白酒是我国特有的传统饮料酒种,酿造工艺复杂。根据其发酵原料、糖化发酵剂种类、生产工艺等不同,可分为酱香型、浓香型、清香型、清酱香型等十几种香型。白酒的酿造属于典型的多菌种固态发酵模式,发酵微生物是其酿造核心动力,微生物群落结构多样性特征决定了白酒的风味与质量,对解析白酒风味成分及其发酵机理具有重要意义。然而传统白酒自然发酵的开放式酿造致使其中的微生物结构极其复杂,使得解析微生物及其风味代谢机理成为了白酒酿造基础研究领域中的重难点之一。基因组学技术以其通量高、规模大等特点为复杂多样的微生物研究提供了新的技术手段[1],能够对参与酿造的微生物基因组进行深度测序,成为架起酿造复杂微生物与风味成分之间的第一道桥梁。
近年,基因组学研究技术越来越多地被应用于食品微生物的研究中,针对白酒酿造中复杂的微生物,基因组学也为揭示其中的许多“未知因素”提供了有效方法。如邓杰等[2]应用高通量测序技术解析浓香型白酒的微生物群落,结果表明该方法优于其他分子生物学技术,能更加完整和准确地鉴别微生物群落、功能菌等;近2年,研究者们采用基因组学策略解析酱香型白酒制曲、制酒等发酵过程中参与的微生物菌群结构多样性、微生态多样性特征等,揭示了酱香白酒酿造过程中不为人知的菌群结构及资源,为解析传统白酒酿造过程中微生物来源、生态结构等提供了科学依据[3-6]。上述研究表明,基因组学技术能够从基因水平揭示白酒酿造微生物组成、结构、功能、代谢机制等信息,为传统白酒的现代化酿造和转型升级提供科技支撑。本文主要概述基因组学的关键技术及其在白酒酿造基础研究领域中的应用,并介绍多组学方法在该领域的应用现状。
自1896年美国生物学家Walter Gilbert提出基因组研究的3个重要技术领域以来[7],基因组学技术日趋完善,包括基因组测序、测序数据处理、基因预测与注释等,解析微生物序列、物种结构、功能组成等信息。在白酒酿造基础研究领域中,基因组学技术同样为研究传统白酒酿造微生物提供了有效方法,是解析复杂风味物质及微生物代谢机制的前提。图1总结了传统研究技术与基因组学技术在解决微生物问题方面的差异。
基因组学的核心技术是基因组测序,高通量测序是目前最普及的测序技术,以其产出通量高,工作量小,信息量大等特点能够实现快速测序,包括微生物全基因、宏基因组、16S rRNA等多种方法[8]。微生物全基因组测序的应用可实现对单个细胞或生物体遗传物质信息总和的分析,如WU等[9]利用Illumina平台解析某酒厂生产过程中地衣芽孢杆菌GMCC3963全基因组序列,结果表明该测序方法对序列区域覆盖度高,覆盖约200倍基因组的888 Mb成对末端数据。微生物宏基因组测序以微生物群体作为研究对象,通常用于解析白酒发酵酒醅、酒糟、窖泥等群体微生物。如GUO等[10]利用Illumina平台对浓香型白酒发酵窖池中的微生物群落进行宏基因组测序,结果表明样品中微生物群落结构存在显著差异。16S rRNA与ITS测序是常用的扩增子测序方法,可用于鉴定样本中的细菌或真菌,比较复杂环境中微生物的系统发育和分类,探索微生物群落组成信息。如罗方雯等[5]利用ITS及16S rDNA引物测序解析茅台镇不同主酿区域生产用大曲样品真菌及细菌结构多样性特征,并首次检出酱香型白酒酿造环境中的特点酵母属等微生物,丰富了白酒酿造微生物资源。
图1 传统研究技术与基因组学技术在解决微生物研究问题方面的差异
Fig.1 The difference between traditional research and genomics techniques in solving the problem of microbial research
DNA或RNA有上千个碱基长序列,而高通量测序技术存在碱基读取短(200~300 bp)、可靠性低、易引入错误率等问题,为获得完整的微生物基因组信息,测序时需将DNA或RNA分割成小片段,并于测序后利用软件将其拼接成完整序列及质量控制。根据不同的数据类型,可采用相应的拼接及质控软件,在传统白酒酿造微生物基因研究中比较常用的是Fast Length Adjustment of Short Reads(FLASH)[11]软件,将测序产生的paired-end reads快速拼接为DNA片段,并在此基础上利用Trimmomatic[12]软件对序列进行质量控制,以得到高质量且完整的微生物基因序列信息。
