鱼露是一种传统的调味品，通常以低值鱼虾或水产品加工下脚料为原料经过自然发酵酿造而成，其滋味鲜美，风味独特，深受国内外消费者的喜爱[1]。自然发酵鱼露的生产周期较长，一般为数月乃至1年以上，为了获得更好的风味，有的甚至长达2～3年[2]。因此，缩短鱼露的发酵周期，提高企业的生产效率一直是国内外研究的重点。目前，缩短鱼露发酵周期的主要方法为保温法、外加酶法及外加曲法。LOPETCHARAT等[3]发现，当太平洋鳕鱼的发酵温度提高到50 ℃时，发酵液中的总氮含量在发酵15 d后与商品鱼露的含量一致。RABIE等[4]使用了不同浓度的菠萝蛋白酶加速鲭鱼鱼露的发酵，发现添加较高浓度菠萝蛋白酶的样品在发酵90 d后具有更高含量的氨基酸态氮(6.2 g/L)。TAKANO等[5]在下脚料中加入曲，室温发酵6个月后，鱼露的总氮含量达到了15 g/L。然而，提高发酵温度会增加鱼露的生产成本，添加富含酶的内脏或商业蛋白酶会影响鱼露的风味，较高的盐浓度会限制曲霉菌的生长。复合蛋白酶是内切酶，主要将蛋白质颗粒水解成小分子肽，水解能力高，但风味较差；而风味蛋白酶为外切酶，它的加入不仅能进一步提高水解程度，而且能够改善风味。因此，本文选用复合蛋白酶和风味蛋白酶作为外源蛋白酶。另外，曲霉菌YL001是1株从酱油曲中分离的产蛋白酶的菌株，其分泌的蛋白酶能加快沙丁鱼鱼露的发酵过程。因此，本文以沙丁鱼鱼肉为原料，以仅添加外源蛋白酶为对照，通过添加外源蛋白酶和曲霉菌YL001加速沙丁鱼鱼露的发酵。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
沙丁鱼，由宁波佳必可食品有限公司提供，使用前置于冰箱-20 ℃冷冻备用。复合蛋白酶(1.5 AU/g)、风味蛋白酶(500 LAPU/g)，诺维信(中国)生物技术有限公司；曲霉菌YL001，本研究室保藏；氨基酸标准品，美国Sigma公司；其他化学试剂,国药集团化学试剂有限公司。
JYSA800型绞肉机，九阳股份有限公司；PHS-3C型 pH 酸度计，上海仪电科学仪器股份有限公司；Kjeltec 8400型全自动凯氏定氮仪，丹麦福斯分析仪器公司；H2050R型高速冷冻离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；7200可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司；SPX-250B-Z生化培养箱、数显式恒温水浴锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；恒温磁力搅拌器，金坛市城东新瑞仪器厂；L-8900全自动氨基酸分析仪，日本Hitachi公司；SPME手柄与萃取头，美国Supelco公司；7890 N/5975C气质联用仪，美国Agilent公司。
1.2 实验方法
1.2.1 曲霉菌YL001成曲的制备
将曲霉菌YL001接种于PDA培养基中，置于30 ℃恒温培养箱培养48 h，用来制备成曲。成曲的制备参照白政泽等[6]的方法。
1.2.2 沙丁鱼鱼露的制备
将冷冻的沙丁鱼在流水中(25 ℃)中解冻1 h，解冻后去除头、尾、内脏和骨头。然后，用绞肉机将其斩拌成鱼糜。接着，将500 g沙丁鱼鱼糜与500 mL蒸馏水混合。先加入质量分数为0.5%的复合蛋白酶，50 ℃水浴2.5 h，再加入质量分数为0.7%的风味蛋白酶，55 ℃继续水浴2.5 h。然后将酶解液分为2组：第一组加入质量分数为15%的盐，为鱼露A；第二组加入质量分数为15%的盐和质量分数为14%的曲霉菌YL001，为鱼露B。将混合物置于1 000 mL的烧杯中，用8层纱布覆盖，以保持半需氧状态。为获得具有良好风味的鱼露，首先将样品在35 ℃的恒温培养箱中发酵30 d，然后在室温(15～25 ℃)下继续发酵150 d。由此得到的发酵醪液，先添加60 g/L海藻糖,在40 ℃中水浴120 min除腥，然后以8 000 r/min离心20 min，最后在90 ℃水浴中加热20 min进行灭菌，得到鱼露A和鱼露B。
1.2.3 pH的测定
用pH计直接测量鱼露样品的pH值。
