宁红是我国独特且最早的传统工夫红茶之一，创始于清道光年间，江西修水古称义宁州，所产红茶称宁州工夫红茶，简称“宁红”，历史上修水、武宁、铜鼓三县为同一个县因此这三个县所产红茶均称宁红[1]。当代茶圣吴觉农先生曾说：“宁红是历史上最早支派，早于祁红九十年，先有宁红，后有祁红，宁红祁红并称世界之首”[2]。宁红茶品质特征描述主要包括条索紧结圆直，锋苗挺拔，色乌光润，内质香高持久似祁红，滋味醇厚甜和，汤色红亮，叶底红匀等词汇[1-2]，这些术语尚不能准确的表达其内质特征，同时关于影响其品质特征的化学成分尚未见报道。
香气是茶叶品质的重要贡献因子,消费者闻香而识茶[3-4]。定量描述分析法(quantitative description analysis,QDA)可以对产品的特征特性进行全面描述、定义和评价,从而让消费者更加准确的了解产品的特点[5-6],目前相关学者已采用定量描述分析法对兰花香绿茶[7]、板栗香绿茶[8]、工夫红茶[9]等的香气进行了准确定义与评价。香气成分的测定可通过气相色谱质谱(GC-MS)进行定性和定量[10],目前已成为茶叶香气研究的重要手段,相关学者使用该方法测定了祁红[11]、川红[9]、滇红[12]、闽红[13]等的香气含量,并分析出了其主要呈香物质。基于此,本研究拟采用感官评价方法与GC-MS相结合对宁红茶的香气特征与挥发性成分进行检测分析,采用偏最小二乘法(partial least squares regression,PLSR)筛选出对宁红茶香气具有重要贡献的挥发性成分,以期为宁红茶的加工品质调控提供数据参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料
供试的8份宁红茶样品分别采购于修水县内的4个茶厂,茶样制作的鲜叶采用不同的芽叶等级,制作工序为宁红传统工夫红茶加工工序,分为萎调→揉捻→发酵→干燥→提香。每个样品用相同规格的专用铝箔袋包装,置于-4 ℃的冰箱中备用。
1.2 实验方法
1.2.1 感官定量描述分析
香气术语及定义的产生：称取3 g茶样放于审评杯中,注入150 mL沸水,冲泡5 min后沥出茶汤,之后由6名具备评价资格的茶学专业人员组成的评价小组对茶汤进行香气描述,记录香气术语,之后对术语进行讨论与定义,并结合相关文献删除重复的与描述不清晰的词汇[14-15],最终筛选出的香气术语及定义见表1。
样品感官评价：茶汤制备方法与上述相同,评价小组依据建立的香气术语及定义,采用1～15的强度尺度对宁红茶样进行感官评价,强度尺度1～3为极弱、3～5为较弱、5～7为弱、7～9为中、9～11为强、11～13为较强、13～15为极强,评价人员在最能反映样品感官强度的位置进行标记。
表1 香气术语及定义
Table 1 Terms and definitions of aroma
术语定义甜香香气带有甜感,包括蜂蜜香、焦糖香、红糖香等,典型代表为4-羟基-2, 5二甲基-3(2H)-呋喃酮花香似鲜花的香气,包括兰花香、玫瑰香、紫罗兰香、水仙花香、茉莉花香、栀子花香等,典型代表为 (R)-芳樟醇果香似成熟水果散发出的香气,包括桃子、苹果、香蕉、菠萝、柑橘等,典型代表为苯乙醛焙烤香与烘焙有关的香气,包括锅巴香、烤面包香、咖啡香等,典型代表为2, 5-二甲基吡嗪辛香包括薄荷味、冬青味、姜味、胡椒等辛辣刺鼻的气味,典型代表为水杨酸甲酯木香包括松香、干草味、樟木香、树脂味等,典型代表为α-松油醇清香清新纯净,类似黄瓜刚切断后所散发的气味异气包括肥皂味、药味、鱼腥味、泥土味、金属味、霉味、陈味、烟熏味、焦气、不良发酵味等
1.2.2 挥发性物质测定
