汉中市地处中国陕西南部,秦岭-巴山之间得天独厚的生态环境使其自古成为贡茶、名优茶的知名产地,茶树种植有4000多年的历史[1-3]。汉中市有西乡县、南郑县、勉县、宁强县、镇巴县、城固县、略阳县、洋县等8个产茶县,茶园面积超过5.33万hm2,总产量接近3万t,产值超过20亿元[1]。为了改变汉中市茶叶品牌多、乱、杂,市场知名度不高,产品竞争力不强的局面,汉中市政府将原有的“午子仙毫”、“定军茗眉”、“宁强雀舌”等20多个品牌实行了“统一品名,统一工艺、统一标准”,整合为“汉中仙毫”一个绿茶品牌[2]。近年来,“汉中仙毫”先后获得国家质检总局认定的国家地理标志产品,中国茶叶区域公用品牌最具发展力品牌以及中国国际茶叶博览会绿茶类金奖等荣誉,受到了国内外消费者的高度赞誉[2-3]。每年清明节前后,市场上“汉中仙毫”绿茶琳琅满目,销售价格差异较大(600~4 000 元/kg)。如何对“汉中仙毫”产地质量进行客观评估,对于维护消费者的知情权、经济利益以及管理“汉中仙毫”品牌具有重要意义。
香气物质是衡量茶叶品质的关键因子,对茶叶风味、等级评定及大众消费导向等都具有重要作用[4-6]。人类已从茶叶挥发性成分中鉴定出的香气物质多达700余种,主要包括醇类、醛类、酮类、酸类、酯类、酚类以及杂环类化合物等,这些成分构成了茶叶呈香的重要化学物质基础[7-13]。目前,茶叶挥发性风味物质的分析方法已非常成熟,已报道的方法包括气相色谱-质谱联用(gas chromatograph-mass spectrometry,GC-MS)[8,12]、气相色谱-嗅闻(gas chromatograph-olfactometry,GC-O)[12-13]、气相-离子迁移谱(gas chromatograph-ion mobility spectrometer,GC-IMS)[7,9]等技术,结合固相微萃取、风味提取物稀释、重组及感官分析可实现对茶叶挥发性气味成分的定性、定量分析。与主流的GC-MS技术相比,GC-IMS是近年来出现的较新挥发性风味物质分离和检测技术,该技术整合了气相与离子迁移谱在分离和检测方面的优势,具有样品制备简单、灵敏度高、分辨率高、操作简便、分析高效和风味物质可视化等特点[7,9,14],尤其适合食品中挥发性有机化合物的痕量分析与检测,应用范围和优势不断被报道。
在茶叶挥发性风味物质方面,李俊杰等[9]采用GC-IMS结合顶空固相微萃取-气质联用技术,对手筑茯砖茶“发花”(发酵)和干燥过程中挥发性组分的变化进行分析,共检测出7类共57种有机化合物,结合主成分分析可实现不同加工阶段茯砖茶风味物质的区分;江津津等[15]利用GC-IMS技术对不同成熟期新会茶枝柑皮制得的4 种柑普茶挥发性风味物质进行了定性分析,发现芳樟醇、α-松油醇、香兰素、α-蒎烯等化合物是柑普茶区别于其他普洱茶的特征风味化合物,可依据这类特征化合物的含量对新会柑普茶进行快速分类鉴别;JIN等[16]发现GC-IMS技术在福建乌龙茶风味鉴别中具有高度敏感性,可实现铁观音、大红袍茶样的产地区分。此外,有关利用GC-IMS技术对绿茶挥发性风味物质定性分析、指纹图谱建立等研究也已被不断报道[7,17-18]。上述相关研究为GC-IMS技术在不同品牌、种类和产地茶叶的挥发性风味物质定性分析、质量控制等方面积累了较好的研究基础。
前期研究表明[11],汉中炒青绿茶中共鉴定出66种香气化合物,其中含量高的化合物有吲哚、2-乙酰基-2-噻唑啉、茉莉酮、香叶醇、葫芦巴内酯等;香气特征分析显示,汉中炒青的香气特征以焦糖香气为主,其次为花香气、豆香气和药香气,关键香气化合物有芳樟醇、葫芦巴内酯、吲哚、香草醛、α-紫罗酮和4-羟基-2,5-二甲基3(2H)呋喃酮等。此外,课题组还利用GC-MS和GC-O从汉中红茶中分析出了73种香气化合物,鉴定了24种关键香气成分[12-13]。在不同产地茶叶风味物质方面,郭建军等[8]采用顶空-固相微萃取和GC-MS技术分析了贵州不同产地绿茶的香气组成,12种绿茶共鉴定出75种香气化合物。然而汉中市不同产地的“汉中仙毫”绿茶挥发性气味成分是否存在差异,尚未见相关报道。基于此,本研究利用GC-IMS技术对汉中市5个主要绿茶产地(南郑、镇巴、西乡、勉县、宁强)清明节前制作的“汉中仙毫”绿茶气味成分进行分析,旨在为今后“汉中仙毫”绿茶品质控制、产地质量区分与品牌管理提供理论和技术依据。
