白鲢(Hypophthalmichthys molitrix)为我国四大淡水鱼之一，2018年的产量达到385.9万t[1]。白鲢主要栖息于江河干流及附属水体的上层，以浮游植物为食，具有生长速度快、繁殖能力强、抗病性强、价格低等优点[2]。白鲢鱼肉富含蛋白质、多不饱和脂肪酸和维生素，肉质细腻易消化，在满足人们生活需求和丰富膳食结构等方面有重要作用[3-4]。但白鲢具有较重的土腥味和鱼腥味等缺点，降低了消费者对白鲢的可接受性，这严重制约了白鲢加工产业的发展[5]。淡水鱼的腥味物质主要来源是鱼体吸附环境中微生物产生的次生代谢产物，以及多不饱和脂肪酸和氧化三甲胺在微生物和内源酶的作用下氧化分解，生成具有强烈腥味的醛酮类物质和三甲胺(trimethylamine，TMA)[6]。目前针对鱼肉的脱腥方法主要有物理法、化学法和生物法。其中，生物法主要为发酵脱腥法，但发酵过程中会产生其他气味，会影响鱼肉本身的风味，适用于发酵鱼制品，应用范围受限。化学法包括有机溶剂萃取法和酸碱盐法等，操作简单且具有较好的脱腥效果，但易造成化学物质残留，对水产品品质影响较大[7]。随着消费者保健意识的增强，绿色纯天然的脱腥剂将越来越受到关注。迷迭香提取物富含迷迭香酸等活性成分，具有抑菌、抑制脂肪氧化和改善食品风味等优点[8]。姚晓波等[9]发现迷迭香提取物对鲈鱼进行浸泡处理后，鲈鱼中己醛等腥味物质含量降低并有效改善了鲈鱼的风味。MARTINEZ-ZAMORA等[10]研究表明迷迭香提取物可以有效降低鱼肉饼中的TMA含量和改善鱼肉饼的风味。
本文以白鲢为研究对象，选用迷迭香提取物浸泡液对白鲢鱼肉进行浸泡脱腥处理，以感官评价、TBA值和TMA值作为脱腥效果评价指标，同时，采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(HS-SPME-GC-MS)技术测定白鲢鱼肉脱腥前后挥发性成分的变化情况，旨在寻找一种方便快捷和安全高效的白鲢鱼肉脱腥方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
白鲢(1.40～1.50 kg)，购于重庆市北碚区永辉超市，将活鱼带水运输到实验室，及时宰杀处理。迷迭香提取物(食用级)，购于西安圣青生物科技有限公司。
分析纯试剂：三氯乙酸、碳酸钾和无水甲苯，成都市科隆化工试剂厂；2-硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)，源叶生物有限公司；1,1,3,3-四乙氧基丙烷，山东西亚化学有限公司；苦味酸，台山市众城化工有限公司；三甲胺盐酸盐，阿拉丁试剂(上海)有限公司。色谱纯试剂：2-辛醇(99.5%，内标)，阿拉丁试剂(上海)有限公司。
1.2 仪器与设备
DF-101S 型磁力搅拌器，河南予华仪器有限公司；SQP 电子分析天平，德国赛多利斯科学仪器有限公司；Synergy H1 全功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；固相微萃取装置(配有50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头)，美国 Supelco 公司；QP 2010 型气相色谱-质谱联用仪，日本岛津公司。
1.3 方法
1.3.1 样品预处理
将新鲜白鲢宰杀，“三去”(去头、去鳞、去内脏)，清水清洗干净后切成2 cm×2 cm×1 cm的方块，用迷迭香提取物浸泡液对白鲢鱼肉进行浸泡脱腥处理，完成后进行TBA值、TMA值和腥味值测定。
1.3.2 迷迭香提取物浸泡脱腥处理的单因素试验
随机选取预处理后的白鲢鱼肉块，称重，然后进行迷迭香提取物的脱腥浸泡试验。称取一定量的白鲢肉去腥，分别研究了不同浓度的迷迭香提取物浸泡液(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L)、不同料液比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6，g∶mL)、不同浸泡时间(0、20、30、40、50、60 min)对白鲢鱼肉TBA值、TMA值以及腥味值的影响。
