酿酒大曲可以为白酒的酿造提供营养物质、香味成分,以及为微生物种群提供相关的生物酶,是浓香型和酱香型白酒重要的糖化发酵动力。常用的大曲原料有小麦、大麦和豌豆[1],原料经粉碎、加水拌和,压制成块状,天然接种,多菌种混合自然发酵而成[2]。在制曲时为防止有害菌的生长,制曲原料中有时会适当添加中草药。但无论是小麦、大麦、豌豆还是中草药,在种植过程中为防治病虫害几乎都会使用到杀虫剂、除草剂等农药,虽然在制作过程中原料和辅料经过清洗可减少部分农药残留,但仍会有农药残留,而曲药中的农药残留可能会部分迁移至酒中,影响酒的质量。目前,有关酒类产品中农药残留的检测研究已有很多,检测对象多为成品白酒[3]、葡萄酒[4-5]、黄酒[6]和啤酒[7]。虽然大型酒厂已将原料农药残留作为一项严控指标,但目前对白酒曲药中的农药残留检测分析尚少见报道。

农药残留的检测方法主要有：气相色谱法[7]、气相色谱串联质谱法[6]、高效液相色谱法[9]、液相色谱串联质谱法[8]、液相色谱-电喷雾质谱法[10]、超高效液相色谱-高分辨质谱法[11]、气/液相色谱-高分辨质谱法[4]等。在农药残留检测中,样品前处理技术的选择十分重要,常用处理方法为：固相萃取法[12]、固相微萃取法[13]、液-液萃取法[14]及QuEChERS法[15-16]等。QuEChERS法具有经济环保、操作简便、适用范围广等优点,但净化效果要相比固相萃取色谱法差,尤其是多组分同时监测时,杂质净化不彻底会造成离子干扰,影响定量准确性。

因此在利用QuEChERS法作为农药残留样品的前处理技术时,十分有必要结合一种更为有效的净化方式。超滤是一种加压膜分离技术,膜孔径介于微滤和反渗透之间,通过膜表面的微孔结构对物质进行选择性分离,在食品饮料、化工电子和生物环境等领域有着广泛的应用[17-18]。在一定压力下,小分子物质可穿过一定孔径的特制薄膜,而大分子物质不能透过,从而将两者分开。农药的分子质量一般小于500 Da,将超滤管应用到农药残留检测的前处理,截留物质的分子质量范围为1×103～ 1×105 Da[19],可以满足农药与食品中蛋白质及其他大分子杂质分离的目的[20]。

本文采用QuEChERS法结合超滤净化柱对样品进行前处理,再结合气相色谱法-三重四级杆质谱法(ultrafiltration purification combined with-chromatography triple quadrupole mass spectrometry,GC-QQQ)测定酿酒大曲中23种有机磷农药残留,以期快速、简便、准确地掌握大曲中农药残留情况,为提升白酒酿造品质提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酿酒大曲试样,酒企提供；QuEChERS提取包、m-PFC超滤净化柱 (复杂基质),北京绿棉科技有限公司；丙酮、二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯 (均为色谱纯),德国默克公司；乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶 (primary-secondary amine,PSA)、十八烷基硅烷键合硅胶(C18),天津博纳艾杰尔科技有限公司。

标准品(100 μg/mL)：敌敌畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷、灭线磷、甲拌磷、氧乐果、特丁硫磷、氯唑磷、甲基毒死蜱、乐果、甲基嘧啶磷、毒死蜱、甲基对硫磷、倍硫磷、马拉硫磷、杀螟硫磷、对硫磷、甲基异柳磷、水胺硫磷、杀扑磷、丙溴磷、硫环磷、三唑磷,环氧七氯B,农业农村部环境保护科研监测所。所有溶液均采用超纯水配制。