1.2.4 总酸及氨基酸态氮的测定
总酸及氨基酸态氮的测定参照GB 5009.235—2016中甲醛滴定法。
1.2.5 总可溶性氮的测定
总可溶性氮的测定参照GB/T 5009.5—2016中凯氏定氮法。
1.2.6 挥发性盐基氮及NaCl的测定
挥发性盐基氮(total volatile base nitrogen，TVB-N)的测定参照GB 5009.228—2016中自动凯式定氮仪法。
NaCl的测定参照GB 5009.44—2016中银量法。
1.2.7 非酶褐变的测定
非酶褐变的测定参照ZHONG等[7]的方法。将5 mL 鱼露样品与50 mL体积分数为50%的乙醇混合，然后用磁力搅拌器搅拌1 h。在5 000 r/min下离心15 min，上清液在420 nm处测量吸光度。
1.2.8 游离氨基酸的测定
游离氨基酸的测定，参照CHEN等[8]的方法。将2 mL鱼露样品加到15 mL 50 g/L的三氯乙酸中，用旋涡混合器振荡2 min。然后将样品超声处理5 min，离心(10 000 r/min，4 ℃，10 min)后弃去沉淀。取5 mL上清液于烧杯中，用6、1 mol/L的NaOH溶液调节pH值至2.0后，定容到10 mL。取定容后的溶液1 mL，用超纯水稀释至50 mL。最后将稀释液用0.22 μm水相滤膜过滤后，放入进样瓶中测定。
1.2.9 挥发性化合物的鉴定
参照GAO等[9]的方法，采用SPME-GC-MS法对鱼露的挥发性成分进行了测定。将5 mL鱼露样品加入顶空瓶(20 mL)。将萃取头插入到顶空瓶中，并在60 ℃下吸附30 min后，迅速插入气相色谱进样口，在250 ℃下解吸3 min。GC使用HP-5MS柱 (30 m×0.25 mm×0.25 μm)作为分离柱。柱初温40 ℃，保持3 min；然后以5 ℃/min的速度升温至90 ℃，再以8 ℃/min的速度升温至230 ℃，保持7 min。载气为氦气，流速为1.0 mL/min。离子化方式为电子轰击，质谱离子源温度为230 ℃，四极杆温度为150 ℃，电子能量为70 eV；不分流进样；检测模式采用全谱扫描，质量扫描范围为35～550 m/z。
1.2.10 感官评价
感官评价参照XU等[10]的方法。选择9名研究生(5名男性和4名女性，年龄25～30岁)进行感官评价。经过训练的组员对不同风味的鱼露(焦糖味、肉味、鲜味、酸味、苦味、鱼腥味、氨味、腐臭味)进行评价打分。计分采用10分制，“1”分代表该风味不能被感觉到，“10”分代表该风味非常强烈。
2 结果与分析
2.1 蛋白酶和曲霉菌YL001复合发酵对鱼露pH和总酸含量的影响
鱼露A和鱼露B发酵过程中pH和总酸的变化分别如图1和图2所示。在整个发酵过程中，pH值的变化趋势与总酸的变化趋势一致。另外，2个鱼露样品的pH值在发酵的前20 d呈增加趋势，这可能是由于在发酵过程中产生了一些挥发性碱类化合物，如TVB-N、氨和其他降解产物[11-12]。而在发酵末期，水解产物的产生又使得鱼露样品的pH值降低。与鱼露A相比，鱼露B在发酵过程中的pH值较低，总酸含量较高。这主要是因为鱼露B中添加的曲霉菌YL001使其蛋白酶活性高于鱼露A，导致沙丁鱼中的蛋白质进一步水解，从而使两者的酸类物质和氨的产生量不同[13]。游离氢离子、游离氨基酸和寡肽氨基酸等水解产物的含量增加，导致鱼露B的pH值较低，酸度较高。此外，一些有机酸也会使鱼露B的pH值变低，总酸的含量变高[14]。
图1 发酵过程中pH值的变化
Fig.1 Changes of pH during fermentation process
图2 发酵过程中总酸的变化
Fig.2 Changes in total acids during fermentation process
2.2 蛋白酶和曲霉菌YL001复合发酵对鱼露总氮和氨基酸态氮含量的影响
