近年来，以生物积累、生物转化或生物分子为基础的金属纳米粒子(如Ag、Au、Pd等)生物合成方法，因具有生态友好、安全高效等优点，正受到越来越多的关注[1]。其中，由蘑菇分泌物合成的纳米颗粒具有分散性好、稳定性高、保存期长等优点，因而在绿色制造、功能食品和医药材料等领域已经展现出巨大的潜力[2-3]。到目前为止，相关学者已在Pleurotus sp.，Ganoderma sp.，Lentinus sp.等多种蘑菇中通过细胞内和/或细胞外催化合成的方式，实现了金属/非金属纳米颗粒的生物合成[4]。研究表明，利用食用菌的无细胞滤液(cell-free filtrate，CFF)进行胞外合成，具有价格低廉、环境友好、反应条件温和可控以及易于分离等优点[5-6]，因而更具应用潜力。例如，董丽娜等[7]利用秀珍菇菌丝体的CFF不仅实现了AgNPs的可控合成，并且证实产物具有优良的抑菌活性和广谱抗菌活性。利用蘑菇合成的银纳米颗粒(silver nanoparticles,AgNPs)在抗菌剂、废水处理和催化剂等领域有着广泛的应用，相关产品的需求量越来越大[4,8]。

金针菇(Flammulina velutipes)富含蛋白质、多糖、类黄酮和多酚等生物分子，不仅具有较高的营养价值[9]，在金属/非金属元素的生物转化方面也表现出极好的潜力，如利用金针菇合成生物三聚体-金纳米颗粒(AuNPs)，并作为一种多相催化剂用于减少有机污染物[10]；利用金针菇自身的解毒机制实现SeNPs的胞内合成[11]。然而，利用金针菇进行纳米颗粒的胞外合成则鲜有报道，以金针菇发酵产物进行纳米银颗粒的合成也有待研究。

本研究利用金针菇的无细胞滤液(cell-free filtrate of Flammulina velutipes,FV-CFF)进行AgNPs的生物合成，进而通过反应动力学生成曲线探讨冻融和pH等因素对FV-CFF合成AgNPs的影响。最后，结合产物粒径和紫外可见(UV-Vis)吸收光谱的分析结果，讨论FV-CFF的成分及冻融和pH等不同处理条件对其还原力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金针菇(Flammulina velutipes)CICC 50051，中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection，CICC)；AgNO3、CH3COOH、NaOH、3,5-二硝基水杨酸、铁氰化钾、三氯乙酸、FeCl3等，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；BCA法蛋白浓度测定试剂盒(增强版)，碧云天生物技术有限公司；纳米银(AgNPs)标准溶液，张家港耐尔纳米科技有限公司。

1.2 仪器与设备

H2-2型电热恒温振荡水浴箱，上海精宏实验设备有限公司；Enspire 2300型酶标仪，美国PerkinElmer 公司；FAl004型电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；全温摇床柜HYG-A，太仓市实验设备厂；纳米激光粒度及zeta电位分析仪ZEN3700，马尔文仪器有限公司；透射电子显微镜(TEM，H-7650)，日本日立株式会社。

1.3 实验方法

1.3.1 金针菇菌丝体生长曲线的测定

金针菇种子液配方(g/L)：葡萄糖20，酵母20，KH2PO4 1，MgSO4·7H2O 0.5，VB1 0.5，装液量为200 mL/500 mL摇瓶。高压灭菌后，接入10片1 cm×1 cm金针菇PDA平板切片，于25 ℃，160 r/min摇床培养7 d后，按体积分数5%接种于发酵液中(配方与种子液一致)，于160 r/min摇床中25 ℃培养。每天收集发酵产物，洗涤并烘干菌体至恒重，测定生长曲线，并用DNS法测定发酵液中的残糖含量(n=3)。

1.3.2 无细胞滤液FV-CFF制备

将金针菇菌丝体发酵7 d后无菌过滤，收集菌丝体，并用无菌水洗涤3～5次，转移到无菌去离子水(200 mL)中继续培养3 d。抽滤，去除菌丝体，即得无细胞滤液FV-CFF，保存于4 ℃冰箱中，待用。

1.3.3 FV-CFF合成纳米颗粒

配制浓度为6 mmol/L的AgNO3溶液，并按照FV-CFF∶AgNO3溶液以2.0∶0.6体积比混合，并以超纯水补足至4.0 mL，混合均匀，于100 ℃加热反应30 min。反应结束后，扫描415 nm处的吸光度值，以所购买的纳米银标准溶液做标准曲线，测定AgNPs的产率。