7890B—7000C气-质联用仪(配备Agilent7696A自动进样器),美国Agilent公司；MiLL-Q纯水机,美国Millipore公司；T10高速均质仪,德国IKA公司；TD5A-WS离心机,上海卢湘仪离心机仪器有限公司；MPEva GS平行浓缩仪,睿莱博仪器(广州)有限公司；XS204电子天平,梅特勒-托利多仪器 (上海) 有限公司；JL-721DTH数控超声波清洗器,中国南京科捷分析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

1.2.1.1 提取

振荡法提取：称取粉碎并过筛后的试样 5 g (精确至0.1 mg) 于50 mL聚丙烯具塞离心管中,加10 mL超纯水后涡旋混匀,静置 30 min,加入10 mL乙腈提取溶剂、QuEChERS提取包 (含6 g无水MgSO4、1.5 g醋酸钠) 及1颗陶瓷均质子,盖上离心管盖,剧烈振荡1 min,4 200 r/min 离心5 min,取上清液待净化[21]。

超声波法提取：称取粉碎并过筛后的试样 5 g (精确至0.1 mg) 于50 mL聚丙烯具塞离心管中,加10 mL超纯水后涡旋混匀,静置 30 min,加入10 mL乙腈提取溶剂,盖上离心管盖,超声萃取20 min,4 200 r/min离心 5 min,取上清液待净化。

均质法提取：称取粉碎并过筛后的试样 5 g (精确至0.1 mg) 于50 mL聚丙烯具塞离心管中,加10 mL超纯水后涡旋混匀,静置30 min,加入10 mL乙腈提取溶剂,均质提取1 min,4 200 r/min离心5 min,取上清液待净化。

1.2.1.2 净化

国家标准QuEChERS净化法：移取6 mL上清液加到含1 200 mg MgSO4、400 mg PSA及400 mg C18的15 mL塑料离心管中,漩涡混匀1 min,4 200 r/min离心5 min,准确吸取2 mL上清液,待用[21]。

超滤净化柱法：移取1 mL上清液,从超滤净化柱顶部加入,缓慢推动柱塞杆,使上清液缓慢通过净化材料,即净化完成,待用。

1.2.2 空白实验

除不加试样外,按照1.2.1小节中方法进行空白试验。

1.2.3 标准储备液与工作液的配制

混合标准溶液：吸取一定量的农药标准品于10 mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度。混合标准溶液质量浓度为5、10、50、100、500、1000 μg/L。

内标溶液：将质量浓度为100 μg/mL的环氧七氯B标准溶液,用乙酸乙酯稀释成质量浓度为100 μg/L的内标溶液。

基质混合标准工作液：空白基质溶液按1.2.1小节中方法处理后于40 ℃水浴中氮气吹至近干,分别加入1 mL相应质量浓度的混合标准溶液,复溶,过滤(0.22 μm有机滤头),上机测定。基质混合标准工作溶液现用现配。

1.2.4 气相色谱-质谱条件

1.2.4.1 气相色谱条件

色谱柱为安捷伦VF1701 (30 m×250 μm,0.25 μm)；程序升温：初始温度为40 ℃,保持1 min,以40 ℃/min升至120 ℃,再以5 ℃/min,升至240 ℃,再以12 ℃/min,升至300 ℃保留6 min；载气：氦气,纯度≥99.99%,流速1.0 mL/min；进样方式：2层夹层进样,气隙0.2 μL,样品进样1 μL,内标进样1 μL,脉冲不分流,0.75 min后打开隔垫吹扫阀。

1.2.4.2 质谱条件

EI源,电子能量70 eV；离子源温度 280 ℃,传输线温度 280 ℃；碰撞气为氮气,纯度≥99.999%；溶剂延迟 3 min；数据采集模式,MRM。

1.3 数据处理

利用 MassHunter(B.06.00.SP01)软件进行数据采集及处理,Excel 2016 计算测试数据回收率和相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)。

