
Fig.2 Comparison of tolerance of strains to difference pH value
随着pH值由4增加到9，2株葡萄球菌的生长能力均呈现先增加后下降，在pH值为6时生长能力最强，其OD600值均达到1.5以上，在pH值4～5，2株葡萄球菌能较好生长，说明其能适应偏酸性的发酵环境，具有作为鲊肉粉发酵剂的潜力。
2.2.3 菌株耐食盐性测定
发酵肉制品中含盐量较高，添加量一般为6%(质量分数)。食盐可以防腐、增强肉的保水力，同时也会对发酵菌株生长产生一定的影响，因此需要测试筛选菌株的耐盐性。从图3中可知，随着NaCl质量分数的增加，菌株受到了不同程度的影响，生长力下降。乳酸菌A1和C7在NaCl质量分数为6%时生长良好，在NaCl质量分数为8%时吸光值在0.1左右，生长受到抑制。葡萄球菌S6和S7在NaCl质量分数10%时也能良好的生长，说明葡萄球菌S6和S7具有较强的耐盐性。鲊肉粉中的NaCl质量分数为3%，因此，4株菌株都可以作为鲊肉粉的发酵菌株。
图3 不同盐含量下菌株的吸光度
Fig.3 Comparison of tolerance of strains to difference
concentration of NaCl
2.2.4 菌株耐亚硝酸盐性测定
亚硝酸盐可以改善发酵肉制品的色泽，一般要求用来生产肉品发酵剂的微生物可耐100 mg/kg NaNO2。从图4可以看出，随着NaNO2质量分数的升高，对乳酸菌A1和C7的生长抑制逐渐增强。在100 mg/kg时，菌株尚可良好生长，当NaNO2质量分数为150 mg/kg时，乳酸菌生长受到了严重的抑制。在0～50 mg/kg时，随着质量分数的升高，对葡萄球菌S6和S7的抑制显著增加，在50～150 mg/kg时，菌株的生长抑制变化小，这与刘夏炜[22]的研究结果一致。由此可知，4株菌株都可以作为鲊肉粉发酵菌株。
图4 不同亚硝酸盐添加量下菌株的吸光度
Fig.4 Comparison of tolerance of strains to difference
concentration of NaNO2
2.3 菌株鉴定
2.3.1 形态学特征
筛选菌株的菌落形态见表2，通过革兰氏染色，镜检结果如图5所示，乳酸菌A1、C7呈杆状，葡萄球菌S6、S7呈串状。
表2 四株菌的形态学特征
Table 2 Morphological characteristics of four strains
菌株编号菌落形态菌体形态A1乳白色,扁平,菌落较小杆菌C7边缘整齐,光滑,乳白色杆菌S6白色,不透明,凸起,光滑球菌,多葡萄状排列S7乳白色,边缘整齐,不透明,凸起球菌,多葡萄状排列
图5 菌株A1、C7、S6、S7革兰氏染色显微形态
Fig.5 Gram staining micromorphology of strains A1,C7,S6,S7
2.3.2 菌株的16S rRNA序列测定及系统进化树的构建
菌株的PCR产物凝胶电泳分析结果如图6所示，扩增出约1 500 bp的DNA片段，条带清晰，无杂带。用MEGA 7.0构建系统发育树，在GenBank中进行同源性比对，结果如图7所示。A1、C7与GenBank中植物乳杆菌的16S rDNA序列相似性达99%以上，可初步确认为植物乳杆菌。
M-Marker；Y-阴性对照；1-A1；2-C7；3-S6；4-S7
图6 提取DNA模板的PCR扩增反应图谱
Fig.6 PCR amplification response spectrum of DNA template
a-植物乳杆菌A1、C7;b-沃氏葡萄球菌S6;c-巴氏葡萄球菌S7
图7 基于16S rDNA序列的系统发育树
Fig.7 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strains
菌株S6、S7的16S rRNA分别与GenBank中沃氏葡萄球菌、巴氏葡萄球菌的16S rDNA序列相似性达99%以上，可初步确认S6为沃氏葡萄球菌，S7为巴氏葡萄球菌。
3 结论
本研究从自然发酵鲊肉粉中筛选出4株发酵性能优良的菌株，通过16S rDNA序列分析可知，2株乳酸菌均为植物乳杆菌，2株葡萄球菌分别是沃氏葡萄球菌和巴氏葡萄球菌。植物乳杆菌A1、C7产酸能力强、生长速度快，葡萄球菌S6、S7耐酸且能产生脂肪酶和蛋白酶，4株菌对食盐和亚硝酸盐均具有较好的耐受性，研究结果为鲊肉粉接种发酵提供理论支撑。后期工作将筛选得到的菌株接种到鲊肉粉中，进行鲊肉粉的混菌发酵的进一步研究。
[1] 张瑶,白娟,王承明.鲊肉粉的加工工艺研究[J].中国酿造,2017,36(10):175-180.