试验用“汉中仙毫”绿茶样品,分别于2020年3月下旬至4月初采自陕西省汉中市5个县区,由制茶师经摊放、杀青、揉捻和干燥标准工艺制作为市售一级商品绿茶,封口包装后低温运至实验室于0~4 ℃下保藏,样品信息见表1。
表1 不同产地“汉中仙毫”样品信息
Table 1 Sample information of Hanzhong Xianhao
from different places
产地采样时间采样地点等级南郑(NZ)2020年3月20日穆家坝一级勉县(MX)2020年3月29日小河庙一级镇巴(ZB)2020年3月27日宝山一级西乡(XX)2020年4月2日午子山一级宁强(NQ)2020年4月3日胡家坝一级
1.2.1 顶空进样条件
顶空孵化温度90 ℃;孵化时间1 min;采用振荡加热方式加热;顶空进样针温度95 ℃;进样量500.0 μL,不分流模式;载气:高纯N2(纯度≥99.99%);清洗时间0.5 min。
1.2.2 GC条件
色谱柱温度40 ℃;运行时间20 min;载气:高纯 N2(纯度≥99.99%);流速:初始 5.0 mL/min,保持 10 min 后在 5 min 内线性增至 150 mL/min。漂移管长度5 cm;管内线性电压400 V/cm。
1.2.3 IMS条件
柱温60 ℃;漂移气:N2(纯度≥99.99%);流速150 mL/min;IMS 探测器温度45 ℃;分析时间30 min。
每个产地“汉中仙毫”绿茶样品精密称取0.5 g,加入90 ℃热水,放入20.0 mL顶空进样瓶中,90 ℃孵化1 min,顶空进样后用 FlavourSpec®风味分析仪直接测试,每个样品做3个平行实验,经 G.A.S 公司开发的软件分析获得样品中挥发性有机物的差异谱图;然后利用软件自带的NIST和IMS数据库对气味成分进行定性分析。
利用风味仪LAV(laboratory analytical viewer)和 Reporter、Gallery Plot、Dynamic PCA三个插件分析数据结果,通过内置GC×IMS Library Search NIST数据库和IMS数据库对样品气味成分进行定性分析。
利用FlavourSpec®风味分析仪,对来自汉中市南镇区、勉县、西乡县、镇巴县和宁强县5个不同产地“汉中仙毫”冲泡后茶汤气味成分进行了分析。图1是由该仪器自带LAV分析软件中的Reporter插件程序获得的不同产地“汉中仙毫”茶汤气味成分3D谱图。红色垂直线表示离子峰,离子峰两侧的每个点代表1种挥发性有机物,颜色的深浅表示含量的高低。1种化合物可能会产生1、2个或多个斑点(代表单体、二聚体或三聚体),具体取决于气味浓度和性质[14]。从色彩观察可知,5种不同产地“汉中仙毫”茶汤的GC-IMS三维谱图非常相似,肉眼难以直观进行区分(图1)。
将图1的三维GC-IMS谱图投影到二维平面俯视图见图2,可直接进行不同产地“汉中仙毫”气味物质成分的差异性对比分析。
图1 不同产地“汉中仙毫”茶汤GC-IMS三维谱图
Fig.1 Three dimensional GC-IMS spectra of Hanzhong
Xianhao tea infusion from different places
注:图中字母NZ、MX、ZB、XX和NQ代表茶叶样品分别来自南郑、
勉县、镇巴、西乡和宁强(下同)
a-原始谱图;b-差异对比谱图
图2 不同产地“汉中仙毫”茶汤GC-IMS二维谱图
Fig.2 Two dimensional GC-IMS spectra of Hanzhong Xianhao tea infusion from different places
由图2可知,5个不同产地“汉中仙毫”绿茶样品挥发性气味成分可通过GC-IMS技术实现很好地分离,不同产地“汉中仙毫”绿茶冲泡后茶汤呈现出不同的GC-IMS特征谱信息,且不同产地“汉中仙毫”茶汤中部分气味物质浓度出现升高或降低,显示出了较明显的差异(图2-b中红色框中所示)其原因可能是茶树地理分布、海拔、生态环境、制茶工艺条件等因素造成,不同区域茶叶样品挥发性成分含量的不同[7-8,16]。郭建军等[8]利用GC-MS分析表明,贵州六大产茶区12种代表性绿茶挥发性风味物质也呈现出一定的差异性;林若川等[17]研究发现,通过GC-IMS技术可对绿茶样品进行挥发性物质定性鉴别,并探讨了该技术与GC-MS的优缺点,指出GC-IMS技术具有样品前处理简单、快速的特点。