总可溶性氮(total soluble nitrogen，TSN)含量是鱼露品质分级的重要指标。日本和韩国规定鱼露中的TSN含量应 >10 g/L，而泰国规定二级鱼露的TSN含量应 >15 g/L，且一级鱼露的TSN含量应 >20 g/L[15]。另外，根据我国鱼露的行业标准(SB/T 10324—1999)，一级、二级、三级鱼露的最小TSN含量分别为12、8.7和5.4 g/L。发酵过程中2种鱼露中的TSN含量变化如图3所示。随着发酵的进行，2个鱼露样品的TSN含量均先增加后趋于稳定。经过180 d的发酵后，鱼露A和鱼露B的TSN含量分别为14.2和16.3 g/L。与鱼露A相比，鱼露B的TSN含量提高了14.8%。这说明曲霉菌YL001的存在使鱼露B具有更高的蛋白酶活性，通过进一步分解鱼肉中的蛋白质，从而提高鱼露中的TSN含量。
氨基酸态氮(amino acid nitrogen，AAN)是鱼露品质分级的另一个重要指标。在日本，氨基酸态氮的含量需要达到总氮的40%以上。我国一级鱼露和二级鱼露AAN的最低标准分别为9.0和6.5 g/L。如表1所示，发酵180 d后，鱼露A中氨基酸态氮的含量为7.6 g/L，符合二级鱼露的标准，而鱼露B中氨基酸态氮的含量为10.6 g/L，达到了一级鱼露的标准。
综上，与仅加酶发酵相比，先加酶、后加曲霉菌YL001曲的复合发酵法能够提高沙丁鱼鱼露中TSN和AAN的含量。
图3 发酵过程中可溶性总氮的变化
Fig.3 Changes in total soluble nitrogen during fermentation process
表1 发酵30和180 d时鱼露样品中氨基酸态氮的含量
Table 1 Amino acid nitrogen content of fish sauce samples in 30 and 180 d
时间/d鱼露A/(g·L-1)鱼露B/(g·L-1)306.7±0.19.1±0.11807.6±0.010.6±0.1
2.3 蛋白酶和曲霉菌YL001复合发酵对鱼露TVB-N含量和NaCl含量的影响
TVB-N含量是衡量海产品新鲜度和变质程度的重要指标。TVB-N的积累通常与特定腐败菌、内源酶[16]及能水解蛋白的细菌[17]有关。发酵过程中，鱼露A和鱼露B中的TVB-N含量变化如图4所示。在发酵过程中，鱼露A和鱼露B的TVB-N含量变化趋势相似，均呈上升趋势，这与之前的研究一致[10,13,18]。发酵结束时，鱼露A和鱼露B的TVB-N含量分别为0.68和1.36 g/L。鱼露B中TVB-N的含量高于鱼露A，这可能是因为曲霉菌YL001在分解沙丁鱼肉中的蛋白质时产生了一些挥发性碱类化合物。
如图5所示，2个鱼露样品在发酵过程中NaCl质量浓度均没有明显变化。发酵结束时，鱼露A和鱼露B的NaCl浓度分别为198.0 和206.9 g/L。据报道，来自东南亚的商业鱼露中的NaCl质量浓度为(259±3.7) g/L[19]。显然，鱼露A和B比商业鱼露中的NaCl含量要低。鱼露发酵过程中低盐的环境不仅能加速蛋白质的分解，缩短发酵周期，而且能提高鱼露的营养价值。随着低盐膳食越来越受到人们的推崇，该盐分含量的鱼露相对于传统高盐的鱼露更具竞争力。
图4 发酵过程中挥发性盐基氮的变化
Fig.4 Changes in total volatile basic nitrogen during fermentation process
图5 发酵过程中NaCl含量的变化
Fig.5 Changes in NaCl content during fermentation process
2.4 蛋白酶和曲霉菌YL001复合发酵对鱼露非酶褐变的影响
鱼露的褐色是非酶褐变反应的结果。鱼露中的大部分含氮化合物是游离氨基酸和小肽，它们通过美拉德反应形成鱼露的褐色[15]。如图6所示，在鱼露A和鱼露B中，非酶褐变指数OD420在整个发酵过程中都呈现出增加的趋势，这与之前的研究相似[13]。显然，鱼露B的非酶褐变指数比鱼露A大。这是因为添加曲霉菌YL001后使得鱼露B在发酵过程中的蛋白酶和糖化酶活性较高，而其降解产物有助于美拉德反应。
图6 发酵过程中非酶褐变指数的变化
Fig.6 Changes in nonenzymatic browning during fermentation process
2.5 游离氨基酸分析