2 结果与分析

2.1 样品前处理优化

2.1.1 提取溶剂的选择

提取溶剂是影响目标物提取效率及基质效应的重要因素。分别采用丙酮、二氯甲烷、乙腈作为酿酒大曲中23种农药残留的提取溶剂,按1.2.1小节的样品预处理方法,分别加入10 mL丙酮、二氯甲烷、乙腈,考察不同溶剂对23种目标农药的提取效率。结果表明,丙酮、二氯甲烷、乙腈溶剂均可以将样品中的农药提取出来,其中以乙腈对绝大多数目标物的提取效果较好(85%～100%),可能是因为乙腈极性较强且分子较小,受基质的干扰最小(图1-a)。因此选择乙腈为目标物提取溶剂。

2.1.2 提取方式的选择

为了提高有机溶剂对目标农药的提取效率,选用常用的振荡法、超声波法、均质法3种提取方式(按1.2.1小节进行样品前处理)。如图1-b 所示,均质法的回收率(82%～102%)高于振荡法和超声波法。但由于均质的剪切力过强[22],易将大曲试样中的色素等物质一同萃取出来,给后续净化工作增加困难。超声波提取与振荡提取回收率接近,但超声波提取需要时间较长且提取过程不易控制,振荡法操作简单。因此选择剧烈振荡的提取方式。

2.1.3 净化条件的比较

分别采用国家标准法和超滤净化柱净化2种净化方式对试样进行净化处理,考察不同净化方法对酿酒大曲中23种目标物提取效率的影响。如图1-c所示,国家标准法(80%～92%)和超滤净化柱法(84%～103%)均有较好的回收效率,但超滤净化柱法极大地简化了实验流程,批处理样品更为简便快捷。

2.2 特征离子的选择

根据丰度和质荷比优化MRM条件,优化后的特征离子及碰撞能量见表1,MRM总离子流图见图2。

2.3 方法性能指标考察

2.3.1 线性关系

在优化实验条件下,以1.2.2小节的方法配制混合标准工作溶液,上机测定。以目标物与内标物的相对质量浓度为横坐标,以目标物与内标物的相对峰面积比为纵坐标,进行线性回归,得到各目标物线性关系,以R2≥0.99为判断指标,确定各目标物的线性范围,具体参数见表1。由表1可知所有目标物的R2均达到0.999以上,表明23种农药均具有很好的线性关系,能够很好的满足分析要求。

2.3.2 回收率、检出限与定量限

目前国家未对酿酒曲药农药残留制定限量标准,但曲药大多以谷物为主要原料,本实验参照GB/T 27404—2008[23],结合GB 2763—2019中谷物类农药残留限量[24],选取3个质量浓度水平(0.05、0.1、0.2 mg/kg),以酿酒大曲为基质做加标回收试验,每个质量浓度做6次平行,计算平均回收率和相对标准偏差(RSD)。由表2可知,结果表明23种目标物的回收率在85%～106%,相对标准偏差均小于10%。以0.05 mg/kg添加水平为依据,采用特征离子质量色谱图信噪比S/N≥3计算检出限和以S/N≥10计算定量限。结果显示检测限和定量限分别在0.002～0.035 mg/kg和0.007～0.118 mg/kg,满足GB 2763—2019中对谷物类农药残留检测的要求。

2.4 实际样品检测

利用优化后的实验方法检测了10组酿酒大曲,大部分曲药未检出农药残留,只有1组样品中检出毒死蜱(0.013 mg/kg)和马拉硫磷(0.020 mg/kg),检测结果见表3。

3 结论与讨论

采用GC-QQQ法对酿酒大曲中可能存在的23种有机磷农药进行同时检测，对样品前处理方法进行了优化，以乙腈为提取剂获得了较好的回收率；提取方式上，振荡法操作简单、快速，对23种目标农药的回收率与超声波法接近，在试样提取过程控制上优于均质法和超声波法；考查了国家标准法、超滤净化柱2种净化方式,国家标准[21]中采用的净化方式是试样经提取、离心后取上清液加入无水硫酸镁、PSA和C18。其中无水硫酸镁为干燥剂,主要目的是去除提取液中的水,以保证其他净化物的吸附效果。PSA和C18作为净化物,由于PSA中含2个氨基,提供了更大的离子交换容量,能通过氢键萃取极性化合物,经PSA净化后的样品极性化合物保留度较高,且能有效去除样品基质中的有机酸、色素和糖类杂质；C18的有效成分是硅胶键合的十八烷基,具有疏水性,主要是去除脂肪和非极性物质。2种净化方式对目标农药的回收效率接近,但超滤净化柱法批处理样品更为简便快捷。