1.3.4 AgNPs的合成及影响因素

1.3.4.1 FV-CFF及AgNO3添加比例对AgNPs合成的影响

将FV-CFF与AgNO3溶液(6 mmol/L)以1∶3～12∶3的体积比混合(对应发酵液比例5%～60%)，并以超纯水补足至4.0 mL，100 ℃水浴加热30 min，反应结束后迅速冰浴冷却至室温，测定OD415，并计算AgNPs产量。固定FV-CFF添加量为2.0 mL，测定AgNO3添加浓度对AgNPs生成的影响。

1.3.4.2 pH对FV-CFF合成 AgNPs的影响

经测定，初始FV-CFF的pH为7.22，分别用微量醋酸溶液和NaOH 溶液(均为100 g/L)将FV-CFF调节 pH 到 3、5、7、9、11，按1.3.3小节中所述条件进行反应，测定不同pH下FV-CFF合成纳米银的效果。

1.3.4.3 冻融对FV-CFF合成AgNPs的影响

根据确定的FV-CFF添加量及AgNO3浓度，测定50～100 ℃下FV-CFF冻融前后(冻融后离心除去不溶物)合成AgNPs的动力学生成曲线。

1.3.4.4 冻融前后的FV-CFF在pH 11时合成AgNPs效果

选择AgNO3终浓度为0.6 mmol/L(即0.4 mL)，FV-CFF(pH 11)添加比例为15%(即0.6 mL)，并以超纯水补足4.0 mL，测定FV-CFF冻融前后(pH 11)合成AgNPs的动力学生成曲线。

1.3.5 检测与分析方法

1.3.5.1 冻融前后FV-CFF中的主要成分及还原力测定

冻融前后FV-CFF中总蛋白、总糖和还原糖含量的测定分别采用BCA法[12]、苯酚-硫酸法[13]和DNS法，可溶性固形物含量的测定采用农业行业标准NY/T 2 637—2014[14]中的折射仪法。

冻融及pH对FV-CFF总还原力的影响采用铁氰化钾法评价[15]。取0.2 mL不同样品，分别加入1 mL pH 6.6的磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L)和1 mL铁氰化钾溶液(1 g/mL)混合均匀，50 ℃加热反应20 min，再加10%三氯乙酸0.2 mL终止反应，以4 000 r/min离心10 min。吸取0.2 mL上清液加去离子水稀释1倍，加0.04 mL 1% FeCl3溶液，常温静置反应10 min，测定700 nm波长处的吸光度。吸光度值的大小代表铁离子还原力的大小，以20 mg/L的Vc溶液作为阳性对照。

1.3.5.2 AgNPs的表征

分别取冻融前后及不同pH下的样品与AgNO3在100 ℃反应30 min，吸取生成的产物溶液，分别扫描300～700 nm范围内的紫外-可见(UV-Vis)吸收光谱；将样品在铜网碳膜上制样，干燥后使用透射电子显微镜在80 kV的加速电压下获得产物的形貌特征；使用马尔文纳米激光粒度仪测定样品及产物的粒度分布。

1.3.6 数据处理

所有试验均采用三平行设计(n=3)，试验数据采用Sigma plot 14.0软件进行统计分析和作图。

2 结果与讨论

2.1 金针菇菌丝体的生长曲线

如图1所示，金针菇菌丝接种后，生物量从第1～6天呈线性上升趋势，这是由于金针菇菌丝体在种子培养基中预培养7 d，因此转接后几乎没有滞后期；第6～8天进入快速的对数增长阶段，第8天以后进入平稳阶段。而金针菇发酵液中的残糖含量一直在下降，并在第7天降至最低。由图1可知，金针菇菌丝在转接后第7天时生长最为旺盛，之后随着碳源消耗殆尽，菌丝的生长进入稳定期，因此选择发酵至第7天的菌体进行之后的实验。

2.2 纳米银颗粒的合成

2.2.1 最大吸收波长及标准曲线

将FV-CFF与AgNO3溶液加热反应后出现明显的棕褐色(纳米银特征颜色)，且溶液澄清。初步分析，FV-CFF具有一定的还原力，可以将Ag+还原为0价纳米银。此外，溶液中还具有可以起稳定作用的大分子成分，因此生成的溶液并无单质银沉淀产生。配制不同浓度的AgNPs标准溶液，扫描最大吸收波长为415 nm，测定415 nm处纳米银标准曲线为y=6.884 9x+0.043 6，R2=0.999 4。

