生物胺是一类具有生物活性的低分子质量含氮有机化合物，在水产品中普遍存在[1]。水产品中常见有色胺(tryptamine，TRM)、苯乙胺(phenylethylamine，PHE)、腐胺(putrescine，PUT)、尸胺(cadaverine，CAD)、组胺(histamine，HIS)、章鱼胺(octopamine, OCT)、酪胺(tyramine，TYM)和亚精胺(spermidine，SPD)、精胺(spermine，SPM)等[2-3]。人体内源性生物胺是活性细胞内不可或缺的化合物，可以调节血压和血糖浓度，调节DNA、RNA和蛋白质合成，以及起抗氧化作用，但摄入过多生物胺会导致中毒以及严重的公共健康和安全问题[4]。生物胺可作为水产品新鲜度的重要指标，而生物胺的安全限量没有统一的国际标准。美国食品药物管理局限定人体摄入组胺和酪胺的含量不超过50 mg/kg，酪胺和苯乙胺安全阈值的参考上限分别为100～800 mg/kg和30 mg/kg[5], 欧洲食品安全局限定水产品中组胺的含量不超过100 mg/kg[6]。
南美白对虾(Litopenaeus vannamei)又称凡纳滨对虾，营养丰富，含有大量的蛋白质、游离氨基酸和低含量的饱和脂肪酸。水产品中生物胺的形成受原料差异、微生物及贮藏条件的影响[7]，在贮藏过程中，其蛋白质会在内生或外源蛋白水解酶的作用下水解产生多种游离氨基酸，微生物释放的氨基酸脱羧酶会作用于氨基酸而产生生物胺[8-9]。水产品中游离氨基酸的含量会随着贮藏时间的延长而逐渐增多[10]，且不合适的贮藏温度和贮藏时间会促进微生物的生长繁殖，从而使水产品中生物胺的含量越来越多，因此贮藏条件是影响水产品中生物胺含量的关键因素。生物胺通常在鲜鱼和贝类贮藏过程中高度稳定，而在虾类中较易受外部条件影响而变化[11]，且其与虾的品质变化具有相关性[12]。包玉龙等[13]研究表明，海产品在贮藏过程中生物胺含量的变化与一些感官和理化指标密切相关，如硫代巴比妥酸 (thiobarbituric acid，TBA)值、总挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen, TVB-N)值、pH值和菌落总数(total viable counts, TVC)等。
实验通过研究南美白对虾在4 ℃ 和 25 ℃ 下贮藏过程中生物胺的变化情况，了解贮藏温度和贮藏时间对水产品中生物胺含量的影响，并进一步考察南美白对虾在 4 ℃ 和 25 ℃ 下贮藏过程中pH值, TBA值, TVB-N 和菌落总数的变化及其与生物胺含量的关系，从而为生物胺的监测及控制提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
3 kg南美白对虾，购于中国上海市浦东新区养殖场，并充氧运回实验室。
生物胺标准品∶组胺盐酸盐(纯度98%)、β-苯乙胺盐酸盐(纯度98.6%)、酪胺盐酸盐(纯度99.1%)、腐胺盐酸盐(纯度99.8%)、尸胺盐酸盐(纯度99.7%)、色胺盐酸盐(纯度98%)、精胺盐酸盐(纯度98.8%)和亚精胺盐酸盐(纯度99.9%),美国Sigma公司;衍生试剂丹磺酰氯(dansyl chloride, DNS-Cl)、乙腈(色谱纯)、乙醚(分析纯)、三氯甲烷(分析纯)，Sigma-Aldrich公司；丙酮(分析纯)、正丁醇(分析纯)、正己烷(分析纯)、氨水(分析纯) (25%)、乙酸铵(色谱纯)，上海泰坦科技股份公司；三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA),NaOH, 盐酸、TBA、营养琼脂、饱和碳酸氢钠、NaCl，国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