1.3.3 Box-Benhnken 试验设计
结合单因素试验的结果，根据 Box-Benhnken 的中心组合实验设计原理，以迷迭香提取物质量浓度、料液比、浸泡时间为响应变量，以TBA值、TMA值、腥味值为响应值进行响应面优化试验。Box-Benhnken 试验因素水平表见表1。
表1 Box-Benhnken 试验因素与水平表
Table 1 Box-benhnken response surface and test factor level table
水平因素浸泡液质量浓度(X1)/(g·L-1)料液比(X2)(g:mL)浸泡时间(X3)/min-11.01∶23001.51∶34012.01∶450
根据表1的试验设计及各因素水平，运用Design-Expert (Version 8.0.6)产生17组相关试验，其中5个为中心点实验，12个为析因实验，具体实验设计列于结果部分(表2)。同时运用上述软件对实验数据进行回归分析，按公式(1)拟合出多元二次数学回归模型：
(1)
式中：Y为试验响应值(TBA值、TMA值和腥味值)；β0、βi、βii和βij分别为常数项、一次项、二次项和交互项的系数；Xi和Xj为独立变量的因素编码(i≠j)；XiXj和
分别为试验因子之间的交互组合和二次组合。
1.3.4 评价指标的测定
1.3.4.1 TBA值测定
参考NIAN等[11]的方法，称取2 g脱腥前后的白鲢鱼肉，置于50 mL离心管中，加入5%三氯乙酸溶液20 mL，常温下静置30 min，离心(7 500 r/min，10 min)，后取上清液，上清液用超纯水定容到50 mL。然后取5 mL上述溶液于试管中，加入5 mL的TBA(0.02 mol/L)振荡混匀，置于沸水浴中20 min，结束后冷却至室温，反应液在532 nm处测定吸光值，并作空白试验。以1,1,3,3-四乙氧基丙烷制备标准曲线，结果表示为mg 丙二醛(malondialdehyde，MDA)/kg样品。
1.3.4.2 TMA值测定
参考YU等[12]的方法，称取3 g脱腥前后的白鲢鱼肉样品，置于50 mL离心管中，加入7.5%三氯乙酸溶液27 mL，离心(8 000 r/min，10 min)后取上清液，上清液用超纯水定容到50 mL。然后取5 mL上述溶液与1 mL甲醛溶液，10 mL甲苯和3 mL饱和碳酸钾溶液振荡混匀，常温下静置20 min。取5 mL上层甲苯溶液于试管中，加入0.02%苦味酸甲苯溶液5 mL，将其充分混匀，在410 nm处测吸光值，并做空白试验。以三甲胺制备标准曲线，结果以mg/kg样品表示。
1.3.4.3 腥味值测定
(1)感官评价人员的选择
在西南大学食品科学学院招募志愿者，将三甲胺稀释为不同浓度梯度(10～1 000 mg/L)的供试液，测试受评人员(身体健康，无嗅觉障碍)的腥味敏感度，最终筛选出8名嗅觉灵敏的感官分析人员(4男4女，年龄20～28岁)。对这些感官评价人员进行定期感官评定训练，使他们熟悉嗅觉语言和嗅觉评价方[13]。
(2)感官评价方法
参照SHOKRI等[14]的方法并做适当修改，感官评价人员对鱼肉的腥味进行5分制感官评定。以100 mg/L的TMA水溶液为标准参照，定义腥味强度为5分。气味强度进行如下评级：1，非常微弱；2，弱；3，正常；4，强劲；5，非常强劲。
1.3.4.4 挥发性成分测定
取3 g鱼肉置于20 mL螺口顶空样品瓶中，再向瓶内加入100 μg/mL的2-辛醇标准品1 μL作为内标物，最后加入7 mL的250 g/L的NaCl溶液及磁转子，密封。将已活化好的DVB/CAR/PDMS萃取头插入顶空瓶当中，在60 ℃下平衡15 min后开始萃取，相同条件顶空吸附30 min，萃取完成后在GC-MS进样口解吸5 min，进行气质测定。
