2019年,全国水产品产量总计6 480.36万t,比上年增长0.35%[1]。较之畜禽类食品,水产品不仅味道鲜美、脂肪含量低,还含有丰富的DHA、EPA、牛磺酸等营养成分,因而受到消费者喜爱[2]。然而,水产品具有高水分和高蛋白的特点,在贮运过程中极易腐败变质,其中微生物是引起腐败的主要原因[3]。鲜鱼在捕捞和运输过程中,微生物可通过鱼的腮部、体表黏液、破损的表皮和肠道等侵入机体并不断增殖,分解营养物质,产生胺类、酯类、硫化物等腐臭特征的产物,导致鱼肉原有形态、色泽和风味产生劣变[2,4]。这一过程中,鱼体内只有部分适合生存和繁殖的菌群参与腐败,并产生腐败臭味和异味代谢产物,成为该产品的特定腐败菌[4-5]。
水产品中最常见的腐败菌包括腐败希瓦氏菌、明亮发光杆菌、乳酸菌和假单胞菌[5-7]。腐败希瓦氏菌属于革兰氏阴性好氧菌,能够产生H2S、三甲胺(trimethylamine,TMA)及生物胺等[6],是大黄鱼[8]和大菱鲆[9]等海产品的特定腐败菌。假单胞菌是冷藏罗非鱼[10]和鲤鱼[11]等淡水鱼的特定腐败菌。腐败菌在导致不同鱼类腐败的过程中,初始菌数和腐败速率是影响产品货架期的主要因素,初始菌数主要与鱼类栖息水域相关,而腐败速率主要由温度、pH、盐分和鱼种类等因素决定。水产品在加工过程中常采用低温处理、降低水分活性、酸化、降低氧化还原值和添加防腐剂等措施调控目标微生物的生长活动[12],因此,选择高效和针对性的控菌抑菌手段成为研究热点。
本文以源自有氧低温贮藏的大黄鱼和罗非鱼的特定腐败菌腐败希瓦氏菌和假单胞菌为对象,探究其在底物、温度、pH和NaCl影响下的生长动态,采用Gompertz方程拟合生长曲线,分析环境因子和强度对其最大比生长速率(μmax)和迟滞期(λ)的影响,为深入了解微生物生存的生态系统变化对细菌产生的胁迫作用和响应机制提供基础,为靶向抑菌和延长产品货架期等提供支撑。
1 材料与方法
1.1 原料与试剂
原料：腐败希瓦氏菌(Shewanella pulrefaciens)和假单胞菌(Pseudomonas spp.)分别从大黄鱼和罗非鱼中分离、筛选、鉴定并于4 ℃斜面冷藏。
试剂：胰蛋白胨大豆胨肉汤(tryptone soybean peptone broth TSB)、胰蛋白胨大豆胨琼脂(tryptone soybean peptone agar,TSA),英国OXOID；NaCl,上海市国药集团化学试剂有限公司；1 mol/L HCl溶液,深圳市博材达科技有限公司。
1.2 仪器与设备
pH计(pHS-3C),上海雷磁仪器厂；低温培养箱(MIR-153,253),日本三洋公司；洁净工作台(SW-CJ-1FB),上海博讯实业有限公司医疗设备厂。
1.3 实验方法
1.3.1 接种物的制备
取斜面保藏的菌株接入装有4 mL生理盐水的比浊管中,当接种量达到108CFU/g时,依次进行10倍梯度稀释至102～103 CFU/g,然后接种到TSB和鱼块中,鱼块接种方法参照文献[13]。
1.3.2 实验设计
研究不同底物(TSB、大黄鱼、大菱鲆、鲤鱼和罗非鱼)、pH(4、5、6、7)、NaCl质量分数(0.5%、2.0%、3.5%)和温度(0、8、15、25 ℃)条件下腐败希瓦氏菌和假单胞菌的生长曲线和动力学参数,于TSA上计数。
研究底物对菌株生长影响时,温度设定为5 ℃,腐败希瓦氏菌分别接种在TSB、大黄鱼、大菱鲆和鲤鱼鱼块上,假单胞菌接种在TSB、鲤鱼和罗非鱼鱼块上；研究pH和NaCl对菌株生长影响时,使用1 mol/L HCl溶液调整TSB的pH值为4、5、6和7,调节NaCl质量分数为0.5%、2.0%、3.5%和5.5%,腐败希瓦氏菌假单胞菌和接种在TSB中15 ℃培养；研究温度对菌株生长影响时,调整TSB的pH值为7,NaCl质量分数为0.5%,腐败希瓦氏菌和假单胞菌接种在TSB中分别于0、8、15和25 ℃培养。
1.3.3 生长曲线拟合
采用Gompertz方程[14]对细菌生长进行拟合。
(1)
式中：t,时间,h；N(t),t时的菌数(CUF/g),初始菌数N0(lgCFU/g),最大菌数Nmax (CFU/g);μmax,最大比生长速率,h-1;Lag,延滞期,h,。
描述温度对μmax的影响时采用Belehradek方程[15]：
(2)
式中：T,摄氏温度,℃；Tmin,生长的最低温度,即在此温度时最大比生长速率为零；b,常数。
1.3.4 统计分析
使用SPSS(17.0 version)统计软件对实验数据进行单因素方差分析及最小显著差异法分析,当P>0.05 时差异不显著。实验数据用SPSS(17.0 version)统计软件进行回归并求得置信区间。
2 结果与分析
2.1 底物对腐败希瓦氏菌和假单胞菌生长的影响
将接种于不同底物的腐败希瓦氏菌增殖过程中的生长数据进行拟合(图1),生长动力学参数见表1。结果显示,腐败希瓦氏菌在大黄鱼中生长的λ最长,在鲤鱼和大菱鲆中λ无明显差别；腐败希瓦氏菌在鲤鱼中的μmax最小,说明在鲤鱼中的腐败速率最慢,在大菱鲆和大黄鱼中的腐败速率接近。
图1 底物对腐败希瓦氏菌生长的影响
Fig.1 Effect of substrate on the growth of S.putrefaciens
表1 底物对腐败希瓦氏菌和假单胞菌生长动力学参数的影响
Table 1 Effect of substrate on the growth kinetic parameters of Shewanella putrefaciens and Pseudomonas spp.