在前处理优化方案的基础上,建立了QuEChERS-GC-QQQ对酿酒大曲中可能存在的23种有机磷农药进行同时检测的方法。方法前处理简单、快速,23种有机磷农药的检出限、定量限和回收率均能满足农药残留分析检测技术[21]要求,可用于酿酒大曲中多种农药残留检测分析。

参考文献

[1] 敖宗华,陕小虎,沈才洪,等.国内主要大曲相关标准及研究进展[J].酿酒科技,2010(2):104-108.

AO Z H,SHAN X H,SHEN C H,et al.Domestic related quality standards of Daqu & its research progress[J].Liquor-making Science & Technology,2010(2):104-108.

[2] 乔宗伟,张霞,施思,等.不同感官质量曲药在培曲过程中理化指标变化规律研究[J].中国酿造,2016,35(10):116-119.

QIAO Z W,ZHANG X,SHI S,et al.Change of physicochemical indexes in the cultivation process of Daqu with different sensory quality[J].China Brewing,2016,35(10):116-119.

[3] 王春利,籍芳,孙玉慧,等.液液萃取-气相色谱-质谱联用快速检测白酒中多种农药残留[J].酿酒科技,2018(2):117-121.

WANG C L,JI F,SUN Y H,et al.Rapid determination of multiresidue pesticides in Baijiu by GC-MS coupled with liquid-liquid extraction[J].Liquor-making Science & Technology,2018(2):117-121.

[4] 徐豪, 李洋,张廷廷,等.色谱分析法在葡萄酒农药残留检测中的应用进展[J].食品安全质量检测学报,2020,11(6):1 695-1 701.

XU H,LI Y,ZHANG T T,et al.Application of chromatography in the detection of pesticide residues in wine[J].Journal of Food Safety and Quality,2020,11(6):1 695-1 701.

[5] PELAJIC M,PECEK G,MUTAVDZIC P D,et al.Novel multiresidue method for determination of pesticides in red wine using gas chromatography-mass spectrometry and solid phase extraction[J].Food Chemistry,2016,200:98-106.

[6] 李进义,闵国平,方云波,等.气相色谱-质谱测定黄酒中的敌敌畏[J].中国卫生检验杂志,2019,29(16):1 935-1 937；1 941.

LI J Y,MIN G P,FANG Y B,et al.Determination of dichlorvos in Chinese rice wine by GC-MS[J].Chinese Journal of Health Laboratory Technology,2019,29(16):1 935-1 937；1 941.

[7] 柴宗龙,钱滢文,袁彩霞,等.气相色谱检测啤酒中十六种有机磷农药残留方法的建立[J].食品工业科技,2020,41(14)：204-209.

CHAI Z L,QIAN Y W,YUAN C X,et al.Establishment of gas chromatographic (GC) method for the detection of 16 kinds of organophosphorus (Ops) pesticide residues in Beer[J].Science and Technology of Food Industry,2020,41(14):204-209.

[8] GOLGE O,KOLUMAN A,KABAK B.Validation of a modified QuEChERS method for the determination of 167 pesticides in milk and milkproducts by LC-MS/MS[J].Food Analytical Methods,2018,11(4):1 122-1 148.

[9] 刘钰,庄占兴,刘军,等.高效液相色谱法检测20%噁唑酰草胺·灭草松微乳剂[J].山东化工,2020,49(12):64-66.