气相色谱条件：采用DB-5MS毛细管(30 m×0.25 mm，0.25 μm)色谱柱。升温程序：柱初温度40 ℃，保持2 min，先以5 ℃/min升温到150 ℃，1.5 ℃/min升温到165 ℃，再以15 ℃/min升温到210 ℃，最后以10 ℃/min升温到250 ℃，保持5 min，进样口温度250 ℃；载气(氦气)流速为1.2 mL/min。
质谱条件如下：接口温度280 ℃；电子能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；质量扫描范围：30～500 m/z。
样品中各挥发性成分的含量Ci(μg/kg)按公式计算：
(2)
式中：ρ，内标物的质量浓度，μg/mL；V，内标物体积，μL；Si，各挥发性组分的峰面积；S，内标物质的峰面积；m，样品的质量，g；1 000，换算系数。
1.4 数据统计与分析
每个样品3次重复测定，采用SPSS 19.0进行ANOVA单因素方差分析及Ducan检验(P<0.05)，以平均值±标准偏差表示。图表绘制采用Origin 8.6软件。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果与分析
2.1.1 迷迭香提取物浓度对白鲢鱼肉脱腥效果的影响
迷迭香提取物浓度单因素试验时，固定料液比1∶3(g∶mL)，浸泡时间30 min。由图1可知，TBA值、TMA值和腥味值都随着迷迭香提取物浓度的增加呈先下降后趋于平稳的变化趋势。TBA值越高代表脂肪氧化产生的醛酮类物质越多，醛酮类物质会使白鲢鱼肉产生腥味，因此TBA值和腥味是紧密联系的[15]。空白组的TBA值为0.631 mg MDA/kg，1.5 g/L组的TBA值为空白组的59.97%，可见迷迭香提取物能有效抑制脂肪氧化，从而降低白鲢鱼肉腥味。原因可能是迷迭香提取物中的迷迭香酸等活性成分可以取代自由基作用于不饱和脂肪酸，达到抑制脂肪氧化的效果[16]。LAN等[17]也发现迷迭香提取物可以有效抑制大黄鱼的脂肪氧化并改善大黄鱼风味。TMA是主要由微生物分解氧化三甲胺所生成的，是导致水产品腥味的主要化合物之一[18]。空白组的TMA为1.900 mg/kg，1.5 g/L组的TMA值为空白组的77.37%，可见迷迭香提取物能有效减少白鲢的TMA含量，从而降低白鲢腥味程度。原因可能是迷迭香提取物含有迷迭香酸、鼠尾草酸等活性成分，使微生物的活性降低，从而减缓了微生物分解氧化三甲胺的过程。YU等[12]用天然提取物丁香精油能减少TMA的含量并改善草鱼风味。腥味值的降低可能是因为迷迭香提取物中的活性成分脱除了白鲢鱼肉中醛酮类腥味物质。TBA值和TMA值在迷迭香提取物浓度大于1.5 g/L时变化不显著，且提取物浓度过大时，会破坏白鲢鱼肉本身的风味和对白鲢鱼肉的色泽产生一定影响。因此，选择质量浓度1.5 g/L为后续响应面试验的中心点。
图1 迷迭香提取物浓度对白鲢鱼肉脱腥效果的影响
Fig.1 Effect of rosemary extract concentration on the deodorization effect of silver carp
注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)
2.1.2 料液比对白鲢鱼肉脱腥效果的影响
料液比单因素试验时，固定迷迭香提取物的质量浓度为1.5 g/L，浸泡时间30 min。由图2可知，TBA值、TMA值和腥味值都随着料液比的增加呈先下降后趋于平稳的变化趋势。当料液比为1∶3(g∶mL)时，TBA、TMA值和腥味值分别为0.364 mg MDA/kg、1.567 mg/kg和2.25。随着迷迭香提取物溶液用量的增加，对TBA值和TMA值无显著性变化。因此，选择料液比1∶3(g∶mL)为后续响应面试验的中心点。
图2 料液比对白鲢鱼肉脱腥效果的影响
Fig.2 Effect of material-liquid ratio on deodorization of silver carp