H2050R高速冷冻离心机，长沙湘仪有限公司;HAC-36C氮吹仪，天津市恒奥科技发展有限公司；实验室 pH 计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；HWS-26型电热恒温水浴锅，天津欧诺仪器仪表有限公司；Milli-Q超纯水器，美国Millipore公司；QUINTIX224-1CN电子分析天平，德国赛多利斯公司；KO5200E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;W2695 高效液相色谱仪(配备紫外检测器、荧光检测器和色谱工作站)、Symmetry C18 (柱长250 mm, 柱内径4.6 mm, 柱填料粒径5 μm), 美国Waters公司;滤膜针头滤器 (13 mm, 0.22 μm), 上海安谱实验科技股份有限公司；A25实验室小型均质机，上海福克设备有限公司；垂直流 SW-CJ-2F 超净工作台，苏州尚田洁净技术有限公司;UV-245紫外分光光度计, 日本津岛公司;Kjeltec2300全自动凯氏定氮仪, 丹麦FOSS公司。
1.3 实验方法
1.3.1 pH值、TBA值、TVB-N值和菌落总数的测定
参考并改进 GB 5009.237—2016《食品安全国家标准食品pH值的测定》[14]和FAN等[15]的方法对南美白对虾进行pH值测定。称取2.00 g样品，加入20 mL 蒸馏水进行均质后，在10 000 r/min的条件下离心10 min，过滤取上清液测定pH。
TVB-N值参考ANTONACOPOULOS等[16]和GB 5009.228—2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》[17]测定。
TBA值参考FAUSTMAN等[18] 的方法进行测定。准确称取 2.00 g 样品，加入 4 mL 蒸馏水和 5 mL三氯乙酸溶液(200 g/L)，均质1 min后静置1 h，4 ℃条件下冷冻离心10 min(8 000 r/min)。过滤后取其上清液，并用三氯乙酸溶液定容至10 mL，振荡混匀后取5 mL并加入5 mL TBA溶液(0.02 mol/L)，超声1 min 后置于沸水中加热 20 min，流水冷却 5 min，532 nm 处测其吸光度A。
菌落总数(total viable counts, TVC)的测定即为需氧菌平板计数[19], 参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数的测定》[20]进行计算。称取5 g样品，加入45 mL无菌生理盐水(8.5 g/L)均质 2 min 后，用生理盐水进行10 倍稀释，取 1 mL 连续稀释液涂于平板计数琼脂上，37 ℃下培养48 h后进行菌落总数计算，以lg CFU/g表示。
1.3.2 生物胺的测定
参考张殿伟等[21]和HAO等[22]的方法并做修改，建立超声辅助固相分散萃取结合反相高效液相色谱测定南美白对虾中的生物胺。精确称量5 g[(0.100 0±0.000 1)g]的等分样品于离心管中，加入20 mL 三氯乙酸溶液(50 g/L)，均质2 min，超声30 min，离心10 min(5 000 r/min)。将上清液转移至50 mL容量瓶中，并用三氯乙酸溶液定容。移取10 mL上述提取试样溶液至离心管中，加入10 mL正己烷以除去脂肪，超声10 min后待静置分层，弃去上层有机相。移取5 mL上述除脂肪后的试样溶液转移到含有100 mg C18和100 mg PSA的50 mL离心管中，振荡混匀 5 min后超声10 min，离心5 min(8 000 r/min)。收集上清液，用NaOH(2 mol/L)将净化后的溶液pH提高到12，用乙腈定容至5 mL，超声处理5 min，待衍生。
分别移取上述提取液和混标溶液1.0 mL，放入10 mL具塞试管中，依次加入1 mL饱和碳酸氢钠溶液和100 μL 1mol/L NaOH溶液，调节pH至 10.5，再加入1 mL丹磺酰氯溶液(10 mg/mL，溶于丙酮)，振荡混匀，超声2 min后60 ℃水浴反应20 min。衍生完毕后，加入200 μL氨水(25%)，振荡超声1 min，避光静置 30 min以终止衍生。向试管中分别加入0.5 g NaCl，振荡超声至NaCl溶解，加入5 mL乙醚，振荡混匀，超声2 min，静置分层，吸出上层有机相(乙醚层)，在40 ℃水浴氮气吹干，加入1 mL乙腈振荡并超声至残留物溶解，0.22 μm滤膜针头滤器过滤至进样瓶，待高效液相色谱进行测定。高效液相色谱条件为色谱柱：Waters Symmetry C18色谱柱(柱长250 mm,柱内径4.6 mm,柱填料粒径5 μm)；254 nm处通过PDA检测进行定量，柱温 35 ℃；进样量 10 μL；流速1.0 mL/min，梯度洗脱程序如表1所示。