LIU Y,ZHUANG Z X,LIU J,et al.Analysis of Metamifop+Bentazone20% ME by HPLC[J].Shandong Chemical Industry,2020,49(12):64-66.

[10] 王蓉,付大友,李艳清,等.液相色谱-电喷雾质谱法测定白酒中5种有机磷农药残留[J].酿酒科技,2008(6):103-105.

WANG R,FU D Y,LI Y Q,et al.Determination of five kinds of organophosphorous pesticide residue in liquor by high performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].Liquor-making Science & Technology,2008(6):103-105.

[11] 赵妍,杨军,辛少鲲,等.超高效液相色谱-高分辨质谱法测定牛奶中新烟碱类农药残留[J].中国食品卫生杂志,2020,32(2):139-145.

ZHAO Y,YANG J,XIN S K,et al.Determination of neonicotinoid residues in milk by ultra-high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry[J].Chinese Journal of Food Hygiene,2020,32(2):139-145.

[12] HOU X,LEI S R,QIU S T,et al.A multi-residue method for the determination of pesticides in tea using multi-walled carbon nanotubes as a dispersive solid phase extraction absorbent[J].Food Chemistry,2014,153:121-129.

[13] LI J X,ZHANG Z J,SUN M Y,et al.Use of a headspace solid-phase microextraction-based methodology followed by gas chromatography-tandem mass spectrometry for pesticide multiresidue determination in teas[J].Chromatographia,2018,81(5):809-821.

[14] FANG Y,TIAN W,PEI F,et al.Simultaneous determination of pesticide residues and antioxidants in blended oil using a liquid-liquid extraction combined with dispersive solid phase extraction method[J].Food Chemistry,2017,229:347-353.

[15] KACZYNSKI P,LOZOWICKA B.One step QuEChERS-based approach to extraction and cleanup in multiresidue analysis of sulfonylurea herbicides in cereals by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Food Analytical Method.2017,10(1):147-160.

[16] BI S Y,ZHU Z Q,CHI W H,et al.Determination of eight organophosphorus pesticide residues in pepper by QuEChERS-Gas chromatography[J].Agricultural Biotechnology,2018,7(1):123-125.

[17] 黄阿根,董瑞建,葛庆丰.超滤用于茶树花多酚纯化工艺的研究[J].食品与发酵工业,2007,33(8):158-162.

HUANG A G,DONG R J,GE Q F.Studies on the purification of polyphenols from tea plant flower by ultra-filtration[J].Food and Fermentation Sciences & Technology,2007,33(8):158-162.

[18] 黄瑾辉,曾光明,方瑶瑶,等.基于复配胶团的强化超滤处理含镉废水[J].中国环境科学,2007,27(3):317-321.

HUANG J H,ZENG G M,FANG Y Y,et al.Treatment of wastewater containing cadmium ions by micellar-enhanced ultrafiltration with nonionic surfactants mixed micelles[J].China Environmental Science,2007,27(3):317-321.

[19] 宓捷波,王云凤,陈其勇,等.超滤净化-气相色谱-质谱法测定鸡肉中四种有机氯农药的残留量[J].理化检验(化学分册),2010(7):748-750；753.

MI J B,WANG Y F,CHEN Q Y,et al.GC-MS Determination of four residual organochlorine pesticides in chicken after purification by ultrafiltration[J].Physical Testing and Chemical Analysis (Part B:Chemical Analysis),2010(7):748-750.

[20] 鞠玲燕,宋晓华,谷婕,等.超滤管净化/高效液相色谱-串联质谱法测定动物源食品中喹诺酮类药物残留[J].分析测试学报,2016,35(1):42-47.

JU L Y,SONG X H,GU J,et al.Determination of quinolones residues in animal-originated foodstuffs by ultrafiltration tube cleaning and high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Journal of Instrumental Analysis,2016,35(1):42-47.

[21] 中华人民共和国国家卫生健康委员会,中华人民共和国农业农村部,国家市场监督管理总局.GB 23200.113—2018 食品安全国家标准植物源性食品中208种农药及其代谢物残留量的测定气相色谱-质谱联用法[S].北京:中国标准出版社,2018.