2.1.3 浸泡时间对白鲢鱼肉脱腥效果的影响
浸泡时间单因素试验时，固定迷迭香提取物质量浓度为1.5 g/L，料液比1∶3(g∶mL)。由图3可知，TBA值和TMA值随着脱腥浸泡时间的延长呈先下降后上升的变化趋势，TBA值和TMA值上升的原因可能是随着浸泡时间的延长，迷迭香提取物浸泡液中活性成分活力降低及内源酶的作用时间延长[19]。浸泡时间为40 min时TBA值最小。浸泡时间为30 min时TMA值最小，且浸泡时间为30～50 min时TMA值无显著性变化，60 min时TMA值反而上升。浸泡时间为40 min时的腥味值趋于稳定，再延长浸泡时间腥味值无显著性变化。张海燕等[20]研究表明浸泡时间过长对鱼肉的质地也会产生不良影响。因此，选择浸泡时间40 min为后续响应面试验的中心点。
图3 浸泡时间对白鲢鱼肉脱腥效果的影响
Fig.3 Effect of soaking time on deodorization of silver carp
2.2 响应面试验结果与分析
采用Box-Behnken 设计试验，以迷迭香提取物浓度、料液比和浸泡时间为响应变量，以TBA值、TMA值、腥味值为响应值进行响应面优化。试验结果以及回归模型方差分析见表2和表3。
表2 响应面试验方案和结果
Table 2 Response surface test plan and results
试验号迷迭香提取物质量浓度(X1)料液比(X2)浸泡时间(X3)TBA值/(mg MDA·kg-1)TMA值/(mg·kg-1)腥味值10-1-10.3901.6152.24201-10.3641.5441.9930000.3501.5071.8541100.3551.5241.925-1100.3681.5622.0760000.3511.5141.8670000.3521.5121.87810-10.3661.5511.989-1-100.4011.6322.40101-100.3651.5672.1411-1010.3671.5682.13120110.3601.5521.94130000.3531.5251.88140-110.3701.5712.1515-10-10.3951.6112.30160000.3571.5351.90171010.3641.5421.96
表3 回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance for the regression model
方差来源F值P值TBA值TMA值腥味值TBA值TMA值腥味值模型37.6625.4495.71<0.000 1a0.000 2a<0.000 1aX175.5948.58196.60<0.000 1a0.000 2a<0.000 1aX271.9056.04247.60<0.000 1a0.000 1a<0.000 1aX333.5910.5326.430.000 7a0.014 2a0.001 3aX1X212.191.985.870.010 1a0.201 9b0.045 8aX1X315.583.1410.920.005 6a0.119 5b0.013 0aX2X35.907.350.780.045 5a0.030 1a0.407 4bX2145.4728.80152.330.000 3a0.001 0a<0.000 1aX2230.2234.83125.710.000 9a0.000 6a<0.000 1aX2335.5827.1057.690.000 6a0.001 2a0.000 1a失拟项2.130.351.910.238 6b0.791 6b0.268 7bR20.979 80.970 30.991 9R2adj0.953 80.932 20.981 6C.V.%0.900.621.12
注：a显著水平(P<0.05)，b不显著(P>0.05)