通过分析处理获得微生物序列信息是基因组学研究的难点之一。近年,已建立多种分析方法,包括基因组分装(binning)、基因组样本比较及分类、基因组结构及功能注释等[13]。其中,核心技术是通过基因组注释获得微生物基因序列的结构和功能信息,主要分为2步:第1步是基因组结构注释。预测基因组结构,搜索基因组中开放阅读框(ORF)[13],以获得微生物基因功能信息,常在NCBI(National Center for Biotechnology Information)平台上采用Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) [14]比对定位已知基因并确定基因信息。第2步是基因功能注释。包括基因功能注释、非编码RNA注释等。该方法主要通过与各种功能数据库,如SWISS-PROT(注释性蛋白序列数据库)[15]、GO(描述分子功能、生物过程和细胞成分的数据库)[16]、COG(同源蛋白组群数据库)[17]、KEGG(基因、蛋白质、化学物质组成的数据库资源)[18]比对序列及捕获基因的功能信息。
基因组网络指获得微生物基因组信息并聚类后构建相邻基因间的连接关系,以网络图的方式组织可视化基因组信息,研究基因组内的微生物系统发育关系,探讨微生物的遗传特征及多样性等[19]。如,JIANG等[20]基于基因同源关系和位置信息创建了构建基因组网络的方法,称为基因组拓扑网络(Genome Topology Network, GTN),用于研究密切相关的微生物基因组之间的结构变异,但该方法仅限于对完整基因组的研究;面对占绝大多数不完整的基因组,邓啸[19]对该方法进行了改进,以分析绝大部分不完整基因组。地衣芽孢杆菌作为白酒酿造过程中的高温优势菌株,对其基因组拓扑网络的研究同样重要,如郭静等[21]利用拓扑网络结构研究地衣芽孢杆菌的蛋白质相互作用(PPI),结果表明PPI网络在环境胁迫下的拓扑结构非常稳定,在任何环境条件下都对维持细胞生存起到了至关重要的作用,该研究为解析白酒酿造过程中的重要微生物提供了方法参考。
众所周知,微生物对白酒的质量、风味起着决定性作用,然而白酒酿造微生物之间存在复杂的共生、拮抗、竞争[22]等种间关系,以整体协作的方式推动着白酒发酵的进行,因而有必要系统解析微生物的群落结构。基因组学技术具有快速解析的优势,被应用于解析白酒发酵微生物群落结构、优势菌种、未知菌种等信息。表1总结了基因组学在传统白酒酿造微生物群落结构研究中的应用现状。
表1 基因组学在传统白酒酿造微生物群落结构研究中的应用现状
Table 1 Research status of genomic technology in Baijiu microbial community
研究者及年份试验对象分析目的研究结果任爱容等[23](2020)不同主酿区生产用酱香型大曲细菌群落结构利用基因组学技术解析茅台镇不同主酿区域细菌菌群结构,结果表明各主酿区域微生物具有其特点及共性,充分证明了茅台镇产酱香白酒的整体优势及生态结构的稳定性。张艳[24](2015)酱香型白酒酿造酒醅乳酸菌群落结构利用基因组学技术解析酱香型白酒发酵中乳酸菌菌群结构,结果表明样品中乳酸菌的优势菌种不同,并与其他微生物属存在相关性,为白酒酿造中乳酸菌群的研究提供数据。WANG等[25](2019)酱香型大曲、窖池细菌群落结构利用宏基因组学技术解析茅台酒发酵过程细菌群落结构,结果表明样品中的优势微生物随发酵时期的变化及差异性,为后期研究发酵过程微生物动力学变化提供参考数据。勾文君等[26](2019)洋河酒窖泥细菌群落结构利用宏基因组学技术解析不同窖龄的窖泥中微生物群落结构,结果表明样品中微生物群落结构的变化规律及差异性,以此利用微生物群落组成特征判定窖泥质量及功能预测。王雪山[27](2018)清香型白酒酿造酒醅细菌种群结构利用宏基因组学研究技术解析白酒新老酒厂中微生物群落,结果表明发酵环境引起发酵微生物演替并与风味物质相关,为认识微生物群落与代谢物间的相关性研究提供基础。刘芸雅[28](2015)绍兴麦曲及黄酒发酵液细菌/真菌群落结构利用宏基因组学技术解析黄酒发酵过程中细菌、真菌群落结构,获得不同发酵阶段微生物群落组成及变化趋势,为后续发酵机理及风味形成机制的研究提供了基础。