图1为生物胺标准品的高效液相色谱图，9种生物胺在20 min内得到了良好的分离。9种生物胺的峰形尖锐，无前延或拖尾现象，生物胺之间达到基线分离，9种生物胺的保留时间分别在3.9、4.9、5.4、6.2、6.6、7.7、12.3、13.4和17.9 min左右，且线性良好，相关系数R都>0.999。
表1 生物胺分析的梯度洗脱程序
Table 1 Gradient elution program for biogenic amine analysis
时间程序/minA/%B/%04060540607505084060103070152080202080253070304060
注：A为10 mmol/L乙酸铵溶液;B为乙腈
1-色胺；2-β-苯乙胺；3-腐胺；4-尸胺；5-组胺；6-章鱼胺；
7-酪胺；8-亚精胺；9-精胺
图1 九种生物胺标准品色谱图(50 μg/mL)
Fig.1 HPLC chromatogram of 8 biogenic amine standards (50 μg/mL)
1.3.3 研究方法
根据测定不同水产品中的生物胺含量结果，选择南美白对虾作为样品进行贮藏实验。分别在4 ℃和25 ℃贮藏条件下研究南美白对虾中生物胺含量的变化，并测定相应的新鲜度指标 (pH、TVB-N值、TBA值和菌落总数)。根据不同贮藏温度下生物胺及相关新鲜度指标的产生过程，在25 ℃的贮藏条件下每0、0.5、1、1.5、2、2.5和3 d测定南美白对虾中生物胺的含量及相关新鲜度指标，在4 ℃的贮藏条件下每0、2、4、6、8、10和12 d测定南美白对虾中生物胺的含量及相关新鲜度指标。每个样品平行测定3次。
1.3.4 数据分析
利用Origin lab 2018软件绘制曲线，用Excel 2010和SPSS 26.0软件分析单因素，ANOVA检验来进行显著性和方差分析，P<0.05为差异显著，P>0.05 为差异不显著。
2 结果与分析
2.1 贮藏过程中生物胺的变化
生物胺在微生物的作用下大量产生，与虾肉品质变化、安全性及货架期有关。南美白对虾购入后即取虾肉在优化的条件下测定生物胺含量，结果检出苯乙胺和酪胺的含量分别为0.78和3.27 μg/g，其他均未检出，在贮藏过程中继续测定生物胺。由图2可知，南美白对虾中的生物胺在25 ℃和4 ℃下的变化不同，但总量随着温度的升高而呈总体增加的趋势。
由图2-a可知，当在25 ℃贮藏72 h时，南美白对虾中的生物胺总量在24 h就达到了 54.98 mg/kg，72 h达到211.14 mg/kg。其中，腐胺、尸胺和酪胺的积累量显著增加(P<0.05)，72 h的最终含量分别达到88.41、73.31和42.42 mg/kg，而相比之下，苯乙胺的积累量较少且基本无变化，最终含量为 6.99 mg/kg。由图2-b可知，当在4 ℃贮藏12 d时，南美白对虾中的生物胺总量总体增加，变化较缓慢，由4.05 mg/kg增长到45.54 mg/kg。其中，腐胺和尸胺的积累量相对较大(P<0.05)，12 d的最终含量分别达到15.68和17.10 mg/kg，而苯乙胺和酪胺的积累量都缓慢增加，苯乙胺在6 d达到5.11 mg/kg后无显著增加(P>0.05)，酪胺最终含量为7.23 mg/kg。随着贮藏时间的增长，内源性和外源性氨基酸脱羧酶作用于游离氨基酸上形成生物胺[10]。但是，水产品中形成的BA水平可能受贮存条件的强烈影响[7]。由以上分析可知，温度较高时，生物胺积累速度较快，这可能是由于随着贮藏温度的升高微生物的生长繁殖加速，进入对数生长期的时间变短，产生大量的氨基酸脱羧酶和蛋白质降解酶，从而产生大量的生物胺和游离氨基酸，游离氨基酸的增加又导致生物胺产生速度变快，因此，温度较高情况下，生物胺产生速度和含量都大大增加。胡礼渊等[23]研究表明对虾在4 ℃下贮藏，腐胺和尸胺变化最显著，25 ℃下贮藏产生的主要生物胺是酪胺，其次是腐胺和尸胺，而本实验中不同温度下虾肉中主要产生腐胺和尸胺，且其变化显著，其次是酪胺。这可能与虾肉原料、贮藏环境和微生物的差异有关。