通过比较特征性风味物质的保留时间和迁移时间,使用外标正酮C4-C9作为参考[14-16],计算每种挥发性物质的保留指数,通过 GC-IMS 数据库进行匹配,从而对挥发性气味物质进行定性分析。图3中显示的数字、标记点代表定性分析出的一种挥发性气味物质。根据软件内置的NIST 2014气相保留指数数据库与G.A.S.的IMS迁移时间数据库,可以明确定性的挥发性物质有61种单体及部分物质的二聚体,包括醛类30种、酮类12种、酯类7种、醇类6种、呋喃类4种和 酸类2种,其中鉴定的单体、二聚体的化学式和CAS号相同,仅形态不同,结果如表2所示,图3中数字编号与表2中挥发性有机物质相互对应。
图3 “汉中仙毫”茶汤挥发性气味物质离子迁移谱定性分析
Fig.3 IMS qualitative analysis of volatile compounds of
Hanzhong Xianhao tea infusion
为了更直观地对比不同产地“汉中仙毫”茶汤中挥发性气味物质的差异性,选取每个产地茶汤样品平行测试3次,获得GC-IMS二维图谱中所有待鉴定信号峰,生成不同产地“汉中仙毫”气味物质指纹图谱,如图4所示。每1行代表一个样品(从上至下分别为南郑、勉县、镇巴、西乡、宁强),每1列代表不同样品中相同的挥发性物质(红色信号越深,表示该物质质量浓度相对越高),指纹图谱上有两个相同名字的是单体和二聚体。不同产地“汉中仙毫”茶汤挥发性有机物质显示出了较大差异(图中红色框区域),其中“汉中仙毫”茶汤的挥发性气味物质以酮类、醛类、酯类物质占主导。来源于南郑产区的茶叶,苯甲酸甲酯、2,6-二甲基4-庚酮质量浓度相对较高;勉县产区茶叶,2,5-二甲基呋喃、2-戊基呋喃、苯乙醛、正己醇、2-乙基呋喃、2-辛烯醛、丙酮质量浓度相对较高,而二甲基丁醛质量浓度最低;镇巴产区茶叶,2,3-乙酰丙酮、2-己烯醛、2,4-二烯醛、2-戊酮质量浓度相对较高;西乡产区茶叶,庚醛、正丁醛、甲基丙醛(单体、二聚体)、2-丁酮质量浓度相对较高;宁强产区茶叶,丁基丙酸、戊醛、甲基异丁基酮、乙酸乙酯、戊醇、1-辛烯-3-醇、3-辛醇、2-庚醇、(E)-2-庚烯醛质量浓度相对较高。这些关键挥发性风味化合物,可能对于不同产地“汉中仙毫”茶汤气味物质具有一定影响。
表2 “汉中仙毫”茶汤中挥发性物质定性分析
Table 2 Qualitative analysis of volatile compounds of
Hanzhong Xianhao tea infusion
编号气味化合物名称CAS号分子式分子量保留指数T保留/sT漂移/ms12-庚基呋喃C3777717C11H18O166.31 237.6702.9721.409 592醛单体C124196C9H18O142.21 107510.421.470 863壬醛二聚体C124196C9H18O142.21 107510.421.947 154苯甲酸甲酯单体C93583C8H8O2136.11 090.1485.5211.209 055苯甲酸甲酯二聚体C93583C8H8O2136.11 090.1485.5211.605 956辛醛单体C124130C8H16O128.21 004.5359.3141.402 547辛醛二聚体C124130C8H16O128.21 004.8359.8581.826 678苯乙醛C122781C8H8O120.21037.9408.6091.252 769(E)-2-辛烯醛C2548870C8H14O126.21 053.4431.3841.334 2110(Z)-3-己烯乙酸C3681718C8H14O2142.21 009.7367.0081.307 42112-辛酮C111137C8H16O128.2999.2351.5221.340 64122-戊基呋喃C3777693C9H14O138.2993.3344.9041.255 51136-甲基-5-庚烯-2-酮C110930C8H14O126.2990.1342.1991.180 4414(E,E)-2,4-庚二烯醛C4313035C7H10O110.21011.2369.3011.193 72152,4-二烯醛C5910850C7H10O110.2999.9352.6531.199 96161-辛烯-3-醇C3391864C8H16O128.2980.8334.4181.161 9517乙酰酮C98862C8H8O120.21 059.6440.5791.182 61181-辛烯-3-酮C4312996C8H14O126.2978.1332.1271.271 