利用Design-Expert 软件对试验数据进行二次多项回归拟合，得到TBA值的回归方程：Y1=0.947 4-2.366 5X1-0.096 075X2-0.011 485X3+0.115X1X2+
值的回归方程：Y2=2.891 4-4.566 5X1-0.263 075X2-0.027 01X3+0.001 3X2X3+
腥味值的回归方程：
由表3可知，3个模型回归均为极显著(P<0.01)，失拟项不显著(P>0.05)。TBA值模型
值模型R2=0.970 3，
腥味值模型
表明3个响应值模型的拟合情况较好，能良好地分析和预测TBA值、TMA值和腥味值随迷迭香提取物脱腥条件的变化情况。同时较低的变异系数(TBA值CV=0.90%，TMA值CV=0.62%，腥味值CV=1.12%)也说明模型具有良好的精确度和可靠性。
各因素F值可以反映出各因素对试验指标的重要性，F值越大表明对试验指标影响越大，结合表3得出，按照各因素对TBA值影响程度大小排序为：浓度>料液比>浸泡时间。按照各因素对TMA值和腥味值影响程度大小排序均为料液比>浓度>浸泡时间。TBA值、TMA值和腥味值的响应面见图4，可以看出TBA值随各因素的变化幅度较大，浓度、料液比和浸泡时间的两两之间交互作用显著。TMA值随各因素的变化幅度较大，浓度和料液比，浓度和浸泡时间的交互作用不显著，浸泡时间和料液比的交互作用显著。腥味值随各因素的变化幅度较大，浓度、料液比和浸泡时间的两两之间交互作用显著。
a-TBA值响应值；b-TMA值响应值；c-腥味值响应值
图4 各因素交互作用对TBA值、TMA值和腥味值的影响
Fig.4 Effects of interaction between two factors on TBA value, TMA value and fishy taste value
优化得到的脱腥条件为迷迭香提取物的质量浓度为1.7 g/L，料液比1∶3.4(g∶mL)，浸泡时间41 min，在上述条件下，模型预测TBA值为0.348 mg MDA/kg，TMA值为1.506 mg/kg，腥味值为1.82。为了验证模型的可行性，在上述去腥条件下进行3次验证试验，测得TBA值为(0.349±0.016) mg MDA/kg，TMA值为(1.550±0.056) mg/kg，腥味值为1.81±0.07。该结果与模型预测值基本一致，可见模型能很好地预测迷迭香提取物对白鲢鱼肉的脱腥效果，模型结果可靠。
2.3 脱腥前后白鲢鱼肉挥发性成分的测定与分析
由表4可知，通过HS-SPME-GC-MS测定分析，空白组和迷迭香处理组分别检测出24种和14种挥发性成分，经过迷迭香提取物处理后，白鲢鱼肉中挥发性成分的数量及含量都有所下降。
醛类化合物是脂质氧化降解的二级产物，阈值较低，对鱼腥味的影响较大[21]。由表4可知，经过迷迭香提取物处理后，醛类物质种类从7种减少到4种，总量从14.40 μg/kg减少到1.92 μg/kg，下降率为86.67%。己醛主要由亚油酸和亚麻酸氧化分解产生，对鱼腥味的贡献是所有醛类之中最大的[22]。庚醛、辛醛、壬醛、癸醛和E-2-辛烯醛也被证实是产生鱼腥味的主要化合物[23]。脱腥后，己醛和庚醛下降率为100%，辛醛、壬醛、E-2-辛烯醛和癸醛的含量均呈下降趋势，辛醛下降率为70.37%，壬醛下降率为51.43%，癸醛下降率为42.11%以及E-2-辛烯醛下降率为77.36%。这表明，经过迷迭香提取物处理可以减少醛类物质含量，降低鱼腥味。
在空白组中检测到6种醇类物质，分别为己醇、庚醇、1-辛烯-3-醇、1,7-辛二烯-3-醇、2-辛烯-1-醇和十一醇，其中1-辛烯-3-醇含量最高。脱腥后，仅检测出1-辛烯-3-醇和1,7-辛二烯-3-醇，醇类物质总量从31.59 μg/kg减少到5.64 μg/kg。1-辛烯-3-醇呈蘑菇味和鱼腥味，对白鲢的腥味有较大贡献[24]。脱腥后，1-辛烯-3-醇由原来的13.78 μg/kg下降到2.76 μg/kg，同样说明，迷迭香提取物去除腥味物质效果明显。