ZHANG Y,BAI J,WANG C M.Processing technology of fermented meat rice[J].China Brewing,2017,36(10):175-180.
[2] 张瑶,宫克,汪思佚,等.鲊肉粉发酵过程中理化指标动态变化[J].食品工业科技,2018,39(20):6-11；17.
ZHANG Y,GONG K,WANG S Y,et al.Dynamic changes of physicochemical indexs in fermented meat rice during fermentation[J].Science & Technology of Food Industry,2018,39(20):6-11；17.
[3] BUCKENHUSKES H J.Selection criteria for lactic acid bacteria to be used as starter cultures for various food commodities[J].FEMS Microbiology Reviews,1993,12(1-3):253-272.
[4] 张晓东.发酵香肠菌种的筛选及对香肠理化性质的影响[D].长沙:湖南农业大学,2017.
ZHANG X D.Screening of bacteria in fermented sausage and its effects on physical and chemical properties of fermented sausage[D].Changsha:Hunan Agricultural University,2017.
[5] LUCKE F K.Utilization of microbes to process and preserve meat[J].Meat Science,2000,56(2):105-115.
[6] 王俊钢,刘成江,李宇辉,等.发酵肉制品中风味物质研究进展[J].江苏农业科学,2014,42(9):251-253；281.
WANG J G,LIU C J,LI Y H,et al.Studies on flavor of fermented meat products[J].Jiangsu Agricultural Sciences,2014,42(9):251-253；281.
[7] ANIHOUVI V B,SAKYI-DAWSON E,AYERNOR G S,et al.Microbiological changes in naturally fermented cassava fish (Pseudotolithus sp.) for lanhouin production[J].International Journal of Food Microbiol,2007,116(2):287-291.
[8] ROSEIRO L C,SANTOS C,SOL M,et al.Proteolysis in Painho de Portalegre dry fermented sausage in relation to ripening time and salt content[J].Meat Science,2007,79(4):784-794.
[9] ZENG X F,XIA W S,JIANG Q X,et al.Chemical and microbial properties of Chinese traditional low-salt fermented whole fish product Suan yu[J].Food Control,2013,30(2):590-595.
[10] FLORES M,TOLDRA F.Microbial enzymatic activities for improved fermented meats[J].Trends in Food Science & Technology,2010,22(2):81-90.
[11] 潘晓倩,成晓瑜,张顺亮,等.不同发酵剂对北方风干香肠色泽和风味品质的改良作用[J].食品科学,2015,36(14):81-86.
PAN X Q,CHENG X Y,ZHANG S L,et al.Analysis of color and flavor improvement of different starter cultures on northern air-dried sausage[J].Food Science,2015,36(14):81-86.
[12] 林胜利.乳酸菌的筛选鉴定及其在淡水鱼糜发酵中的应用研究[D].杭州:浙江工业大学,2012.
