谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)是生物合成γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid,GABA)和拆分手性DL-谷氨酸(DL-glutamic acid，DL-Glu)的重要工业用酶[1-3]。已有研究表明，屎肠球菌(Enterococcus faecium)具有很强GAD活性，具有良好的应用前景[3-6]。然而，天然酶的纯化非常困难，如唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcus salivarius ssp. thermophilus) GAD需要经过硫酸铵分级沉淀、等电点沉淀、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析、HiPrep16/10 Phenyl FF疏水层析和Sephadex G-100凝胶层析等5步纯化才能达到电泳纯[7]。因此，研发快捷、低成本、高效、绿色的新型纯化技术，对纯酶制剂的生产具有重要意义。
纤维素结合域(cellulose-binding domain,CBD)是大多数纤维素降解酶的重要结构域之一，负责酶的识别和与底物的结合[8-10]。CBD利用能与纤维素发生特异结合的特性，已成为一种新型亲和标签，用于融合蛋白的纯化或固定化[11-13]。内含肽(intein)是类似内含子的一段多肽，蛋白质翻译后可通过内含肽自催化N-或C-末端剪切作用而实现与前体蛋白分离[14]，已成功作为蛋白质连接的蛋白质构建块用于蛋白质的纯化[15-16]。如能综合CBD和内含肽的特性，在CBD和GAD之间插入内含肽，通过适宜的不溶性载体对CBD融合特异亲和吸附将融合酶与杂蛋白分离，再通过内含肽的自剪切作用使GAD脱离，即可在不使用蛋白酶的情况下制备出GAD纯酶。这一策略的实现将依赖于3个主要条件：① 纤维素结合域-内含肽-谷氨酸脱羧酶(CBD-intein-GAD)能否高效表达，这是获取优质酶源的关键和基础；② 载体对CBD是否具有较强特异性吸附，特异性不高则可能存在杂蛋白吸附，吸附力不强则可能在自剪切过程中出现CBD-intein-GAD与载体脱吸附，都会造成GAD不纯；③ 自剪切条件是否适宜，会直接影响GAD能否与载体-CBD-intein有效分离，与GAD纯度和产量密切相关。
本实验主要以来源于热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)的家族3的CBD、集胞藻(Synechocystis sp.PCC6803)的内含肽DnaB和屎肠球菌GAD核苷酸序列，对融合酶CBD-DnaB-GAD的构建、GAD纯化及其酶学性质进行探讨，以期为GAD纯酶制剂的生产提供应用和理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
Escherichia coli DH5α用于融合酶的表达，由林谦博士提供。E.coli GDMCC60446为本实验构建的重组菌株，可高效表达融合酶CBD-DnaB-GAD，保藏于广东省微生物菌种保藏中心。
TransStart Fast Pfu DNA聚合酶,全式金生物技术公司；DNA胶回收试剂盒和细菌基因组提取试剂盒,康为世纪生物技术公司；Taq DNA聚合酶、pMD19 Simple T载体和In-fusion HD 基因克隆试剂盒,大连宝生物工程公司。GABA(质量分数≥99%)和5′-磷酸吡哆醛(pyridoxal 5′-phosphate,PLP),美国Sigma-Aldrich公司；氨苄青霉素(Ampicillin,Amp， 钠盐，美国药典级)和层析柱(60 mL,26.2 mm×134 mm),生工生物工程(上海)有限公司；超滤离心管(截留分子质量2 kDa),德国Sartorius集团；其他试剂为市售生化试剂、色谱纯或分析纯试剂。
pRPOCDN为自行构建的E.coli质粒，主要在pUC57质粒中插入了胁迫诱导型启动子PrpoS、CBD编码序列cbm3、内含肽DnaB编码序列dnaB和T7终止子序列。gadB基因为课题组前期研究以E.faecium GDMCC60203基因组DNA为模板，通过PCR扩增和纯化自行制备，大小为1 401 bp[17]。所用引物均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
Luria-Bertani(LB)培养基参照文献[18]配制。培养E.coli GDMCC60446的LB培养基含100 μg/mL Amp。
再生无定形纤维素(regenerated amorphous cellulose，RAC) 按照文献[19]的方法制备。
1.2 仪器与设备