样品前处理：采用HS-SPME法萃取样品的挥发性物质,称取1.5 g粉碎后的茶样,转移至20 mL顶空进样瓶中,加入20 μL癸酸乙酯(0.02 mg/mL),加入沸蒸馏水5 mL。HS-SPME的萃取条件：在60 ℃恒温条件下振荡15 min,振荡速度为450 r/min(5 s开,2 s关),50/30 μm DVB/CAR /PDMS萃取头(sigma公司)插入样品顶空部分,顶空萃取60 min,于250 ℃下解析5 min,然后进行GC/MS分离鉴定。萃取头Fiber萃取前在Fiber Conditioning Station 中老化2 h,采样前后分别在Fiber Conditioning Station中加热解吸去杂10 min。
GC/MS分析条件：采用Agilent 7890B-5977B(GC-MS)PAL RSI 120进行挥发性物质分析。色谱条件：DB-WAX毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,Agilent J&W Scientific,Folsom,CA,USA),载气为高纯氦气(纯度不小于99.999%),恒流流速1.0 mL/min,进样口温度260 ℃,不分流进样,溶剂延迟1.5 min。程序升温：40 ℃保持3 min,以4 ℃/min升至220 ℃,保持10 min。质谱条件：电子轰击离子源(EI),离子源温度230 ℃,四极杆温度150 ℃,质谱接口温度280 ℃,电子能量70 eV。检测器电压：901V,扫描方式为全扫描模式(SCAN),质量扫描范围：m/z 20～650。每个样品重复3次。
GC/MS定性：将各色谱峰的质谱图在鹿明生物自主研发的LUG数据库Lumingbio进行相似度比对,获得定性化合物。GC/MS定量：采用内标癸酸乙酯定量分析香气成分,各挥发性成分含量按公式(1)计算：
挥发性成分含量/(μg·kg-1)=
(1)
1.3 数据处理
采用Origin 2018制作雷达图与百分比图,采用SPSS 19.0进行因子分析,采用J.Craig Venter Institute研发的Multiple Experiment Viewer 4.9.0进行热图分析,PLSR采用The Unscrambler Version 9.7进行分析。
2 结果与分析
2.1 宁红茶香气特征分析
2.1.1 香气特征的剖面分析
对宁红茶香气感官定量描述分析结果进行剖面,如图1所示。宁红茶的香气分属性中以果香强度最强,甜香和花香次之,说明宁红茶的主要呈香表征为以果香为主,甜香和花香为辅,这是宁红茶的典型感官特性。这与前人所报道的宁红茶具有“苹果香”、甜香高长、内质香高持久、以及具有类似祁红香气等的描述相符合[1-2]。
图1 香气特征剖面图
Fig.1 Aroma profile of tea samples
变异系数为标准差与平均值之比,是样本分散程度的一个归一化量度,数值越大说明离群点越多,样本之间的差异性越大[16]。3个典型感官属性中,果香和甜香的变异系数相对较小,分别为16.9%和19.1%,花香的变异系数相对较大,为31.3%,可以看出果香和甜香在宁红茶香气中的强度差异性相对较小,而花香的差异性相对较大,离群点多,也从侧面说明了宁红茶的果香和甜香品质特征较为稳定,为其基础性香型,而相对来说花香的改良潜力更大,在宁红茶制作中,可以通过改良其花香强度,来进一步提升宁红茶品质。焙烤香、木香、辛香、清香对宁红茶的香气强度具有贡献,但整体强度相对较弱,此4种香气分属性中,焙烤香的变异系数为24.2%,说明样本的焙烤香存在差异性,但离群点不多；辛香和清香的变异系数均为31.9%,样本之间的差异性较大；木香的变异系数达到82.7%,原因在于宁红茶大部分样本木香强度较弱,但No.3和No.4样品的木香强度较强,产生了分散的离群点。异气的变异系数为36.7%,说明宁红茶样本的异气差异性较大,存在制作不良的问题,异气包括大量对茶叶品质存在负面影响的香气类型,如发酵味、烟味、焦糊味等[14],在制作宁红茶时,应尽可能减少异气的产生,提升其他香型的强度,以发挥宁红茶的品质特征。