2.2.2 FV-CFF及AgNO3添加比例的确定

如图2-a所示，在FV-CFF添加比例为5%～50%，合成的AgNPs浓度呈线性增加的趋势，在FV-CFF添加总比例50%时，AgNPs浓度为0.31 mmol/L；此后AgNPs增加趋势减缓。因此接下来的实验中，选用FV-CFF添加总比例为50%。固定FV-CFF添加比例为50%，探讨不同AgNO3添加浓度对AgNPs生成的影响，结果如图2-b所示，随反应体系中AgNO3浓度升高，AgNPs浓度逐步上升，当反应体系中AgNO3浓度达到0.9 mmol/L时，AgNPs产量达到0.30 mmol/L，之后AgNPs产量趋于稳定，增长不显著。因此，在后续实验中，选用AgNO3终浓度0.9 mmol/L。

2.2.3 pH对FV-CFF合成纳米银的影响

如图3-a所示，pH对FV-CFF合成AgNPs的效果影响显著，在pH低于5时，合成能力较弱，且随pH的增高，AgNPs增加幅度较小，而在pH 5～11，AgNPs的合成基本呈线性增加趋势，在pH 11时达到最高，为0.58 mmol/L。在pH 11.0条件下，于100 ℃加热，5～10 min内AgNPs产量迅速升高，10 min后AgNPs产量增长减缓，20 min时AgNPs产量便已达到最大值，之后趋于稳定(图3-b)，但合成的纳米银溶液有较多黑色沉淀产生。

进一步优化发现，在pH 11时反应体系的最佳添加量为：AgNO3浓度0.6 mmol/L，FV-CFF(pH 11)添加比例15%。

2.2.4 冻融前后FV-CFF合成纳米银的动力学生成曲线

根据2.2.2小节中确定的FV-CFF添加量及AgNO3浓度，测定初始pH下(即pH 7.22)AgNPs的动力学生成曲线，实验结果如图4-a所示。为了考察FV-CFF中成分对AgNO3还原效果的影响，将发酵液进行冷冻，融化后发现有絮状物漂浮于液面，离心除去絮状不溶物，取上清液依照上述实验条件测定AgNPs的动力学生成曲线，实验结果如图4-b所示。

由图4可知，等温热处理过程中，冻融前后样品中AgNPs含量均随热处理时间的延长而升高，其升高速率随热处理温度的升高而加快。2组样品中AgNPs的生成反应，表观上均遵循零级反应动力学模型Ct=C0+k·t，根据动力学曲线拟合方程得出各曲线的参数如表1所示。

2.2.5 冻融前后FV-CFF在pH 11时合成纳米银的动力学反应

为考察pH 11时FV-CFF对AgNPs生成的影响，根据2.2.3小节实验中确定的FV-CFF添加量及AgNO3浓度(即AgNO3浓度0.6 mmol/L，FV-CFF添加比例15%)，取冻融前后的FV-CFF调pH11后与AgNO3进行反应，测定AgNPs的动力学生成曲线。如图5所示，初始FV-CFF(pH 11)在50～90 ℃范围内合成AgNPs的反应均遵循零级动力学模型，即Ct=C0+k·t，而100 ℃时产物呈对数增长趋势。冻融除去絮状不溶物后，AgNPs的生成反应动力学则均遵循零级动力学模型。因此2组样品的动力学曲线仅按照50～90 ℃的数据拟合方程，得出各曲线的参数如表2所示。

根据阿累尼乌斯方程k=kf ·exp(-Ea/RT)，将上述4种不同反应体系以1/T vs lnk作图，结果如图6和表3所示，其中，C0是AgNPs的初始含量，Ct是AgNPs的含量，单位为mmol/L；T是热力学温度，单位为K；R是摩尔气体常量，8.314472 J/(mol·K)；k为速率常数，单位为h-1；kf是频率因子；Ea为活化能。以样品I为例(表3)，AgNPs生成反应的速率常数与热处理温度的对数关系式为lnk=-11 902(1/T)+31.362，其对应的指数关系式为k=e31.362·exp(-11 902/T)=4.17×1013·exp(-98.96/RT)，符合阿累尼乌斯方程k=kf ·exp(-Ea/RT)，其表观频率常数kf = 4.17×1013h-1，表观活化能Ea=98.96 kJ/mol。

结果表明，4个反应体系都是零级反应(表3)，此时，反应物浓度不是影响化学反应的决定因素。因此，虽然在pH提高到11时，降低了反应物的浓度，但不会影响AgNPs的生成速度。由此可知，造成4个样品中表观速率常数和表观活化能不同的因素，应当与冻融前后除去的成分以及pH的变化有关。

