在全世界各地区人群中都存在不同程度的乳糖酶缺乏，而且有明显的种族差异[1]。据调查，我国汉族成人乳糖不耐症发生率为75%～95%，少数民族亦有76%～95.5%[2]。肖玉桦等[3]用氢呼气试验测定健康成人乳糖吸收不良发生率为92%。杨月欣等[4]在北京、上海、广州和哈尔滨四大城市，从3～13岁儿童中随机抽样，87%的儿童乳糖酶活性下降的年龄在7～8岁，且我国其他地区儿童乳糖酶缺乏的发生率也较高。
酸奶在发酵前进行热处理会产生一系列复杂的变化[5-8]：(1)美拉德反应使原料乳中风味物质变化，进而影响酸奶产品的风味；(2)减少了致病菌和有害微生物的数量；(3)致使微观结构改变并对酸奶宏观特性有显著影响。热处理温度低的酸奶凝胶呈现出含有较大酪蛋白颗粒的弯曲状团聚网络结构，这是由于未变性的乳清蛋白没有参与凝胶网络的形成。经过热处理的酸奶凝胶具有更加致密，相互交联的蛋白质网络结构，原因是乳清蛋白发生部分变性或者全部变性，会参与网状结构的形成，这增加了蛋白之间的交联，此结构中的孔径更小，可以使颗粒重排现象减少[9],从而导致酸奶的贮藏稳定性、风味释放、质地以及流变学等特性发生变化。
本论文旨在讨论热处理对无乳糖酸奶理化性质的影响，同时与普通酸奶在表观黏度、色度、滋味、气味、贮藏稳定性以及微观结构等方面进行比较。
1 方法与材料
1.1 试剂与仪器
全脂乳粉，双城雀巢有限公司；白砂糖，广西上上糖业有限公司；747型发酵剂，普尔斯(天津)国际贸易有限公司；Maxilact乳糖酶，Royal DSM公司。
Astree Ⅱ型电子舌、Heracles Ⅱ型电子鼻、DW-86L729型超低温保存箱(-80 ℃)，法国Alpha M.O.S公司；EVO 18型扫描电子显微镜，德国卡尔蔡司公司；SC-15型数控超级恒温槽、Scientz-50 N型真空冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；MCR 301型流变仪，Physica公司，HunterLab测色仪，美国HunterLab公司；紫外分光光度计，HITACHI日立仪器公司；Bayer LactoMonitor乳糖测定仪，德国拜耳公司。
1.2 实验方法
1.2.1 无乳糖酸奶的制作工艺
水预热(50 ℃)→复原乳(全脂乳粉11.0%，白砂糖6.0%，均为质量分数)→均质(15 MPa)→热处理→冷却降温(40 ℃)→接入发酵剂与乳糖酶→搅拌(10 min)→ 密封保温发酵(42 ℃，6 h)→冷藏保存(4 ℃)
热处理：分别采用65 ℃、30 min，75 ℃、15 min，85 ℃、10 min，95 ℃、5 min处理，普通酸奶生产中的热处理条件为85 ℃、10 min。
发酵剂与乳糖酶：发酵剂添加量为0.06 g/kg，加酶量为2 500 U/g。
1.2.2 乳糖测定
取1 μL待测试样置于乳糖仪试纸的电极上，等待5 s后读数。
1.2.3 表观黏度的测定
参照王松松等[10]的方法。采用MCR 301流变仪，取少量酸奶样品于流变仪的测定平台上，选取探头为pp50，直径25 mm的锥板，恒定温度为25 ℃，测定样品表观黏度与剪切应力在0～1 000 s-1过程中的变化。
1.2.4 滋味测定
参照马长路等[11] 的实验方法，采用电子舌进行分析。首先进行预平衡、校准，然后称取 40.0 g酸奶样品，用超纯水进行二倍稀释后，置于电子舌专用测试杯中，进行滋味的检测和数据采集，每个酸奶样品采集时间为 120 s，清洗时间为10 s，每个样品重复测试3次，进行主成分分析和味觉强度分析。
1.2.5 气味的测定
采用电子鼻对样品的气味进行分析[12]。精确称取7.0 g样品于20 mL顶空瓶中，在45 ℃的条件下孵化20 min，振荡速度为 500 r/min。进样量5 000 μL，注射速度125 μL/s。进样口温度为200 ℃、压力10 kPa、流速30 mL/min、注射时间45 s。采用正构烷烃标准品进行化合物标定，利用化学数据库，根据色谱图相，以峰高和峰面积确定化合物与相对含量。