2.1.2 香气特征的因子分析
因子分析法是从研究指标相关矩阵内部的依赖关系出发,把一些信息重叠、具有错综复杂关系的变量归结为少数几个不相关的综合因子的一种多元统计分析方法,与主成分分析相比,其重在解释原始变量之间的关系,经提取公因子,使潜在因子实际意义更加明确[17]。对宁红茶香气感官评价结果进行因子分析,结果见图2。
图2 因子分析的载荷图
Fig.2 Loading diagram of factor analysis
前3个因子的初始特征值大于1,累计方差贡献率达到78.5%,说明因子分析的前3个因子可以解释宁红茶香气特征的78.5%的信息,能够代替8个香气分属性进行分析。第1因子的方差贡献率为35.8%,主要表征甜香、花香和清香；第2因子的方差贡献率为25.6%,主要表征果香、焙烤香、木香和辛香；第3因子的方差贡献率为17.1%,主要表征异气,由此可以看出,8个香气分属性在各因子中均有贡献,说明宁红茶的香气感官品质可用此8个分属性进行评价,能够代替其78.5%的感官变异。在因子分析中,2个变量之间的距离越近,说明两者之间的相关性越大,在因子分析中同一圆圈内的变量即表示相关性较大。宁红茶的花香和甜香之间、焙烤香和果香之间、辛香与清香之间相关性较大,木香和异气距离其他香气分属性均较远,与各分属性之间相关性不大,这是宁红茶的典型感官特性。与毛世红等[15]对中国工夫红茶风味研究的结论一致，即花香和甜香间呈显著正相关,原因在于工夫红茶中很多挥发性成分的呈香特性既有甜香又有花香,异气、辛香与其他香气分属性相关性不显著。
2.2 宁红茶挥发性化合物含量分析
2.2.1 挥发性化合物含量的描述统计
对宁红茶样品的挥发性化合物的检测结果进行描述性统计,结果见图3和图4。
图3 挥发性成分占总香气成分的百分比
Fig.3 Percentage of volatile components in total aroma components
8个宁红茶样品中共检测到74个共有挥发性成分,包括醇类20种、醛类9种、酮类8种、酸类6种,酯类12种,萜烯类3种、碳氢化合物9种和杂环类7种。醇类含量最高,占样品挥发性成分总量的58%～70%,其次为脂类,占比10%～16%,再其次是酸类(5%～17%)、醛类(4%～7%)、酮类(2%～5%)、碳氢化合物(3%～4%)、杂环类(1%～4%)和萜烯类(1%左右)。王秋霜等[18]鉴定国内名优红茶的香气成分,鉴定出约60种香气化合物,主要包含醇类、酯类、醛类、酮类和烯类、烷烃类等,认为醇类是国内名优红茶香气中最主要的物质,其次是酯类和醛类；罗学平等[19]对红茶香气成分进行鉴定,发现主要成分包含醇类、醛类、酯类、酮类、烃类、酸类等,其主要的香气贡献成分是醇类化合物,相对含量在45.97%～63.78%；雷攀等[20]对不同区域祁红的香气进行分析,共鉴定出50多种挥发性化合物,主要为醇类、酸类和醛类,分别占香气相对总量的30.52%～49.13%、22.84%～38.52%和10.37%～16.15%。与前人的研究结果相比,宁红茶的香气成分也以醇类含量为最高,且比其他工夫红茶的占比更大,其他类型的香气成分含量占比存在较大差异,这是宁红茶品质特征与其他红茶存在差异的主要原因。