a-南美白对虾在25 ℃贮藏过程中生物胺的变化；
b-南美白对虾在4 ℃贮藏过程中生物胺的变化
图2 南美白对虾在25 ℃和 4 ℃贮藏过程中生物胺的变化
Fig.2 Changes of biogenic amines of white shrimp (Litopenaeus vannamei) during storage at 25 ℃ and 4 ℃
2.2 贮藏过程中pH、TVB-N、TBA、TVC的变化
pH可反映鱼肉品质变化导致的酸碱程度的变化和蛋白质降解的变化[24]。南美白对虾在25 ℃和4 ℃贮藏过程中pH、TVB-N、TBA和TVC的变化见图3-a。25 ℃和 4 ℃贮藏过程中南美白对虾pH 变化趋势相同,先升高后降低，最后显著升高(P<0.05), pH值的降低可能因为虾肉内糖原、ATP和磷酸肌酸的分解和二氧化碳的溶解[25-26]，pH值的升高是由于鱼类腐败细菌产生挥发性基本成分或蛋白质分解产生含氮碱性物质，比如生物胺[27]，这与SONG等[19]的研究结果类似。
TVB-N 值反映蛋白质分解而产生的氨以及胺类等碱性含氮物质，从而反映水产品品质的变化[28]。GB 2733—2015《食品安全国家标准鲜、冻动物性水产品》中规定TVB-N值在 20 mg/100g为新鲜鱼虾水平，超过35 mg/100g被认为是不适合消费者食用的[29]。由图3-b可知，贮藏初期南美白对虾TVB-N值为10.83 mg/100g，25 ℃贮藏温度下增长显著(P<0.05)，到24 h时TVB-N值已达到43.86 mg/100g，远超出了虾肉二级鲜度(25 mg/100g)范围，最终在贮藏终点3 d时达到了122.97 mg/100g。4 ℃冷藏期间，南美白对虾TVB-N值增长相对缓慢，于4 d达到20.71 mg/100g，超过新鲜鱼虾水平，于8 d达到27.54 mg/100g，超出了虾肉二级鲜度范围，最终在贮藏终点12 d时达到了45.93 mg/100g。2个贮藏温度下TVB-N值均随贮藏时间增长呈上升趋势，且25 ℃增长迅速且显著，这与以往有关其他虾类的相关研究相一致[29-30]，贮藏温度和时间是影响TVB-N和水产品腐败的重要因素。
南美白对虾含有大量的多不饱和脂肪酸，故其在贮藏过程中易发生脂肪氧化。丙二醛为虾肉脂质氧化的终产物之一，其含量可由TBA值来表示，表明南美白对虾的脂肪氧化程度[28]。一般而言，TBA值越大，说明脂肪氧化程度越高。此外，脂肪氧化过程中伴随产生一些酚类和酮类物质，引起不愉快的气味，也是引起虾品质劣变的重要原因[30-31]。研究表明，温度的升高会加速脂质的氧化分解[32]。图3-c表明,25 ℃贮藏温度下虾肉TBA值呈总体上升趋势，从0.47 mg/100g上升到3.92 mg/100g,而在第1.5～2天的贮藏过程中有略微下降，可能因为丙二醛的含量会因其与胺、核苷、核酸、含氨基磷脂、蛋白质或其他脂质氧化副产物醛类之间的相互作用而降低[28]。4 ℃贮藏过程中，虾肉TBA值呈持续上升趋势，从0.47 mg/100g上升到3.93 mg/100g,贮藏0～8 d期间，虾肉TBA上升较为缓慢，一定程度表明虾肉在8 d 前脂质氧化程度较小;8～12 d期间虾肉TBA显著增加(P<0.05)，说明这个阶段脂肪氧化物迅速发生了进一步的氧化。
微生物与水产品中大部分生物胺的产生与变化有很大的相关性[33]。可食用的水产品其菌落总数限量标准为6 lg CFU/g[34]。由图3-d可知，在25 ℃贮藏过程中，虾肉TVC呈一直呈显著增加趋势(P<0.05)，从3.70 lg CFU/g上升至8.81 lg CFU/g，当贮藏1 d时，虾肉TVC为 6.36 lg CFU/g(>6 lg CFU/g)，此时虾肉已不可再食用。而4 ℃冷藏期间，虾肉TVC增长缓慢，到贮藏终点12 d时，TVC上升至8.85 lg CFU/g，8 d时达到7.29 lg CFU/g(>6 lg CFU/g)，不能食用。可从微生物指标看出4 ℃比25 ℃货架期延长7 d。由以上分析可知，温度越高，菌落总数增长越快，因为低温可抑制许多种类微生物的生长繁殖。