1200 Series高效液相色谱仪,美国安捷伦公司；Auw120电子分析天平,日本岛津公司；HZQ-F100恒温振荡培养箱,金坛市精达仪器制造有限公司；TGL16M台式高速冷冻离心机,盐城市凯特实验仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 E.coli DH5α和E.coli GDMCC60446培养
参照文献[17]进行培养。菌株 DH5α采用不含Amp的LB液体培养基进行培养，GDMCC60446重组菌株则以含Amp的LB液体培养基进行培养。
1.3.2 GAD酶活力测定
除特别说明外，GAD酶活力测定条件为：0.5 mL GAD酶液与1.5 mL 0.25 mol/L L-Glu溶液(pH 5.0，溶于0.2 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液，含0.2 mmol/L PLP)混合，40 ℃水浴反应1 h，加入4 mL无水乙醇，混匀、终止反应，8 500 r/min离心15 min，取上清液测定GABA含量。酶活力单位定义：测定条件下1 h生成1 μmol GABA所需要的酶量为1个酶活力单位(U)。除设置了对照组的实验以对照组平均GAD酶活力为100%外，其余均以酶活力最高的实验组平均GAD酶活力为100%计算相对酶活力(%)。
1.3.3 GABA分析
GABA参照文献[17]采用高效液相色谱进行分析。
1.3.4 CBD-DnaB-GAD重组E.coli的构建
1.3.4.1 表达载体及重组菌的构建
以5′-GCGGCCGCCCATGGCTCTTCCG-3′和5′-GAATTCCTCGAGGGCTCTTCCAG-3′为引物，以pRPOCDN作为模板，通过PCR扩增制备含有内含肽编码序列dnaB的4.2 kb线性化载体，电泳切胶，回收纯化线性化载体，与gadB进行组装，构建pRPOCDN-EfagadB重组质粒。PCR扩增和拼接组装参照文献[17]进行。以pRPOCDN-EfagadB转化感受态E.coli DH5α细胞。提取单菌落的质粒并经BamH I、EcoR I双酶切后进行电泳检测，已转化了pRPOCDN-EfagadB的菌株即为重组E.coli GDMCC60446。
1.3.4.2 CBD-DnaB-GAD的表达
将重组菌株GDMCC60446培养液于4 ℃、8 500 r/min 离心15 min，收集菌体。将湿菌体与生理盐水按1∶20(g∶mL)混合，搅拌分散洗涤菌体，再次离心收集菌体，然后将湿菌体与Tris-HCl 缓冲液(50 mmol/L，pH 8.0)按1∶15(g∶mL)混合，冰浴中超声波破碎细胞(400 W，工作5 s，冷却5 s，全程50 min)，离心收集上清液即为CBD-DnaB-GAD粗酶液。将15 mL粗酶液与 0.9 g(湿质量)RAC混合，30 ℃、50 r/min振荡10 min，转入小层析柱，蠕动泵抽滤去除液体，固体基质即为RAC-CBD-DnaB-GAD。在小层析柱中，以40 mL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)分4次洗涤RAC-CBD-DnaB-GAD，蠕动泵抽滤去除洗涤液。取已洗涤的0.2 g RAC-CBD-DnaB-GAD，加入10 mL 0.25 mol/L L-Glu溶液(pH 5.0，溶于0.2 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液，含0.2 mmol/L PLP)，混合，40 ℃水浴反应1 h，按体积比为1∶2的比例将反应液与无水乙醇混合终止反应， 8 500 r/min离心15 min，取上清液分析转化产物GABA。
1.3.5 GAD纯酶制备
分别以均含0.5 mol/L NaCl和1 mmol/L EDTA的pH 6.5 Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L，记为A)、pH 6.5磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.2 mol/L,记为B)、pH 5.6乙酸-乙酸钠缓冲液(0.2 mol/L，记为C)作为自剪切液，通过比较剪切制备的酶液的GAD活性评价RAC-CBD-DnaB-GAD在不同自剪切液中的剪切效果。按照1.3.4.2小节的方法制备和洗涤RAC-CBD-DnaB-GAD，然后分别在层析柱中加入30 mL自剪切液浸泡RAC-CBD-DnaB-GAD，30 ℃保温12 h，蠕动泵抽滤，将滤出液用超滤离心管于3 000 r/min进行超滤，当管内剩余约1 mL液时加入5 mL 50 mmol/L EDTA醋酸-醋酸钠溶液(含0.2 mmol/L PLP)，再次离心，如此重复超滤5次，然后用醋酸-醋酸钠溶液定容至10 mL，即为GAD纯酶液。