菌名参数TSB鲤鱼大菱鲆大黄鱼罗非鱼腐败希瓦氏菌μmax/h-10.1040.0520.0840.087-λ/h15.089.789.1541.62-假单胞菌μmax/h-10.0510.055--0.057λ/h15.0835.03--40.71
将接种于不同底物的假单胞菌生长过程中的数据进行拟合,如图2所示,生长动力学参数见表1。结果显示,假单胞菌在鲤鱼和罗非鱼中的μmax和λ均无明显差异。另外,在鲤鱼中,腐败希瓦氏菌与假单胞菌的μmax相当,说明2种菌株在鲤鱼中的腐败能力相近,这与许振伟等[16]研究中得出的结论,鲤鱼鱼块中假单胞菌的产量因子略大于腐败希瓦氏菌一致。
图2 底物对假单胞菌生长的影响
Fig.2 Effect of substrate on the growth of Pseudomonas spp.
2.2 pH和NaCl对腐败希瓦氏菌和假单胞菌生长的影响
分别接种腐败希瓦氏菌到pH为4、5、6、7,NaCl质量分数为0.5%、2.0%和3.5%的TSB中,于15 ℃培养,结果显示pH为4和5时,腐败希瓦氏菌不生长。6个实验组(N1～N6)的环境条件及生长曲线见
图3，生长动力学见表2。在所有NaCl质量分数下,pH为7时的μmax均大于pH为6时。另外,NaCl质量分数对腐败希瓦氏菌的μmax和λ影响显著,随NaCl分量分数升高,μmax整体呈下降趋势,λ整体呈延长趋势,说明NaCl质量分数在0.5%～3.5%,腐败希瓦氏菌的增殖力随NaCl质量分数升高而逐渐减弱。
表2 各组环境条件及其腐败菌生长动力学参数
Table 2 Environmental conditions of each experimental group and their growth kinetic parameters
实验组菌名pH温度/℃ω(NaCl)/%μmax/h-1λ/hN16150.50.1483.18N27150.50.30910.85N3腐败希瓦氏菌6152.00.07210.82N47152.00.1766.19N56153.50.08932.57N67153.50.14532.33P1假单胞菌650.50.08161.34P2750.50.08860.51
图3 不同NaCl质量分数下pH对腐败希瓦氏菌生长的影响
Fig.3 Effect of pH on the growth of S.putrefaciens under various NaCl concentrations
分别接种假单胞菌到pH为4、5、6、7,NaCl质量分数为0.5%的TSB中,于15 ℃培养,pH为4和5时假单胞菌不生长。通过接种假单胞菌到pH为6和7的TSB中,温度和NaCl质量分数相同,对其生长进行拟合得到图4。表2显示,在本实验条件下,pH对假单胞菌的生长没有显著影响。
图4 pH对假单胞菌生长的影响
Fig.4 Effect of pH on the growth of Pseudomonas spp.