2.3 贮藏过程中生物胺含量与pH、TVB-N、TBA、TVC的关系
本实验对25 ℃和4 ℃贮藏条件下南美白对虾中生物胺和其他新鲜度指标值(pH值、TVB-N值、TBA值和菌落总数)进行了皮尔逊相关分析，以确定其在不同贮藏温度下随时间变化的相关性。由表2可知，在25 ℃条件下贮藏的南美白对虾中苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺含量和生物胺总含量与pH值、TVB-N值、TBA值和菌落总数均表现出显著相关性(P<0.05)，在4 ℃条件下贮藏的南美白对虾中腐胺、尸胺、酪胺含量和生物胺总含量与pH值、TVB-N值、TBA值和菌落总数表现出显著相关性(P<0.05)，其中尸胺和酪胺与pH值、TVB-N值、TBA值和菌落总数均表现出极显著相关性(P<0.01)，而苯乙胺与pH值、TVB-N值、TBA值和菌落总数相关性不明显。在常温贮藏(25 ℃)和冷藏(4 ℃)条件下南美白对虾中酪胺、尸胺、腐胺含量均与pH值、TVB-N值、TBA值和菌落总数表现出高度相关性，可能因为这3种生物胺与蛋白质的分解和微生物的作用有密切的相关性。因此，可将尸胺、腐胺和酪胺作为南美白对虾的特征生物胺，用于评价其品质变化，可作为其货架期的参考指标。
a-南美白对虾在25 ℃和4 ℃贮藏过程中pH的变化;b-南美白对虾在25 ℃和4 ℃贮藏过程中TVB-N的变化;c-南美白对虾在25 ℃和4 ℃贮藏过程中TBA的变化;d-南美白对虾在25 ℃和4 ℃贮藏过程中菌落总数的变化
图3 南美白对虾在25 ℃和 4 ℃贮藏过程中pH、TVB-N、TBA和TVC的变化
Fig.3 Changes of pH, TVB-N, TBA and total viable counts of white shrimp (Litopenaeus vannamei) during storage at 25 ℃ and 4 ℃
3 结论
在不同贮藏条件下，南美白对虾中腐胺、尸胺和酪胺变化最显著，常温贮藏(25 ℃)下产生的主要生物胺是腐胺，其次是尸胺和酪胺，冷藏(4 ℃)条件下产生的主要生物胺是腐胺、尸胺、酪胺和苯乙胺。根据对南美白对虾生物胺、理化指标和微生物的测定，表明在25和4 ℃贮藏条件下南美白对虾可食用期为1 d和4 d。在2个贮藏温度下腐胺、尸胺和酪胺含量均与pH值、TVB-N值、TBA值和菌落总数表现出高度相关性，可以作为南美白对虾贮藏过程中新鲜度的指标。
表2 25 ℃和4 ℃贮藏条件下南美白对虾中生物胺含量与pH值、TVB-N值、TBA值和TVC值的相关性
Table 2 Correlations of the concentrations of biogenic amines with pH, TVB-N, TBA and TVC in white shrimp (Litopenaeus vannamei) during storage at 25 ℃ and 4 ℃
生物胺25 ℃4 ℃pHTVB-NTBATVCpHTVB-NTBATVC色胺--------苯乙胺0.807*0.896**0.899**0.967**0.046-0.071-0.126-0.252腐胺0.845*0.959**0.836*0.891**0.780*0.886**0.957**0.858*尸胺0.829*0.969**0.878**0.933**0.900**0.957**0.925**0.988**组胺--------酪胺0.772*0.862*0.755*0.760*0.958**0.957**0.916**0.947**亚精胺--------精胺--------总量0.837*0.957**0.850*0.896**0.912**0.966**0.968**0.930**
注:*,显著相关(P<0.05)；**,极显著相关(P<0.01)；-,无相关性
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