5519(E)-2-庚烯醛单体C18829555C7H12O112.2951309.4521.256 8720(E)-2-庚烯醛二聚体C18829555C7H12O112.2952.1310.3771.671 8421苯甲醛单体C100527C7H6O106.1956.3313.8481.150 3722苯甲醛二聚体C100527C7H6O106.1955.5313.1541.468 63232,6-二甲基4-庚酮C108838C9H18O142.2948.9307.6851.325 6924丁基丙酸C590012C7H14O2130.2904.9270.7421.286 4925庚醛单体C111717C7H14O114.2898.4265.3191.330 3926庚醛二聚体C111717C7H14O114.2897.7264.6941.697 7272-庚酮C110430C7H14O114.2889.6258.6451.261 8628(E)-2-己烯醛单体C6728263C6H10O98.1845.9234.0321.182 6129(E)-2-己烯醛二聚体C6728263C6H10O98.1844.1233.041.521 0930乙酸乙酯单体C123864C6H12O2116.2805.6211.3361.237 831己醛单体C66251C6H12O100.2793.4204.4281.259 8132己醛二聚体C66251C6H12O100.2793.4204.4281.566 0733乙酸乙酯二聚体C123864C6H12O2116.2805210.9941.623 22342-己酮C591786C6H12O100.2792.2203.7751.506 8935糠醛C98011C5H4O296.1827.8223.8161.085 1336正己醇C111273C6H14O102.2864.5244.5271.326 237戊醇单体C71410C5H12O88.1764.8191.2191.253 1938戊醇二聚体C71410C5H12O88.1765.3191.4271.511 2939(E)-2-戊烯醛单体C1576870C5H8O84.1750.8185.3931.107 0140(E)-2-戊烯醛二聚体C1576870C5H8O84.1749.8184.9761.362 61412,5-二甲基呋喃C625865C6H8O96.1712.3169.3691.035 1842乙酸丙酯C109604C5H10O2102.1716.8171.2421.164 6543甲基异丁基酮C108101C6H12O100.2726.3175.1961.185 5344戊醛单体C110623C5H10O86.1697163.0181.187 3945戊醛二聚体C110623C5H10O86.1697.6163.2851.423 67462-甲基丁醛单体C96173C5H10O86.1673155.2551.160 77473-甲基丁醛C590863C5H10O86.1640.7146.3821.174 72482-甲基丁醛二聚体C96173C5H10O86.1670.7154.6311.399 7849乙酸乙酯单体C141786C4H8O288.1608.2137.4391.096 8250乙酸乙酯二聚体C141786C4H8O288.1607.8137.3521.337 4651正丁醛C123728C4H8O72.1596.5134.2261.292 45522-丁酮单体C78933C4H8O72.1584.1130.8191.060 5153甲基丙醛单体C78842C4H8O72.1565.4125.6761.106 8554丙酮C67641C3H6O58.1483.1103.0751.122 75
续表2
编号气味化合物名称CAS号分子式分子量保留指数T保留/sT漂移/ms55甲基丙醛二聚体C78842C4H8O72.1562.4124.8641.283 9562-丁酮C78933C4H8O72.1582.6130.4131.245 86572-乙基呋喃C3208160C6H8O96.1703.7165.8141.047 82582,3-乙酰丙酮C600146C5H8O2100.1687.4159.2251.309 91592-戊酮C107879C5H10O86.1682.6157.881.120 58603-甲基丁醛C590863C5H10O86.1645.9147.8161.410 77613-辛醇C589980C8H18O130.2986.6339.3011.403 06