LIN S L.Screening of lactic bacteria and its application in the fermentation of freshwater fish surimi[D].Hangzhou:Zhejiang University of Technology,2012.
[13] 朱明明.巴氏球菌TS-82产类胡萝卜素裂解酶及其催化类胡萝卜素降解机理的研究[D].杨凌:西北农林科技大学,2015.
ZHU M M.Carotenoid cleavage enzyme from Staphylococcus pasteuri TS-82 and its catalytic mechanism on carotenoids degradation[D].Yangling:Northwest A&F University,2015.
[14] 王海燕,马长伟,李平兰.传统湖南腊肉中产香葡萄球菌的筛选及鉴定[J].食品与发酵工业,2006,32(5):45-49.
WANG H Y,MA C W,LI P L.Selection and identification of aroma producing Staphylococci from Hunan traditional bacon[J].Food and Fermentation Industries,2006,32(5):45-49.
[15] 赵俊仁, 孔保华.自然发酵风干肠中乳酸菌的分离与鉴定[J].食品工业科技,2010,31(11):158-160;324.
ZHAO J R,KONG B H.Isolation and identification of lactic acid bacteria from the Chinese-style naturally dry fermented sausages[J].Science and Technology of Food Industry,2010,31(11):158-160；324.
[16] 潘晓倩,赵燕,张顺亮,等.中温乳化香肠中一株优势腐败菌的分离鉴定与生物学特性[J].食品科学,2016,37(7):93-98.
PAN X Q,ZHAO Y,ZHANG S L,et al.Isolation,identification and biological characterization of a dominant spoilage strain in emulsified sausages sterilized at medium temperature[J].Food Science,2016,37(7):93-98.
[17] 李建,李丽,彭翠珍,等.几株适用于发酵肉制品的乳酸菌的分离筛选及鉴定[J].食品研究与开发,2018,39(6):172-177.
LI J,LI L,PENG C Z,et al.Selection and identification of several lactic acid bacteria strains for fermented meat products[J].Food Research and Development,2018,39(6):172-177.
[18] 邓展瑞,贠建民,郭娟,等.陇西腊肉加工过程中优势乳酸菌的分离及其发酵性能研究[J].生物技术进展,2019,9(2):200-209.
DENG Z R,YUN J M,GUO J,et al.Study on isolation and fermentation performance of dominant lactic acid bacteria during the processing of Longxi bacon[J].Current Biotechnology,2019,9(2):200-209.
[19] 刘丽莉,杨协力.发酵肉制品中乳酸菌菌种筛选研究[J].农业机械学报,2006,37(8):229-231.
LIU L L,YANG X L.Screening and study of lactic acid bacteria in fermented meat products[J].Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery,2006,37(8):229-231.
[20] 胡楠,雷鸣,王远一飞,等.传统发酵蓝莓饮料中乳酸菌的分离鉴定及筛选[J].食品研究与开发,2019,40(23):205-211.
HU N,LEI M,WANG Y Y F,et al.Isolation,identification and screen of lactic acid bacteria from traditional fermented blueberry beverages[J].Food Research and Development,2019,40(23):205-211.
[21] 吉莉莉,魏艳,何丹,等.发酵香肠中分离纯化的三株乳酸菌产酸特性研究[J].中国调味品,2020,45(2):36-39.
JI L L,WEI Y,HE D,et al.Study on acid production characteristics of three strains of lactic acid bacteria isolated and purified from fermented sausage[J].China Condiment,2020,45(2):36-39.
[22] 刘夏炜.内蒙古传统肉制品中葡萄球菌的分离筛选及其在羊肉发酵香肠中的应用[D].呼和浩特:内蒙古农业大学,2015.
LIU X W.The separation of Staphylococcus in Inner Mongolia traditional meat products and the application of fermented mutton sausage[D].Hohhot:Inner Mongolia Agricultural University,2015.