1.2.6 色度测定
使用HunterLab测色仪对酸奶样品进行色度分析[13]。先进行黑板校准，黑玻璃或黑光阱用于定反射率的底，然后用白板校准，标准白板用于定反射率的顶。每个样品取3个平行测定，其中 L*，a*，b*可直接读出，按照公式(1)计算ΔE值:
(1)
式中：L*，明度；a*，红色度；b*，黄色度。
1.2.7 贮藏稳定性的评定
1.2.7.1 悬浮稳定性
取酸奶样品3 g，稀释80倍。在波长540 nm处，测得样品吸光度记为A1。然后取酸奶50 mL，于4 000 r/min离心10 min，取上层乳液，在波长540 nm处测得吸光度记为A2。按公式(2)计算悬浮稳定性， R值越大，说明酸奶样品的悬浮稳定性越好[14]:
(2)
式中：R,酸奶稳定性；A1,样品吸光度；A2,离心后吸光度。
1.2.7.2 持水性
准确称取30 g酸奶样品，在4 000 r/min离心15 min，静置10 min后，弃去上清液，根据公式(3)计算样品持水性[15]:
持水性
(3)
式中：m0，离心管质量；m1，样品质量；m2，离心弃上清液后样品质量。
1.2.8 酸奶微观结构的评定
采用EVO 18扫描电子显微镜，对不同热处理下的无乳糖酸奶的超微形貌特征进行观察，同时与普通酸奶对比。取一定量酸奶样品，置于-18 ℃冰箱里，预冻7 h之后，在-80 ℃超低温保存箱中冷冻4 h，取出后立即进行24 h冻干，再将冻干的酸奶样品镀金膜，抽真空后，在10.0 kV电压下进行扫描电镜测试[16]。
1.2.9 数据处理
本实验数据用 Origin 8.0和Excel作图。电子鼻、电子舌的数据用SPSS Statistics 23.0进行单因素以及主成分分析。
2 结果与分析
2.1 酸奶中乳糖含量分析
普通酸奶及不同温度热处理的无乳糖酸奶的乳糖残留如表1所示。在添加乳糖酶的酸奶样品中，乳糖残留量低于0.5%达到了无乳糖的标准[17]。由于乳糖酶在热处理完成后添加，所以不同的热处理温度对同一乳糖酶添加量的酸奶的乳糖残留量没有显著影响。
表1 普通酸奶与不同热处理无乳糖酸奶的乳糖残留量
Table 1 Lactose residue in normal yoghurt and lactose-free
yoghurt with different heat treatment
酸奶类型*P8565758595乳糖残留量/%3.2±0.150.3±0.060.3±0.060.2±0.150.3±0.10
注：酸奶类型*，P85指热处理温度为85 ℃普通酸奶；65、75、85、95分别对应65、75、85、95 ℃热处理的无乳糖酸奶(下同)
2.2 不同热处理温度对无乳糖酸奶表观黏度的影响
普通酸奶与无乳糖酸奶的表观黏度和剪切速率关系均有着相似的趋势(图1)。当剪切速率为0.03 s-1时，表观黏度达到了最大值，随着剪切速率的增加，表观黏度随之降低，无乳糖酸奶表观黏度普遍高于普通酸奶。SKATARZYNA等[18]认为,将乳糖分解成单糖可以改善酸奶的流变特性和黏度。95 ℃的无乳糖酸奶表观黏度较高。其原因是乳清蛋白含有大量的二硫键和巯基，在加热的过程中，β-乳球蛋白的球状结构打开，导致疏水基团暴露，乳清蛋白会通过巯基和二硫键在分子层面上的交换，β-乳球蛋白形成聚集体，使得蛋白的网路更加紧密，从而提高无乳糖酸奶的表观黏度[19]。另外，随着剪切速率的增加，所有样品的表观黏度急剧下降，原因是高速的剪切会引起“摇溶”现象。因此，随着剪切速率的增加，酸奶的表观黏度显著降低[20]。
图1 普通酸奶与不同热处理温度下的无乳糖酸奶流变特性
Fig.1 Rheological properties of normal yogurt and lactose-free
yogurt at different heat treatment temperatures