GAD纯度和分子质量采用SDS-PAGE电泳进行分析，浓缩胶质量分数为5%浓度，分离胶质量分数为8%，胶厚1.0 mm。蛋白质浓度按照试剂盒说明书采用Bradford法测定。分子质量根据标准蛋白质和GAD的SDS-PAGE电泳迁移率进行计算，并结合由gadB序列推算的理论分子质量判断GAD的亚基组成。
1.3.6 GAD酶学性质研究
1.3.6.1 pH对GAD的影响
pH对GAD反应活性的影响：分别以pH 4.0～5.8(梯度0.2)的0.25 mol/L L-Glu溶液(溶于0.2 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液，含0.2 mmol/L PLP)作为底物进行酶活力测定。pH对GAD稳定性的影响：先将GAD酶液通过离心超滤将原酶液的溶剂(乙酸-乙酸钠缓冲液)替换为含0.2 mmol/L PLP的生理盐水，再分别与pH 3.6～5.8 (梯度0.4)的50 mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液或0.2 mmol/L PLP的生理盐水按1∶1混合作为酶液；将pH 3.6～5.8组各酶液于40 ℃保温5 h，分别测定处理后的GAD酶液的残余酶活力，以4 ℃保存的生理盐水组酶液为对照。
1.3.6.2 温度对GAD的影响
温度对GAD反应活性的影响：分别在40～70 ℃(梯度5 ℃)下测定GAD酶活力。温度对GAD稳定性的影响：先将GAD酶液分别于-25、-20、-7、4、40、50、60和70 ℃ 保温3 h，室温静置1 h，然后再分别测定已恢复至室温的GAD酶液残余酶活力，以4 ℃处理组为对照。
1.3.6.3 化学试剂对GAD活性的影响
在GAD酶活力测定的反应体系中分别加入50 μL 0.2 mol/L 的ZnSO4、CuSO4、MnSO4、MgSO4、NaCl、KCl、CaCl2、FeCl2、FeCl3、AlCl3、Pb(CH3COO)2、AgNO3、EDTA-2 Na、乙二醇(ethylene glycol，EG)溶液，快速混匀，即各化合物的终浓度为5 mmol/L。以加蒸馏水50 μL作为对照。55 ℃水浴反应1 h。
1.3.6.4 GAD底物特异性
分别以溶于0.2 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液的0.25 mol/L L-Glu、D-Glu和L-Asp溶液(pH 5.0，均含0.2 mmol/L PLP)作为GAD底物，参照文献[17]于55 ℃测定GAD底物特异性。以121 ℃灭活10 min的GAD酶液作为对照。
1.3.6.5 GAD动力学常数
参照文献[17]分别以pH 5.0的不同浓度的 L-Glu溶液(溶于0.2 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液，含0.2 mmol/L PLP)作为底物于55 ℃反应5 min进行GAD酶活力测定，并计算GAD的Km 和 Vmax。
1.3.6.6 GABA对GAD活性的影响
以分别含0.1、0.2 mol/L GABA的0.25 mol/L L-Glu溶液作为底物于55 ℃水浴反应1 h，以新增GABA的量计算GAD酶活力。以不添加GABA的0.25 mol/L L-Glu溶液按同样操作作为对照。
1.4 数据分析
利用IBM SPSS Statistics 19.0软件采用单因素方差分析(ANOVA)的Duncan法进行统计分析。图表中不同的英文字母表示两组间差异显著(P<0.05)。
2 结果与分析
2.1 CBD-DnaB-GAD重组E.coli的构建
2.1.1 表达载体及重组菌的构建
经PCR扩增得到含有内含肽编码序列dnaB的4.2 kb线状载体骨架，将该线状载体骨架与gadB基因拼接后，得到pRPOCDN-EfagadB重组质粒(图1)，该重组质粒全长为5 652 bp，包含了胁迫诱导型启动子PrpoS(743 bp)、CBD编码序列cbm3(480 bp)、DnaB编码序列dnaB(522 bp)和屎肠球菌GAD基因gadB(1401 bp)。经用BamH I和EcoR I双酶切，酶切产物电泳结果与pRPOCDN-EfagadB重组质粒的核苷酸序列理论推断(理论应得到3 723和1 929 bp两个片段)一致，说明pRPOCDN-EfagadB重组质粒成功构建。将pRPOCDN-EfagadB转化E.coli DH5α，获得携带CBD-DnaB-GAD表达载体的重组菌株E.coli GDMCC60446。
PrpoS-胁迫诱导型启动子，包含E.coli中 5′-非翻译区；cbm3-来自
Clostridium thermocellum家族3纤维素结合域的编码序列;
dnaB-来自Synechocystis sp.PCC6803的内含肽DnaB的
编码序列；gadB-来自E.faecium GAD的基因
图1 pRPOCDN-EfagadB示意图