2.2.2 挥发性化合物的热图分析
宁红茶样品检测的74个共有挥发性成分的热图分析结果见图4。
图4 各样品挥发性成分热图分析
Fig.4 Heatmap analysis of volatile components in each sample
从每个茶样挥发性物质热图的颜色深浅对比看,No.5和No.4的挥发性成分香气含量明显较高,其次为No.7和No.2,再其次为No.3、No.6和No.1,最后是No.8。其中No.5、No.4、No.7和No.2的挥发性成分大部分高于均值,呈红色,而No.3、No.6、No.1和No.8大部分低于均值,呈绿色。挥发性成分中含量最大是香叶醇,其次为苯乙醇,之后是苯甲醇、芳樟醇、反式芳樟醇氧化物和水杨酸甲酯。在对无性系红茶的挥发性化合物的分析中发现中国类型茶树鲜叶制作的红茶以香叶醇居多,阿萨姆类型的以芳樟醇居多,而大吉岭、云南红茶属于中间型[21]。中国红茶中,祁红和福建红茶的香叶醇含量高,两广地区红茶芳樟醇及其氧化物含量高。按香气特征，红茶可分为3种类型,第1种是以芳樟醇及其氧化物占优势型,第2种是中间型,以芳樟醇和香叶醇为主,第3种类型是以香叶醇占优势型[21]。综合来看,宁红茶在主要香气成分含量上和我国其他工夫红茶相近,在分类上属于第3种。其中香叶醇的呈香特性为玫瑰花香、甜香,苯乙醇的呈香特性为玫瑰花香、蜜香,苯甲醇为芳香、果香,芳樟醇及反式芳樟醇氧化物呈花香、木香,水杨酸甲酯呈清香、花香[22-23]。从含量较大的挥发性成分呈香特性来看,基本呈现甜香、花香、果香等特征,和前面宁红茶感官评价结果较为一致。从每个挥发性成分在各茶样中的热图来看,整体的颜色差异性较大,变异系数为19.8%～117.7%,其中呈果香和甜香的丁酸二甲基苄基原酯、β-水芹烯、柠檬醛、双戊烯、香叶醇、苯甲醇等的变异系数相对较低,均在30%以下,呈典型花香、清香和木香等的芳樟醇、反式芳樟醇氧化物、β-柏木烯、β-紫罗酮和(Z)-2-戊烯-1-醇等的变异系数在30%以上,与前面宁红茶的香气分属性变异较为一致,说明宁红茶的香气特征以及差异是由挥发性化合物的组成所决定的。
2.3 宁红茶香气特征关键贡献化合物的筛选
以宁红茶挥发性化合物为 X 变量,香气感官分属性为Y 变量,采用PLSR对宁红茶样品的挥发性成分与香气感官分属性进行多自变量多因变量(PLS2)分析。所建立的PLSR模型提取的3个主成分,解释了92%的交叉验证方差,说明该模型能够成功地反映样品的整体信息。挥发性化合物与香气感官指标的相关性载荷图见图5。
图5 各变量在PLSR上的载荷分布
Fig.5 Load distribution of variables on PLSR
有5个感官指标和46个化学成分落在2个椭圆(R2=0.5 和R2=1.0)之间,分别代表50%和100%的解释方差, PLSR模型能够很好地解释这些指标[24]。说明此46个挥发性化合物决定了宁红茶样品的香气特征,分别为5-甲基-2-乙酰基呋喃、2-正戊基呋喃、反式-橙花叔醇、正己醇、橙花醇、糠醇、苯甲醇、香叶醇、芳樟醇、苯乙醇、百里酚、β-环柠檬醛、(E, E)-2,4-庚二烯醛、3-糠醛、苯甲醛、2,5-二甲基苯甲醛、柠檬醛、正己醛、反式-3-己烯酸、苯甲酸、己酸、正戊酸、β-紫罗酮、α-紫罗酮、2-环戊烯酮、2-庚酮、植酮、香叶基丙酮、1-甲基萘、奥苷菊环、β-水芹烯、罗勒烯、β-柏木烯、二氢猕猴桃内酯、3-己烯酸乙酯、庚酸乙酯、棕榈酸乙酯、正己酸乙酯、(Z)-2-戊烯-1-醇、Z-3-己烯-1-醇、(Z)-己酸-3-己烯酯、水杨酸甲酯、羟基丙酮、呋喃酮、二氢芳樟醇、茉莉酮。