对西湖龙井绿茶的挥发性风味物质定性定量进行分析时,不同研究人员得到的实验结果存在较大差异,不同产地茶叶或者同一类型茶叶挥发性风味物质,可能由于原料产地、加工方法等不同存在较大差异[19-20]。尽管本研究中通过GC-IMS只分析鉴定出“汉中仙毫”茶汤中61种风味化合物,还有29种化合物由于数据库信息不完善没有能够定性,这也是GC-IMS技术在其他食品挥发性气味物质分析的共同局限性[7,14,21-23]。
图4 不同产地“汉中仙毫”茶汤气味指纹谱图
Fig.4 Fingerprint of volatile organic compounds of Hanzhong Xianhao tea infusion from different places
有研究通过GC-IMS图谱数据结合主成分分析,根据挥发性风味物质对不同产地水蜜桃[22]、羊肉[23]、黄酒[24]产地进行区分。目前,GC-IMS技术已经在茶叶挥发性风味物质分析中也显示了一定的优势,可用于等级、产地和茶树品种的鉴别、区分[7,16,18]。本研究根据“汉中仙毫”茶汤GC-IMS色谱数据,不同产地“汉中仙毫”挥发性气味指纹图谱,采用主成分分析探究其用于产地区分的可行性。由图5可知,主成分1和主成分2累计贡献率达到73%,同一产地“汉中仙毫”气味物质谱图数据大致聚集在一起,不同产地“汉中仙毫”可以较好地得到区分,且没有明显重叠区域,说明采用GC-IMS技术结合主成分分析,可实现不同产地“汉中仙毫”挥发性气味成分的较好区分。
图5 不同产地“汉中仙毫”茶汤气味指纹主成分分析
Fig.5 PCA score of fingerprint of volatile organic compounds in
Hanzhong Xianhao tea infusion from different places
茶叶质量分类的不确定性,直接关系着茶农、加工销售企业以及消费者经济利益。不同产地、等级茶叶价格相差很大,因此亟需快速、准确、便捷的方法对茶叶的产地质量进行评估[25-26]。GC-IMS作为一种新兴风味物质分析方法,具有响应迅速、操作简单、快速、检测结果准确等优点。其基于气相分离与离子迁移谱的联用,克服了单一气相色谱方法的不足,在离子迁移管中进行二次分离,可大大提高仪器分辨能力和灵敏度,可应用于大多数复杂体系中特征风味有机挥发组分的快速检测、识别及指纹图谱可视化等[14,21]。有报道发现,GC-IMS技术在福建乌龙茶风味鉴别中具有高度敏感性,可实现铁观音、大红袍茶样的产地区分[16]。本研究发现GC-IMS指纹图谱可用于不同产地“汉中仙毫”的较好区分,与文献报道中利用GC-IMS结合主成分分析,鉴定不同等级、产地、区域绿茶挥发性风味物质基本一致[7,16,18]。
采用GC-IMS技术对不同产地“汉中仙毫”茶汤挥发性气味物质进行分析,共分析鉴定了61种挥发性有机化合物,包括一些物质的二聚体。“汉中仙毫”茶汤的挥发性气味物质主要包括醛类30种、酮类12种、酯类7种、醇类6种、呋喃类4种和酸类2种。来源于南郑产区的茶叶,苯甲酸甲酯、2,6-二甲基4-庚酮质量浓度相对较高;来源于勉县的茶叶,2,5-二甲基呋喃、2-戊基呋喃、苯乙醛、正己醇、2-乙基呋喃、2-辛烯醛、丙酮质量浓度相对较高,而二甲基丁醛质量浓度最低;来源于镇巴产区的茶叶,2,3-乙酰丙酮、2-己烯醛、2,4-二烯醛、2-戊酮质量浓度相对较高;来源于西乡产区的茶叶,庚醛、正丁醛、甲基丙醛(单体、二聚体)、2-丁酮质量浓度相对较高;来源于宁强产区的茶叶,丁基丙酸、戊醛、甲基异丁基酮、乙酸乙酯、戊醇、1-辛烯-3-醇、3-辛醇、2-庚醇、(E)-2-庚烯醛质量浓度相对较高。这些关键的挥发性风味化合物,可能对于不同产地“汉中仙毫”茶汤气味产生重要影响。不同产地“汉中仙毫”茶汤挥发性气味成分气相-离子迁移谱呈现出一定差异,通过主成分分析可较好地实现产地区分。本研究获得了“汉中仙毫”挥发性气味成分的指纹图谱,可视化呈现出了不同产地“汉中仙毫”气味物质的差异,对今后“汉中仙毫”品质控制、产地区分与品牌管理提供了参考。
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