样品I比样品II活化能低，说明冻融前初始FV-CFF更容易生成AgNPs。初步推断，冻融后除去的絮状不溶物中含有对AgNPs生成起重要作用的成分。而通过pH对AgNPs生成的影响发现，pH 11条件下生成AgNPs的产率最高，但是此时(样品III)表观活化能却最高，为119.82 kJ/mol，说明pH的升高影响了FV-CFF中的还原成分，使其反应难度升高，但反应效率大大提升。而冻融后的样品尽管离心除去了絮状不溶物，但在pH 11(样品IV)时的表观活化能却是最低的，仅为80.21 kJ/mol，说明pH的提高大大增加了FV-CFF中剩余组分的还原力，使反应更容易发生。

2.3 FV-CFF的成分分析及还原力测定

2.3.1 冻融前后FV-CFF的成分分析

通过对冻融前后的FV-CFF样品进行成分分析可知(表4)，初始FV-CFF样品(即样品I)中总蛋白、总糖及可溶性固形物含量均高于冻融后除去不溶物的FV-CFF样品(即样品II)。样品II中总蛋白和总糖含量降低明显，分别减少了22.24%和11.56%，结合可溶性固形物的含量变化(降低37.74%)可知，冻融后除去的絮状不溶物主要为蛋白质和多糖等大分子组分，这可能是导致样品II反应生成AgNPs活化能升高的主要原因。由表4还可看出，样品中还原糖含量较低，仅为4 μg/mL左右，且冻融对还原糖含量的影响不显著。

2.3.2 冻融及pH对FV-CFF还原力的影响

冻融及pH对FV-CFF还原力的影响如图7所示，样品I和样品II的还原力分别为0.075和0.073，说明冻融实验虽然除去了较多蛋白和多糖等大分子可溶性固形物(表4)，但起还原作用的主要成分并未受到显著影响，因此冻融前后FV-CFF样品(pH 7.22)的还原力几乎没有变化。但是，pH的升高则显著提升了FV-CFF样品的总还原力，在pH 11时样品III和样品IV的还原力分别提升至0.20和0.18，说明碱性pH显著激活了FV-CFF中起还原作用的成分，使其还原力大幅提升。

2.4 产物AgNPs的表征

2.4.1 不同条件下生成AgNPs的UV-Vis光谱特征

由图8可知，冻融实验虽然会对FV-CFF生成AgNPs的能力产生显著影响，但不会改变产物的吸收波长，而pH的变化则可明显降低产物AgNPs的最大吸收波长。pH 11时，AgNPs的最大吸收波长由pH 7.22时的442 nm降低为411 nm，接近标品的UV-Vis吸收。

2.4.2 产物AgNPs的形貌

采用TEM观测不同条件下FV-CFF与AgNO3反应生成AgNPs的形貌特征，结果如图9所示。通过ImageJ软件分析图中颗粒尺寸可知，样品I和样品II反应产物的粒径范围均在2.2～10.5 nm，平均粒径分别为5.5和5.4 nm。样品III反应产物的平均粒径最大，为5.6 nm，但粒径范围相对较小，为2.9～9.4 nm；样品IV反应产物的平均粒径最小，为4.8 nm，但分布范围最广(1.5～10.1 nm)。此外，由图9可知，不同FV-CFF样品反应生成的AgNPs颗粒虽然多数为球形，但也有部分不规则的椭球形和多边形存在。这些纳米颗粒多数以少量聚集的状态存在，而且聚集颗粒的边缘可观测到明显的浅灰色暗影，推测是FV-CFF中的大分子成分起到了稳定剂的作用，使AgNPs在溶液中以聚集态存在。

2.4.3 样品及产物的粒度分布

产物溶液的粒径分析结果(表5)与TEM结果差异较大，这是由于FV-CFF中的大分子成分在溶液状态具有良好的分散和水化作用，使检测结果偏大。此外，由TEM分析可知，由于FV-CFF中大分子的包裹和稳定作用，AgNPs存在颗粒聚集的情况，在溶液状态下易被作为一个整体的颗粒测定，因此最终测定的粒径均大于TEM中观测到的单个纳米颗粒的粒径。