修艳辉等[17]的研究发现,pH和NaCl对腐败希瓦氏菌的μmax和λ有较大影响,在15和25 ℃环境下,pH≤5.0时腐败希瓦氏菌不生长,与本实验得到的结果一致。仪淑敏等[18]的研究表明,铜绿假单胞菌的最适生长pH均为5,在pH 2～5下生长缓慢,在pH 5～8下生长良好,在pH 8以上生长缓慢。与本实验结果有差异,原因可能是本实验使用的假单胞菌菌株分离自罗非鱼,而罗非鱼货架期终点时,假单胞菌中以荧光假单胞菌为主,其占比远大于铜绿假单胞菌[10]。关于pH对荧光假单胞菌生长的影响的研究则鲜有报道。
2.3 温度对腐败希瓦氏菌和假单胞菌生长的影响
表3为不同温度条件下腐败希瓦氏菌(8、15、25 ℃)、假单胞菌(0、5、10 ℃)的生长动力学参数,图5为其生长曲线。结果显示,温度是影响腐败希瓦氏菌和假单胞菌生长的重要因素,在本实验条件下,2种菌株的μmax均随温度升高而明显增加；腐败希瓦氏菌的λ随温度升高小幅缩短,假单胞菌的λ随温度升高大幅缩短。使用Belehradek方程描述温度和2种腐败菌μmax之间的关系,腐败希瓦氏菌：y=0.040 6x+0.055 5,R2=0.983 5; 假单胞菌：y=0.016 2x+0.133 8,R2=0.997 6。结果表明,温度与腐败希瓦氏菌和假单胞菌μmax之间线性关系的R2分别为0.983 5和0.997 6,均处在 95%置信区间内,表明该置信区间内能较好描述温度与2种菌最大比生长速率的关系。
表3 各组温度条件及其腐败菌生长动力学参数
Table 3 Temperature conditions of each experimental group and their growth kinetic parameters
实验设计菌名pH温度/℃ω(NaCl)/%μmax/h-1λ/hS1680.50.0673.87S2腐败希瓦氏菌6150.50.1483.178S36250.50.2872.899S4700.50.00572.47S5假单胞菌750.50.05215.65S67100.50.2270.036
a-腐败希瓦氏菌;b-假单胞菌
图5 温度对腐败希瓦氏菌和假单胞菌生长的影响
Fig.5 Effect of temperature on the growth of S.putrefaciens and Pseudomonas spp.
朱彦祺等[19]以冷藏大黄鱼特定腐败菌腐败希瓦氏菌为研究对象,其在5 ℃环境中生长趋势受到明显抑制,当温度上升到25 ℃时,腐败希瓦氏菌的λ显著缩短,且温度与λ以及μmax均存在线性关系；李媛惠[20]对鸡肉中的假单胞菌进行了研究,认为温度对假单胞菌生长有一定的影响；范新光[21]研究发现分离自鲜切西兰花的假单胞菌μmax随着温度的上升而增大,λ随温度的上升而减小。本实验得到的结果与前几位研究者一致。
2.4 底物、pH、NaCl质量分数和温度等因子的相互影响
由表2和表3可知,在温度为15 ℃不变时,N1(pH 6.0,NaCl 0.5%)和N6(pH 7.0,NaCl 3.5%)在不同的pH和NaCl质量分数条件下有相近的μmax,但λ有显著差距。另外,在pH 6.0不变时,N3(15 ℃,NaCl 2.0%)、N5(15 ℃,NaCl 3.5%)和S1(8 ℃,NaCl 0.5%)在不同温度和NaCl质量分数条件下有较为接近的μmax,同时λ有差距。其内在原因有待深入研究,一方面,本实验需要重复进行更多的平行实验来减小误差,从而加强实验结果的可信度。另一方面,结果初步表明,腐败菌在增殖过程中,温度、pH和食盐等因子相互影响,使生长情况更加复杂。例如,温度升高导致腐败希瓦氏菌生长的NaCl质量分数范围变宽,修艳辉等[16]的研究发现15 ℃时,腐败希瓦氏菌的生长/非生长界限为NaCl≥7%,25 ℃时,界限升至NaCl≥12%。另外,温度会影响水的电离,从而影响底物的酸碱度。盐浓度对于pH值也有影响,添加0.2 mol/L NaCl时,粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)的pH值生长范围变宽,温度升高,底物酸度也增加。温度、水分活度和底物营养间存在一定关系,微生物处在最适生长温度时,水分活度范围最广,营养物质增多,微生物能够存活的水分活度范围变广[22]。
3 结论
鱼源腐败希瓦氏菌和假单胞菌的生长动态、抑制效应与能源(如底物)、环境因子(如温度、pH)等紧密相关。本文基于腐败希瓦氏菌和假单胞菌在不同条件下的生长数据,拟合生长曲线,探究了环境因子对两种腐败菌生长的影响。结果表明:底物差异对腐败希瓦氏菌影响较为明显,其在大黄鱼中生长的λ最长,在鲤鱼中的μmax最小,假单胞菌在鲤鱼和罗非鱼中的μmax和λ均无明显差异；pH对腐败希瓦氏菌和假单胞菌影响较为显著,pH为4和5时两者均不生长,pH为7时腐败希瓦氏菌生长速率高于pH为6时,而假单胞菌生长无明显差异；NaCl质量分数对腐败希瓦氏菌生长影响显著,在0.5%～3.5%,腐败希瓦氏菌的增殖能力随NaCl质量分数升高而逐渐减弱；温度是影响腐败希瓦氏菌和假单胞菌生长的重要因素,两种菌株的增殖均随温度升高而增强。本研究结果发现各项环境因子之间能够相互影响,因此对于底物、温度、pH、NaCl相互影响的效果与机制须进行深入研究。
同时,基于水产品自身营养、风味特性和贮运条件等考虑,在设定腐败菌调控因子及调控范围时,需充分考虑对产品品质的影响。例如可考虑结合冰温保鲜和气调保鲜等物理方法,既能有效延长货架期,又能减少对食品品质的不良影响,旨在为靶向抑菌和延长产品货架期等提供了参考。
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