获得群落中微生物信息以后,则需利用生物信息学手段对所获得的测序数据进行群落结构解析,分析思路如图2所示。
图2 微生物群落结构分析思路总结
Fig.2 The ideas of microbial community structure analysis
与以往解析多样性方法相比,基因组学技术凭借其直接、快速、深入的特点,越来越多地被应用于解析白酒酿造微生物多样性信息。常利用聚类反应产出样本中物种数目,了解微生物多样性变化趋势,常见的丰度估计方法有α-多样性和β-多样性等。如王雪山等[27]为考察清香型白酒发酵过程中新、老酒厂的微生物种群演替差异,通过高通量测序及α-多样性解析,表明不同环境酒醅中细菌多样性随时间变化规律差异较大;LI等[29]利用宏基因组测序考察经代谢芳香成分的酵母菌株强化的大曲对发酵微生物群落多样性的影响,最终结果表明基于操作分类单元的所有稀疏曲线都趋于饱和,序列很好的表示了物种的多样性。此外,考察发酵环境、原料和人工等因素对白酒酿造微生物多样性的影响同样很重要,如黎瑶依等[30]利用宏基因组学技术解析茅台镇酱香型白酒各生产主酿区域的环境真菌菌群多样性,结果表明酿造环境中标志性真菌随酿造时空径向变化而变化,且主要微生物的相对稳定性是维持酿造微生态的关键。基因组学技术被证明可以高效的解析内在、外在因素对复杂微生物群落及多样性的影响,为了解白酒工业化生产过程中的影响因素提供科学方法。
解析白酒主体香成分一直以来是研究者关注的热点,目前,浓香型、清香型白酒的主体香已明确,而酱香型白酒的主体香至今仍不清晰,对白酒风味成分的认识仍为欠缺,主要存在2大问题:一是对白酒酿造微生物的功能基因认识不清晰;二是对其代谢机制认识不清晰。基因组学被认为是对以上研究有利的,目前的研究主要集中在产风味和其他功能基因解析两方面。
解析风味产物是白酒酿造研究中的突破点之一,以基因表达、特征风味化合物为导向解析微生物代谢物机理的策略为基因调控酶,酶参与调控代谢途径及产物,以该思路可正向、逆向解析微生物功能基因。如LIU等[31]曾以该思路为导向解析绍兴机械化黄酒发酵醪微生物,经Illumina平台测序、基因预测及图谱构建了一个风味代谢网络,实现注释基因ID、酶与微生物群的网络连接,以此解析产生风味物质的功能基因,该方法的应用从“源头”加深对白酒风味的认识。类似的研究还有LI等[32]从茅台风味大曲中分离到嗜热菌Laceyella sacchari FBKL 4.010菌株,利用全基因组解析及功能注释发现其具有风味成分四甲基吡嗪形成的关键基因,为研究菌株的产香功能提供参考。上述研究表明,基因组学可应用于挖掘功能基因,深度解析白酒酿造过程中的功能贡献微生物,实现对其根本性认识,为白酒工业化高质量生产的研究指明方向。
酱香型白酒的特殊酿造环境使微生物具有高渗、高温等环境胁迫特征[33],基因组学技术则是深入认识微生物特殊功能的重要手段。如LU等[34]利用基因组技术从酱香型白酒酿造过程发现1株酵母具有强化代谢通路的基因组系统,并结合转录组技术明确其共碳化功能的基因机理,该研究为提高菌株的育种策略提供了研究基础。WANG等[35]从某窖泥菌株全基因组中解析到调控乙醇合成己酸的相关基因,而己酸可再转化为白酒关键风味物质己酸乙酯,该研究为调控白酒生产过程中风味物质己酸乙酯的生物合成研究提供方向。
白酒酿造微生物多样性特征明显且来源较为复杂,然而目前对绝大多数酿造环境微生物及特殊产物来源的认识尚为缺乏。基因组学技术对微生物基因组的深度测序和功能解析,可溯源白酒酿造过程中有益、有害微生物及产物以期在白酒生产过程中达到“扬长避短”,调控优质白酒工业化酿造的目的。
对于白酒开放式酿造过程中外界微生物是如何运动并参与到生产过程中的,人们知之甚少,也是为何1975年茅台易地生产失败的原因。BOKULICH等[36]曾利用分子生物学结合统计学方法跟踪监测食品发酵生产建筑周围的有益、有害微生物,以实现对食品发酵过程中微生物迁移方向及影响因素的认识,该研究为追溯白酒酿造过程中复杂微生物来源提供了思路,而宏基因组学技术则是其中的关键手段之一。在白酒的酿造的研究中,WANG等[37]利用基因组学技术解析浓香型白酒生产过程中微生物来源,统计分析特征微生物及环境限定微生物,结果表明大曲是好氧菌和兼性好氧菌的主要来源,而发酵窖泥则是发酵厌氧菌的缓释源。该方法追溯到了发酵过程中微生物群落的来源,为控制白酒酿造过程中复杂微生物提供了方向。