反应前不同FV-CFF溶液的平均粒径显著高于相应样品反应后的结果，说明FV-CFF在与AgNO3加热反应的过程中不仅生成了AgNPs，还使原来溶液中较大颗粒的成分紧密地包裹在银纳米颗粒的周围，起到了稳定作用，因此所生成的溶液无聚沉现象。反应后所生成的AgNPs溶液的平均粒径随pH升高而显著降低，而冻融实验则对产物平均粒径的影响不显著，说明碱性环境能降低FV-CFF中大分子成分之间的聚集，使溶液体系中的颗粒尺寸更低，也更为稳定。pH 11时FV-CFF反应生成AgNPs的Zeta电位值均高于pH 7.22时，颗粒之间存在更强的静电排斥[7]，表明pH 11时制备的AgNPs具有更好的稳定性。此外，反应后生成的AgNPs溶液的多分散系数PDI均大于0.4，说明AgNPs溶液虽然具有良好的稳定性，但属于多分散体系[16]，这与TEM分析结果(图9)一致。

3 结论

本研究选用金针菇菌丝体作为研究对象，采用液态发酵的方式，探究AgNPs的合成效果及影响因素。结果显示，FV-CFF对AgNO3具有明显的还原效果，可生成棕褐色AgNPs稳定溶液。此外，pH对FV-CFF生成AgNPs具有显著的影响，在pH 5～11范围内，AgNPs的产量基本呈线性增加趋势。通过等温动力学实验发现，较高的pH对无菌水发酵液生成AgNPs具有显著的提高效果，而冻融后除去的絮状不溶物也对AgNPs的合成具有一定贡献。本实验合成AgNPs所用的还原剂及稳定剂为金针菇的无细胞滤液(FV-CFF)，主要成分除蛋白质和碳水化合物外还含有许多未知组分，可采用可溶性固形物含量进行定量。冻融前后的成分分析及还原力测定结果显示，冻融后除去的絮状不溶物对还原力的影响有限。而pH升高至11时，还原力则大幅提升，使所生成的AgNPs具有较低的紫外可见吸收波长(411 nm)和较小的溶液粒径(～35 nm)，而冻融实验对这两方面的影响较小。本研究合成AgNPs的方式简单、安全、环保，且具有反应条件温和、易于实现的优势，对于进一步解析金针菇发酵产物合成稳定AgNPs的机制具有重要的指导作用。然而，金针菇无细胞滤液中成分较为复杂，当前研究虽然发现其具有良好的AgNPs合成和稳定效果，但仍未能确认其中起还原作用的关键物质，今后需进一步分析并确认该成分，并解析其还原力受pH影响的机制。

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Synthesis of silver nanoparticles using cell-free filtrate of Flammulina velutipes

ZHU Yujie,DAI Anran,LI Jiaming,WU Fan,YANG Chongjing,CHEN Lei*

(Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology,Ministry of Education,School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

ABSTRACT The cell free filtrate of Flammulina velutipes (FV-CFF) obtained by two-stage fermentation was used for the synthesis of silver nanoparticles (AgNPs) and their effects were studied. The results showed that FV-CFF acted on AgNO3 to produce stable brown AgNPs solution, and AgNPs production was increased with pH elevation. The reducing power of FV-CFF on AgNO3 was significantly inhibited at pH<5, but exhibited a linear growth trend within the pH range of 5-11. The kinetic curve of AgNPs synthesis was acquired by determining AgNPs generation using FV-CFF at normal pH (7.22) and pH 11, respectively. The effect of freezing and thawing was also compared by calculating the formation kinetic curve. The apparent activation energy (Ea) obtained was 98.96 kJ/mol (pH 7.22, initial), 106.725 kJ/mol (pH 7.22, thawed), 119.82 kJ/mol (pH 11, initial), 80.21 kJ/mol (pH 11, thawed), respectively. The results of composition and reducing power determination showed that although freeze-thaw could remove a mass of proteins and carbohydrates in FV-CFF, it had a relatively low effect on reducing power. However, the increasing pH could significantly improve the reducing power of FV-CFF, and the maximum absorption wavelength and particle size of synthesized AgNPs were also significantly reduced at pH 11. The present results will be contributed to further analysis of AgNPs synthesis mechanism by F. velutipes.

Key words Flammulina velutipes; liquid fermentation; cell-free filtrate; silver nanoparticles; biosynthesis

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.024862

引用格式:朱雨婕，代安然，李佳铭，等.金针菇无细胞滤液合成纳米银颗粒[J].食品与发酵工业,2021,47(5):71-78.ZHU Yujie,DAI Anran,LI Jiaming,et al.Synthesis of silver nanoparticles using cell-free filtrate of Flammulina velutipes[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(5):71-78.

第一作者：本科生(陈磊副研究员为通讯作者，E-mail：biolchen@163.com; leichen@jiangnan.edu.cn)

基金项目：国家自然科学基金项目(21706094)；江苏省自然科学基金项目(BK20170176)；江苏省“双创博士”项目(2017)

收稿日期：2020-06-27，改回日期：2020-09-10