根据PLSR模型中各挥发性成分在主成分上的载荷值来提取关键贡献成分,其中有16个挥发性化合物的载荷值在0.7以上,分别为α-紫罗酮、香叶醇、反式-橙花叔醇、β-水芹烯、罗勒烯、苯乙醇、苯甲醛、芳樟醇、β-紫罗酮、橙花醇、棕榈酸乙酯、3-糠醛、苯甲醇、己酸、反式-3-己烯酸、水杨酸甲酯,说明这16个挥发性化合物对宁红茶香气的贡献最大。16个挥发性化合物中α-紫罗酮、香叶醇、反式-橙花叔醇、β-水芹烯、罗勒烯、苯乙醇、苯甲醛、芳樟醇、β-紫罗酮、橙花醇、棕榈酸乙酯、3-糠醛、苯甲醇和水杨酸甲酯的呈香特性主要包括果香、花香、甜香、木香、清香和奶香等不同类型[25-26],对宁红茶的品质特征均具有正贡献,这些成分是宁红茶果香、甜香和花香的基本构架；而反式-3-己烯酸和己酸的呈香特征为刺激的乙酸试剂味和椰肉油气味等[14-15,27],对宁红茶的品质特征具有负贡献,可能是部分样品异味产生的主要来源。王秋霜等[18]对国内的名优红茶香气进行分析,发现水杨酸甲酯、橙花醇、芳樟醇、氧化芳樟醇是最主要的呈香物质；毛世红等[15]对工夫红茶的香气成分进行风味组学分析,发现橙花叔醇、苯甲醛、苯乙醛、芳樟醇、苯乙醇、(E)-β-紫罗兰酮环氧化合物、水杨酸甲酯、苯甲醇、脱氢芳樟醇、香叶醇、棕榈酸甲酯和芳樟醇氧化物是其基本香气骨架。李小嫄等[14]对国内工夫红茶的香气成分进行分析,发现橙花醇、罗勒烯、芳樟醇及其氧化物、月桂烯、橙花叔醇、香叶醇、柠檬烯、香叶基丙酮、反-2-壬烯醛、1-辛烯-3-醇、苯乙醇、水杨酸甲酯、α-萜品醇、β-环柠檬醛、异丁醛为关键呈香成分。与本研究发现的宁红茶在香气关键贡献成分上主要成分基本相同,而β-水芹烯、棕榈酸乙酯、3-糠醛、己酸、反式-3-己烯酸与目前已报道的结果存在差异,其原因有待进一步探讨。
3 结论与讨论
本研究对宁红茶感官特性与挥发性成分进行分析,主要结论如下：(1)采用定量描述分析法建立了宁红茶的香气描述系统,包括8个描绘词及其定义,该系统可以解释宁红茶香气变异的78.5%信息,其典型感官特性为以果香为主,甜香和花香为辅,变异系数显示果香和甜香在宁红茶香气中的强度差异性相对较小,其他6个属性的差异性较大,说明改良潜力较大。各香气分属性中花香和甜香之间密切相关,焙烤香和果香之间密切相关,辛香与清香之间密切相关,木香和异气与其他各分属性之间无相关性。(2)GC-MS共鉴定出74个共有挥发性成分,其中包括醇类20种、醛类9种、酮类8种、酸类6种,酯类12种,萜烯类3种、碳氢化合物9种和杂环类7种,以醇类含量最高,之后依次为酯类、酸类、醛类、酮类、碳氢化合物、杂环类和萜烯类。热图分析显示各样品之间的挥发性含量差异性较大,其中以香叶醇含量最高,按照文献[21]中的分类，宁红茶属于以香叶醇占优势型的工夫红茶。(3)PLSR模型结果显示提取的46个挥发性成分变量能够解释宁红茶香气变异的92%信息,说明此46个挥发性化合物决定了宁红茶样品的香气特征,依据载荷贡献最终筛选出了16个关键贡献挥发性化合物,分别为α-紫罗酮、香叶醇、反式-橙花叔醇、β-水芹烯、罗勒烯、苯乙醇、苯甲醛、芳樟醇、β-紫罗酮、橙花醇、棕榈酸乙酯、3-糠醛、苯甲醇、己酸、反式-3-己烯酸和水杨酸甲酯。其中反式-3-己烯酸和己酸为负贡献,其他14种为正贡献。因此,在宁红茶加工过程中,应最大可能的增加正贡献的挥发性化合物的含量,减少负贡献化合物的含量,进一步研究将集中在加工过程中宁红茶关键贡献香气成分的代谢途径及其调控机制,为宁红茶的品质定向调控提供基础。
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