清晰认识白酒酿造微生物代谢产物及其来源是实现优质白酒可控性生产的基础,对产物的溯源有助于完善白酒发酵代谢物的系统性研究。卢建军等[38]将基因组序列与功能数据库比对,获得白酒发酵代谢产物正丙醇的代谢途径及参与其中的酶,故而通过酶搜索到关键微生物信息,以此溯源功能物质正丙醇。在另一项研究中,LI等[32]首先通过GC-MS解析到菌株FBKL 4.010产生最丰富的风味成分是四甲基吡嗪,再以物质、酶、基因为核心思想,逆向研究发现FBKL 4.010菌株中四甲基吡嗪代谢的关键基因并明确其代谢途径,为其他未确认功能基因的识别提供了指导。
基因组学技术可实现对白酒酿造微生物更深入的认识,以及后来兴起的全基因组关联研究(genome wide association study,GWAS)也为研究微生物遗传性状基因及其演变提供了手段,然而单方面的研究并不能完全揭示生物体的生命现象,因此需要应用多组学结合技术帮助我们解析白酒酿造微生物的整个生命过程。
全基因组关联研究是利用高通量基因分型技术在基因范围内寻找单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNPs),起初是用于研究复杂疾病变异基因。随着研究技术的不断完善,越来越多地被应用于包括白酒酿造在内的多个领域中,发现影响性状表达的基因,探索微生物演变情况,优化菌种资源。如张伟平[39]为降低黄酒发酵过程中尿素的积累,利用全基因组关联分析定位酿酒酵母的氮源代谢及尿素积累相关基因,结果表明该技术能够从差异众多的基因组中找到关键基因。JACKSON等[40]在菌株基因组的基础上进行关联分析,解析酿酒酵母的遗传变异基因,对千余株酿酒酵母的SNPs进行主成分分析,探索其演化和起源情况,为研究菌株性状的遗传结构和遗传缺失的来源提供了参考。
GWAS仅针对基因层面,多组学结合技术则以核酸组、蛋白组、代谢组的结合实现从本质、表象、结果3方面揭示单一组学难以揭示的生命现象。近几年,对白酒酿造微生物的研究主要集中在分别利用各组学研究微生物差异表达基因、发酵微生物间相互作用、解析代谢产物等。随着科学研究的发展,多组学技术研究白酒酿造微生物越来越多的被应用,2015年,LU等[34]从白酒生产环境中分离到1株茅台酒酿造用菌株MT1,结合基因组及转录组技术比较分析菌株的SNPs、插入和缺失基因等,发现其关键编码酶的功能基因,由此确定该菌株的多碳利用性及共化机理。2017年,XU等[41]利用基因组结合转录组技术研究酱香型白酒酿造酵母Zygosaccharomyces bailii MT15的发酵特性及其对特征风味的贡献,比较发现其产特征风味的功能基因及其表达水平,以此确定MT15菌株的风味贡献基因及机制。多组学结合技术相比单组学可较全面研究白酒酿造中微生物基因、表达、调控、代谢物间的关系,以准确、快捷、可见的方式为白酒酿造过程中未知的微生物问题“解谜”。
基因组学技术的发展使得人们对微生物的研究达到了前所未有的深度,如前文所述,基因组学已形成一套固有的分析技术体系,对研究微生物及其风味代谢物具有重要意义,可实现对酿造过程微生物及其代谢等的多方面认识。随着科学研究技术的发展,基因组学用于解析白酒酿造微生态已逐渐成为一大热门,但仍存在研究主要集中于解析群落微生物结构及多样性,未能充分解析基因组数据,同时对多组学技术的应用不全面等问题。今后可从以下几个方面对白酒酿造微生物开展深入研究:(1)充分利用基因组数据,从微生物结构及多样性的基因解析层面上升到对微生物的基因挖掘中;(2)基因组学与生物信息学密不可分,对于庞大的基因组数据来说,生物信息学是基因组研究中强有力的手段,数字化及功能化应协同跟上;(3)整体性利用多组学结合技术,提高对白酒酿造微生物的多层次认识。
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