Fig.1 Diagram of pRPOCDN-EfagadB
2.1.2 CBD-DnaB-GAD的表达
因E.coli自身基因组也可表达GAD[20]，同时通过DnaB自剪切分离的GAD也可能会因发生高级结构的重折叠而失活，因此为了避免E.coli 自身GAD的干扰，精确反映是否成功表达具GAD活性的CBD-DnaB-GAD，故通过直接测定经RAC吸附分离后的RAC-CBD-DnaB-GAD的GAD酶活力反映CBD-DnaB-GAD的表达情况。经HPLC分析，转化液GABA浓度为(87.69±4.46) mmol/L。结果表明重组菌株GDMCC60446可表达具GAD酶活力的CBD-DnaB-GAD。
2.2 GAD纯酶的制备
通过RAC与CBD亲和吸附特性仅可实现将CBD-DnaB-GAD从粗酶液中分离出来，尚需进一步通过DnaB自剪切作用才能获得GAD。经对RAC-CBD-DnaB-GAD在不同剪切液中的自剪切效率进行探讨，结果如图2所示，在0.2 mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中自剪切效率最高，获得的酶液GAD活性最强。SDS-PAGE电泳结果(图3)表明GAD酶液为单一条带，说明制备获得的GAD达到电泳纯。根据SDS-PAGE电泳的相对迁移距离可求得GAD的分子质量为55.68 kDa，与由gadB核苷酸序列推算的GAD理论分子质量53.71 kDa基本相符，确认切割分离出了GAD，并表明GAD只由1个亚基组成。
剪切液是影响内含肽发生自剪切作用的重要因素，含NaCl和EDTA的Tris-HCl缓冲液常被用作内含肽DnaB的剪切液[15-16]，然而图2显示在pH、NaCl和EDTA同等的条件下，0.2 mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的剪切效果显著优于Tris-HCl缓冲液(P<0.05)，可能与不同缓冲液的离子强度存在差异有关。
A-50 mmol/L Tris-HCl缓冲液；B-0.2 mol/L磷酸氢二钠-磷酸
二氢钠缓冲液；C-0.2 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液
图2 不同剪切液中RAC-CBD-DnaB-GAD的自剪切效率
Fig.2 Self-cleavage efficiency of RAC-CBD-DnaB-GAD
in different cleavage solutions
注：不同小写字母表示具有显著性差异(P<0.05)(下同)
1-蛋白质Marker;2-CBD-DnaB-GAD粗酶液;3,4，5-纯化后GAD酶液
图3 SDS-PAGE电泳图
Fig.3 SDS-PAGE electrophorogram
2.3 GAD纯酶酶学性质
2.3.1 pH对GAD的影响
图4-a显示，当反应pH<5.0，GAD酶活力随pH增加而增强；当反应pH=5.0，GAD酶活力最强；当反应pH>5.0， GAD酶活力随反应pH增加而逐渐下降，但在pH 5.0～5.2,GAD酶活力变化不大，差异不显著(P>0.05)。结果表明，GAD最适反应pH为5.0。图4-b显示，当溶液pH为4.8～5.8时，40 ℃保温5 h仍较稳定，但当pH<4.8，则稳定性显著降低(P<0.05)。pH对GAD反应活性的影响较对CBD-GAD[22]的影响大，但对GAD和CBD-GAD[17]的稳定性影响较为相似，可能与CBD增大了蛋白质的分子量或轻微改变了酶蛋白的结构有关。
a-GAD反应活性;b-GAD稳定性
图4 pH对GAD反应活性和稳定性的影响
Fig.4 Effect of pH on the catalytic activity and stability of GAD
2.3.2 温度对GAD的影响
图5-a显示， GAD在55～60 ℃可保持95% 以上的酶活力，超出该温度范围，GAD反应活性快速下降。最适反应温度为55 ℃，但在55和60 ℃的GAD酶活力无显著性差异(P>0.05)。由图5-b可见，分别在-25～55 ℃的不同温度保温3 h，GAD残余酶活力与4 ℃处理组无显著性差异(P>0.05)，孵育温度升高则GAD残余酶活力快速降低，说明GAD在-25～55 ℃相对较稳定。
文献表明，CBD-GAD的最适反应温度为60 ℃，在4～40 ℃较稳定，冰冻处理(低于-7 ℃)和高于50 ℃处理对CBD-GAD稳定性影响较大[17]。GAD与CBD-GAD对温度的依赖性存在一定差异，可能与CBD增大了蛋白质的分子质量或轻微改变了酶蛋白的结构有关。
a-GAD反应活性;b-GAD稳定性
图5 温度对GAD反应活性和稳定性的影响
Fig.5 Effect of temperature on the catalytic activity and
stability of GAD
2.3.3 化学试剂对GAD活性的影响