National Health Commission of the People’s Republic of China,Ministry of Agriculture and Rural Affairs of the People’s Republic of China,State Administration for Market Regulation.GB 23200.113—2018 National food safety standard-determination of 208 pesticides and metabolites residues in foods of plant origin Gas chromatography-tandem mass spectrometry method[S].Beijing:China Standards Press,2018.

[22] 王娟,刘兴平,王明,等.糟醅农残多联GC-MS/MS检测方法研究[J].食品与发酵科技,2015,51(4):69-74.

WANG J,LIU X P,WANG M,et al.Optimization of sample preparation of pesticides in fermented grains by GC-MS/MS[J].Food and Fermentation Sciences & Technology,2015,51(4):69-74.

[23] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫局,中国国家标准化管理委员会.GB/T 27404—2008 实验室质量控制规范 食品理化检测[S].北京:中国标准出版社,2008.

State Administration of Quality Supervision,Inspection and Quarantine of the People’s Republic of China,China National Standardization Administration Committee.GB/T 27404—2008 Criterion on quality control of laboratories[S].Beijing:China Standards Press,2009.

[24] 中华人民共和国国家卫生健康委员会,中华人民共和国农业农村部,国家市场监督管理总局.GB 2763—2019 食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量[S].北京:中国标准出版社,2019.

National Health Commission of the People’s Republic of China,Ministry of Agriculture and Rural Affairs of the People’s Republic of China,State Administration for Market Regulation.GB 2763—2019 National food safety standard-Maximum residue limits for pesticides in food[S].Beijing:China Standards Press,2019.

QuEChERS-application of ultrafiltration combined with GC-QQQ in the determination of multiple pesticide residues in liquor-making Daqu

CAO Xuhan1,HUANG Xiaojun2*,YE Lin2,PAN Caihui2

1(Sichuan Vocational College of Chemical Technology,Luzhou 646000,China) 2(Sichuan National Inspection and Testing Co.Ltd.,Luzhou 646000,China)

Abstract High dosage of Daqu used in the winemaking process will lead to pesticide residues in it partially migrate to the wine.Thus contributes to the level of pesticide residues in the finished wine.This study was carried out to realize a simultaneous determination of 23 organophosphorus pesticides in liquor-making Daqu by ultrafiltration combined with gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry (GC-QQQ).The samples were extracted by acetonitrile,followed by QuEChERS--ultrafiltration,and then determination by GC-QQQ.According to the results,there was a good linear relationship between the mass concentration and peak area of the 23 pesticides within the range of 10-1 000 μg/L,with the correlation coefficient (R) of greater than 0.999.Furthermore,at three addition levels,the rate of recovery of sample addition ranged from 85% to 106%,and the relative standard deviations were all less than 10%.Besides,the limits of detection and quantitation of the 23 pesticides were 0.002-0.035 mg/kg and 0.007-0.118 mg/kg, respectively.To sum up, the proposed method in our study is simple and rapid in operation with good reproducibility and high stability, which can meet the detection requirement of 23 pesticide residues in liquor-making Daqu.

Key words ultrafiltration purification;gas chromatography-mass spectrometry;Daqu;organophosphorous pesticide;pesticide residue

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.026421

引用格式:曹栩菡,黄小军,叶麟,等.QuEChERS-超滤净化结合GC-QQQ测定酿酒大曲中多种农药残留量[J].食品与发酵工业,2021,47(7):238-243.CAO Xuhan,HUANG Xiaojun,YE Lin,et al.QuEChERS--application of ultrafiltration combined with GC-QQQ in the determination of multiple pesticide residues in liquor-making Daqu[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(7):238-243.

第一作者：硕士，讲师(黄小军工程师为通讯作者，E-mail：331547275@qq.com)

收稿日期：2020-12-09,改回日期：2021-01-15