2.3 不同热处理温度对无乳糖酸奶滋味的影响
通过主成分分析，普通酸奶和无乳糖酸奶之间的滋味有着显著的差异(图2)。在苦味、咸味、甜味方面，经过热处理的无乳糖酸奶要低于普通酸奶，这是因为无乳糖酸奶乳糖含量比普通酸奶低，与普通酸奶相比，美拉德反应程度较小[21]。
图2 普通酸奶与不同热处理无乳糖酸奶滋味主成分分析图
Fig.2 Principal component analysis of taste of normal yogurt and
lactose-free yogurt with different heat treatment
不同热处理温度对无乳糖酸奶的滋味有着比较显著的影响。95 ℃条件下热处理5 min的样品酸味，甜味比较突出，但是鲜味不足(图3)。综合比较不同热处理温度下的样品，温度为75 ℃时，风味表现最协调。
图3 热处理对普通酸奶与无乳糖酸奶滋味的影响
Fig.3 Effect of heat treatment on the taste of normal
yogurt and lactose-free yogurt
2.4 不同热处理温度对无乳糖酸奶气味的影响
无乳糖酸奶和普通酸奶之间气味没有显著性差异(图4)。主要的挥发性香气由丙酮、乙醛、2,3-丁二酮、2-丁酮等组成。在酸奶样品中，丙酮强度较高，除了原料中含有丙酮外，乳酸菌代谢葡萄糖也会产生丙酮。2,3-丁二酮具有奶香味，且风味阈值较低，低浓度的2,3-丁二酮能够赋予酸奶奶油的香味[22]，OTT等[23]的研究发现，在牛乳的发酵过程中，乙醛和丁二酮等物质的含量显著增加，赋予了酸奶独特的风味。普通酸奶和无乳糖酸奶风味没有显著性差异，原因也是由于主要的风味物质受乳糖的影响较小。
图4 普通酸奶与无乳糖酸奶气味对比
Fig.4 Comparison of odor between ordinary
yoghurt and lactose-free yogurt
注：图中普通酸奶谱图由实际值取相反数得到
在气味上，不同温度处理的无乳糖酸奶无显著性差异(图5)，主要风味也是由丙酮、乙醛、2,3-丁二酮、2-丁酮贡献。
图5 不同热处理温度下的无乳糖酸奶气味对比
Fig.5 Odor comparison of lactose-free yoghurt under
different heat treatment temperatures
2.5 不同热处理温度对无乳糖酸奶色度的影响
无乳糖酸奶与普通酸奶之间色差无显著差别(表2)，不同的热处理温度也对无乳糖酸奶的色差没有显著的影响，其原因是热处理时间较短，美拉德反应最终阶段产生的类黑精积累较少[24]。乳糖对酸奶颜色的贡献程度较低，这也使得无乳糖酸奶和普通酸奶色度上差别不大。由于处理时间较短，不同热处理温度的无乳糖酸奶在色度上没有显著性差别。
表2 不同热处理温度对无乳糖酸奶色度的影响
Table 2 Effect of different heat treatment on color
of lactose free yoghurt
酸奶类型*L*a*b*ΔEP8585.22±0.30a-1.77±0.02a8.84±0.03b85.70±0.30a6585.07±0.35a-1.75±0.03a8.80±0.05b85.55±0.35a7585.29±0.23a-1.74±0.01ab8.70±0.04a85.76±0.23a8585.32±0.25a-1.77±0.04a8.83±0.06b85.80±0.26a9585.03±0.44a-1.70±0.02b8.88±0.07b85.51±0.44a
注：角标含有相同字母的每列数据之间差异不显著(P>0.05)，不含相同字母差异显著(P<0.05)
2.6 不同热处理温度对无乳糖酸奶贮藏稳定性的影响