发酵180 d后，鱼露A和鱼露B中游离氨基酸的组成和浓度如表2所示。游离氨基酸是鱼露中重要的营养成分，在鱼露风味的形成中起着关键作用[17]。鱼露B中除苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸和组氨酸外，其他氨基酸的含量均高于鱼露A。而且，鱼露B中的鲜味氨基酸，特别是谷氨酸和天冬氨酸的含量显著高于鱼露A。而天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸是形成鱼露的特殊发酵风味的重要因素[20]。发酵180 d后，鱼露A和鱼露B的总游离氨基酸含量分别为84.85和109.46 g/L。鱼露B与李锐等[21]报道的传统发酵鱼露中总游离氨基酸总量相似。这些结果表明，先加外源蛋白酶、后加曲霉菌YL001的复合发酵可以促进鱼蛋白的分解，提高鱼露中游离氨基酸的含量。
表2 沙丁鱼鱼露中游离氨基酸的含量 单位：g/L
Table 2 Contents of free amino acids in fermented fish sauce
游离氨基酸 鱼露 A鱼露 B天冬氨酸3.89±0.189.07±0.24苏氨酸5.34±0.234.95±0.20丝氨酸2.68±0.122.21±0.17谷氨酸10.07±0.3914.09±0.67甘氨酸1.87±0.093.82±0.11丙氨酸5.16±0.257.02±0.18半胱氨酸1.83±0.051.53±0.00缬氨酸5.95±0.237.04±0.13蛋氨酸3.16±0.093.29±0.08异亮氨酸4.40±0.195.47±0.12亮氨酸7.31±0.308.78±0.17酪氨酸3.56±0.083.44±0.02苯丙氨酸2.85±0.273.34±0.10色氨酸0.70±0.010.86±0.01赖氨酸14.00±0.7118.92±0.45组氨酸9.15±0.529.00±0.21精氨酸1.85±0.095.26±0.15脯氨酸1.08±0.111.37±0.06
2.6 挥发性化合物的鉴定
采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用法测定了2种鱼露样品的挥发性成分。如表3所示，共检测出51种不同的挥发性化合物，包括醛、酮、醇、酯、酸、烷烃等。
表3 鱼露A和鱼露B中的挥发性化合物 单位：%(相对含量)
Table 3 Volatile compounds of fish sauce A and fish sauce B
序号挥发性化合物鱼露A鱼露B醛类13-甲基丁醛ND0.5522-甲基丁醛ND0.903苯乙醛10.2818.3145-乙基-2-糠醛1.51ND5壬醛3.342.586à,2-二甲基-环己烯-1-乙醛0.62ND72,4-二甲基-2,4-二烯醛0.81ND84-乙基苯甲醛3.865.569癸醛4.203.45102-苯基巴豆醛1.143.9611十一醛3.334.0312十二醛0.96ND13十四醛0.50ND145,9,13-三甲基-4,8,12-十四碳三烯醛ND1.72152-异亚丙基-5-甲基-4-己烯醛1.630.80酮类165-甲基-4-庚烯-3-酮0.74ND172,3-二甲基-2-环戊烯酮0.65ND182-甲基-1,3-环戊二酮6.555.02195-乙基-2(5H)-呋喃酮8.015.4120(3E,5E)-3,5-辛二烯-2-酮15.3910.49212-环亚戊基环戊酮ND1.49222-甲基-5-(1-甲基乙基)环己酮5.09ND23香叶基丙酮0.921.14醇类24(1R,2R,3S,5R)-(-)-2,3-蒎烷二醇0.92ND252-辛炔-1-醇4.74ND2611-氧杂-二螺[4.0.4.1]十一烷-1-醇2.24ND272-[(9Z)-9-十八烷基氧基]-乙醇0.19ND282-十六烷醇0.92ND29雪松醇ND0.68酯类30γ-己内酯1.653.9531α-庚基-γ-丁内酯1.521.18322-硝基-4,9-癸二烯酸乙酯0.93ND33乙酸异丁酯0.630.3334(1à,2à,3à)- 2-甲基-3-(1- 