由于酶的结构不同，化学因素对酶的影响是多种多样的。为了阐明化学因素对屎肠球菌GAD的影响，在反应体系中分别添加不同的化学试剂至终浓度为5 mmol/L。如图6所示，NaCl、CaCl2和乙二醇对GAD酶活力影响不大(P>0.05)，KCl、EDTA-2Na、ZnSO4、CuSO4、MnSO4、MgSO4、FeCl2、FeCl3、AlCl3、AgNO3和Pb(CH3COO)2对GAD酶活力具有不同程度的抑制作用(P<0.05)，其中KCl和EDTA-2Na抑制作用相对较弱，而AgNO3和Pb(CH3COO)2具有强抑制作用,在GAD应用中应避免存在这些化学物。
图6 化学试剂对GAD活力的影响
Fig.6 Effect of chemical reagents on the activity of GAD
反应液中的化学组分是影响酶活力的重要因素之一。文献表明，Ca2+对Lactobacillus fermentum YS2[13]、Lactobacillus brevis 877G[21]、Lactobacillus paracasei NFRI7415[22]和Lactobacillus sakei A156[23]的GAD酶活力具有促进作用，然而对S.salivarius ssp. thermophiles[7]和Bacillus megaterium[24]的GAD没有明显影响。本实验结果表明Ca2+对屎肠球菌GAD酶活力的影响与其对S.salivarius ssp. thermophiles[7]和Bacillus megaterium[24] GAD的影响基本一致。
2.3.4 GAD底物特异性
表1显示，GAD具有很强的底物专一性，仅对L-Glu具有催化活性，对L-Glu的异构体D-Glu和与仅有1个—CH2差异的L-Asp均无催化活性，与CBD-GAD[17]一致，说明CBD未改变GAD的底物特异性。
表1 GAD的底物特异性
Table 1 Substrate specificity of GAD
氨基酸对照组/(mmol·L-1)实验组/(mmol·L-1)浓度差绝对值/(mmol·L-1)变化率/%反应活性L-Glu139.26±3.64a118.16±8.19b15.0910.84+D-Glu138.40±15.42a137.84±11.04a0.560.41-L-Asp108.77±5.80b110.62±5.65b1.851.70-
注：底物浓度的平均变化率=|实验组浓度-对照组浓度|÷对照组浓度×100%;根据试验过程存在系统误差，将底物的平均变化率绝对值≤5%判定为阴性(-)，变化率绝对值>5%判定为阳性(+)[22]
2.3.5 GAD动力学常数
图7显示，L-Glu浓度低于19.2 mmol/L时，反应呈一级反应；L-Glu浓度在19.2～76.8 mmol/L，反应呈混合级反应；L-Glu浓度高于76.8 mmol/L，反应呈零级反应。结果表明，GAD催化反应没有底物抑制现象，符合Michaelis-Menten的快速平衡学说。通过Lineweaver-Burk作图法进行计算，GAD的Km 和 Vmax 分别为10.51 mmol/L和3.41 μmol/(mL·min)。底物浓度对GAD的影响和GAD动力学常数均与CBD-GAD[17]相似。
图7 L-Glu浓度对GAD催化反应速度的影响
Fig.7 Effect of L-Glu concentration on the catalytic
reaction rate of GAD
2.3.6 GABA对GAD活性的影响
图8显示，当在初始L-Glu底物溶液中添加 0.1 mol/L 和0.2 mol/L 的GABA时，GAD酶活力与未添加GABA的对照组无显著性差异(P>0.05)，说明GABA对GAD催化活性无抑制效应。结果与CBD-GAD[17]一致。
图8 GABA对GAD活性的影响
Fig.8 Effects of GABA on GAD activity
3 结论与讨论
微生物通过GAD催化L-Glu的α-羧基发生脱羧作用生成GABA，提高细胞微环境的pH值，抵抗酸性环境对其生长繁殖的不利影响，这是微生物的耐酸机制之一[25]，即野生株GAD在生理上是为了满足抗酸需要，通常表达量不高，远不能满足工业用酶需求，因此通过基因工程技术构建重组菌高效表达GAD将是解决工业用酶的重要途径。同时，GAD是胞内酶，细胞破碎提取液的杂蛋白多，酶的分离纯化困难，也是限制GAD的研究和应用的重要原因。本实验通过以CBD作为亲和标签，并利用内含肽DnaB的自剪切作用，构建和表达融合酶CBD-DnaB-GAD，通过RAC一步纯化即可获得屎肠球菌GAD纯酶，操作简便、成本低。由于通过DnaB自剪切作用，去除了CBD-DnaB序列，可避免CBD和DnaB对GAD酶学性质的影响，GAD性质更接近于天然酶。
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