无乳糖酸奶与普通酸奶相比，无乳糖酸奶的持水性和悬浮稳定性较好(图6)，原因是乳糖在乳糖酶的作用下分解成葡萄糖和半乳糖，半乳糖属于胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)[25]。根据KRUIF等[26]的报道，如果胞外多糖的含量不能完全覆盖蛋白时，一个胞外多糖可以连接在几个蛋白表面，从而发生复凝聚。因此，酶解无乳糖酸奶的稳定性要优于普通酸奶。
a-普通酸奶与无乳糖酸奶的持水性比较；
b-普通酸奶与无乳糖酸奶的悬浮稳定性比较
图6 普通酸奶与无乳糖酸奶的贮藏稳定性
Fig.6 Storage stability of plain yogurt and lactose-free yogurt
随着热处理温度的上升，无乳糖酸奶的持水性增加(图7)，悬浮稳定性总体上也是随着温度的增加而增加。其原因是，当热处理温度升高时，乳清蛋白由于发生多肽链的去折叠导致变性，使结构内部的侧链基团暴露，使其与酪蛋白发生交联[27]，因此，热处理温度高的无乳糖酸奶持水性和悬浮稳定性增加。
图7 不同热处理温度下无乳糖酸奶的贮藏稳定性
Fig.7 Storage stability of lactose-free yogurt under
different heat treatment
2.7 不同热处理温度对无乳糖酸奶微观结构的影响
通过扫描电镜可以观察无乳糖酸奶和普通酸奶放大12 000倍后的微观结构(图8)，无乳糖酸奶的微观结构比普通酸奶更加致密，这个结果能较好地佐证无乳糖酸奶比普通酸奶有着更好的表观黏度和贮藏稳定性。
a-85 ℃,10 min热处理下普通酸奶；
b-85 ℃,10 min热处理下无乳糖酸奶
图8 普通酸奶与无乳糖酸奶扫描电镜图
Fig.8 Scanning electron micrographs of plain yogurt
and lactose free yogurt
不同热处理无乳糖酸奶扫描电镜(×12 000)如图9所示，热处理温度越高，样品的结构也越来越致密，微观结构的改变对酸奶宏观特性有显著影响。经过65 ℃、30 min热处理的酸奶形成的凝胶呈现出含有较大酪蛋白颗粒的弯曲状团聚网络结构，是因为热处理温度不高时，乳清蛋白变性程度小，变性的乳球蛋白结合在酪蛋白上，呈现不规则的链球状，有着比较高的表面疏水性。经过75 ℃、15 min，85 ℃、10 min热处理的酸奶凝胶的团聚网络结构变得紧密。经过95 ℃、5 min热处理的酸奶凝胶结构变得几乎没有空隙，这是由于热处理温度得到增加，α-乳白蛋白开始变性，覆盖在乳球蛋白上，使得表面越来越光滑，疏水性降低，增加了蛋白质的持水性[28]。
a-65 ℃,30 min热处理下无乳糖酸奶；
b-75 ℃,15 min热处理下无乳糖酸奶；
c-85 ℃,10 min热处理下无乳糖酸奶；
d-95 ℃,5 min热处理下无乳糖酸奶
图9 不同热处理温度的无乳糖酸奶扫描电镜图
Fig.9 Scanning electron micrographs of lactose free yoghurt with
different heat treatment temperatures
3 结论
在乳糖酶的作用下，酸奶中胞外多糖的含量增加，提高了酸奶的表观黏度和稳定性。同时，不同热处理温度会对无乳糖酸奶的宏观特性及微观结构产生影响。滋味上，无乳糖酸奶在苦味、咸味、甜味上要低于普通酸奶，经过75 ℃、15 min热处理的无乳糖酸奶风味表现最为协调；不同热处理的无乳糖酸奶与普通酸奶之间在气味和色度表现上无显著性差异。随着热处理温度的上升，酸奶持水性与悬浮稳定性也随之增加。温度上升导致酸奶凝胶网络结构交联度更大、更致密，孔隙变得更小，有利于持水。由于美拉德反应的存在，过高的温度对无乳糖酸奶的滋味产生影响。综合比较，无乳糖酸奶最佳热处理条件为75 ℃、15 min。该结论对实际生产具有一定的指导意义。
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