1-甲基乙烯基)-环己醇酯1.24ND352,5-十八碳二炔酸甲酯0.211.6836邻苯二甲酸丁基正葵酯ND1.2837邻苯二甲酸正十四烷基酯0.773.95酸类382-羧甲基-3-甲基-环戊酸ND2.0039十四酸2.992.03烷烃类401-甲基-3-(1-甲基亚乙基)-环己烷0.760.37412,6,10-三甲基-十四烷0.26ND42十七烷0.45ND432,6,10,14-四甲基十五烷2.21ND其他442-乙基呋喃ND14.81452-乙基苯酚ND1.22464-乙基苯酚0.350.67474-乙基间苯二酚2.082.58481,5,5-三甲基-6-亚甲基-环己烯ND0.72492,4-二叔丁基苯酚0.421.09502,7-二甲基-氧杂环庚三烯0.53ND513-苯基-1,2,4-三氧戊环5.39ND
注：“ND” 指未检出
醛类化合物是鱼露A和B的主要挥发性成分，分别占30.54%和41.06%。由于醛类的阈值较低，因此对鱼露的风味有很大贡献[22]。挥发性醛类通常来源于氨基酸的Strecker降解，它有助于产生理想的香气，但是也会产生酸败的气味和风味[13]。3-甲基丁醛和2-甲基丁醛只在鱼露B中检测到，这2种物质被认为是鱼露的特征性风味物质[23]。另外，鱼露A和B中都检测到大量苯乙醛，这与之前的报告相似[24]，不过苯乙醛对鱼露的风味影响不大。这些结果表明，曲霉菌YL001可以促进鱼露风味的形成。
酮类化合物通常与微生物活性和脂质氧化有关[25]。5-甲基-4-庚烯-3-酮和2，3-二甲基-2-环戊烯-1-酮仅在鱼露A中检出，且在2种鱼露中均检出3，5-辛二烯-2-酮，鱼露A的相对含量为15.39%，鱼露B的相对含量为10.49%。酮，尤其是烯酮，能增强鱼腥味。显然，曲霉菌YL001的添加可以降低鱼露的腥味，从而改善鱼露的风味。
鱼露A中检测到的醇类物质含量高于鱼露B，但由于其阈值较高，对鱼露香气的贡献不大[26]。十四酸是鱼露A中唯一检出的酸，占2.99%。酸类主要导致鱼露中的酸味[27]，不过一些短链脂肪酸有助于形成浓郁的奶酪味[18]。
酯类在鱼露B中占8.42%，在鱼露A中占5.71%。酯类可能是醇类与微生物或酶分解脂质而形成的羧酸酯化的产物[5]。酯类存在于大多数的发酵产品中，有助于形成水果香及花香。此外，酯类还可以减少和掩盖游离氨基酸衍生的令人不适的气味[28]。
烷烃只在鱼露A中发现，由于其具有较高的风味阈值，通常认为不会对鱼露的风味产生重要影响[25]，但支链烷烃可能会导致鱼露中产生溶剂状气味[24]。2-乙基呋喃仅在鱼露B中检测到，呋喃类化合物具有较低的风味阈值，有助于形成草或豆的风味。
总之，挥发性物质组成和含量的差异表明，添加外源酶、然后加曲霉菌YL001的复合发酵鱼露的风味优于单一外源酶发酵。
2.7 感官评价
2种鱼露样品的感官评价如图7所示，鱼露A和鱼露B的苦味、酸味、氨味、酸味评分均较低，说明2种鱼露发酵180 d后没有特别浓烈或难闻的味道。此外，鱼露B的鲜味和焦糖味的评分较高，这可能与其氨基酸、可溶性总氮和游离氨基酸含量较高，尤其是谷氨酸含量较高有关。因此，利用外源蛋白酶和曲霉菌YL001混合发酵可以提高鱼露的风味。
图7 两种鱼露样品的感官评价
Fig.7 Sensory profiles of two fish sauce samples
3 结论
为了缩短鱼露的发酵周期，本研究利用外源蛋白酶和曲霉菌YL001复合发酵的方法制作沙丁鱼鱼露。沙丁鱼首先在35 ℃下发酵30 d，然后在室温下发酵150 d，这节约了鱼露的生产成本。发酵180 d后，鱼露A的氨基酸态氮含量和总氮含量分别为7.6和14.2 g/L，品质仅为二级鱼露。而鱼露B的氨基酸态氮含量和总氮含量分别为10.6和16.3 g/L，鱼露品质达到了一级鱼露标准(SB/T 10324—1999)。另外，与鱼露A相比，鱼露B的总酸、非酶褐变指数及游离氨基酸含量均较高。而且，GC-MS分析及感官评价结果表明，复合发酵鱼露的产品无异味，且有鱼露特有的香味。所以，外源蛋白酶和曲霉菌YL001复合发酵不仅可以缩短沙丁鱼鱼露的发酵时间，还可以改善其风味。
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