在空白组中检测到6种烃类物质，其中5种烷烃类物质，1种烯烃类物质，而烷烃类物质含量较高。这些物质可能是不饱和脂肪酸发生氧化反应而产生的[25]。烷烃类化合物的阈值较高，对风味影响较小。烯烃类化合物在一定条件下会发生反应生成醛和酮，是形成鱼腥味的潜在物质[26]。脱腥后，白鲢鱼肉中的烃类物质也有不同程度的减少。
酮类和酯类物质的阈值较高，对鱼腥味的贡献较小[27]。白鲢检测出2,5-辛二酮和2-壬酮这2种物质，含量较少，对鱼肉的风味贡献也较小。脱腥后，2,5-辛二酮含量减少，2-壬酮被完全去除。白鲢检测出3种酯类物质和1种肟类物质经过处理后均有不同程度的减少。
表4 白鲢鱼肉脱腥前后挥发性成分的变化
Table 4 Changes of volatile components of silver carp with and without deodorization
序号类别保留时间/min物质化合物含量/(μg·kg-1)空白迷迭香气味描述g14.94己醛7.80±1.36ND鱼腥味、青草味27.71庚醛1.28±0.09ND鱼腥味310.56辛醛1.35±0.210.40±0.08青草味4醛类12.71E-2-辛烯醛0.53±0.110.12±0.02鱼腥味514.21壬醛1.75±0.280.85±0.11鱼腥味、油脂味617.37癸醛0.95±0.130.55±0.14油脂味733.37十三醛0.74±0.21ND霉味醛类总量14.40±2.391.92±0.3516.765己醇2.58±0.38ND乳酪味29.885庚醇1.79±0.57ND泥土味3醇类10.1851-辛烯-3-醇13.78±1.062.76±0.39鱼腥味、蘑菇味411.761,7-辛二烯-3-醇11.37±1.412.88±0.81512.9952-辛烯-1-醇1.06±0.13ND霉味、油脂味624.99十一醇1.01±0.15ND玫瑰花香醇类总量31.59±3.705.64±1.20125.78十五烷9.10±1.305.31±1.05229.125十九烷8.76±0.372.52±0.353烃类30.922,6,10,14-四甲基十五烷4.71±0.59ND432.598-十七烷烯29.60±4.4514.85±1.25泥土味533.225十七烷136.32±23.9167.68±8.56烃类总量188.49±30.6290.36±11.211酮类10.3552,5-辛二酮14.60±3.1110.56±1.25213.762-壬酮0.41±0.04ND奶油香、果香8酮类总量15.01±3.510.56±1.25128.612,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯1.51±0.31ND2酯类33.36苯甲酸-2-乙基己酯6.85±0.911.78±0.24337.31邻苯二甲酸二异丁酯5.40±0.550.92±0.06芳香味酯类总量13.76±1.772.70±0.301肟类7.968甲氧基苯基肟23.10±6.3224.18±3.32
注：ND表示未检出；g 气味描述词主要源于文献[23]和网站http://www.flavornet.org/index.html
3 结论
本文以迷迭香提取物为研究对象，探讨其对白鲢鱼肉的脱腥效果，以及脱腥前后的挥发性物质变化。结果显示，响应面法优化的最优脱腥条件：迷迭香提取物质量浓度为1.7 g/L，料液比1∶3.40(g∶mL)，浸泡时间41 min。在此条件下脱腥，TBA值、TMA值和腥味值均显著降低。对鱼腥味有重要贡献的腥味物质，如己醛、庚醛、辛醛、壬醛和1-辛烯-3-醇等含量也显著降低，分别降低了100%、100%、70.37%、51.43%和79.97%。本文说明迷迭香提取物处理可以有效抑制白鲢鱼肉的脂肪氧化并改善白鲢鱼肉风味，对推动白鲢加工产业的发展具有积极意义。
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