浙贝母(Fritillaria thunbergii Miq)主产于浙江及江苏地区，为百合科贝母属多年生草本植物。多以其鳞茎入药，具有清热化痰，散结消痈之疗效[1]。因其产地的不同，浙贝母会出现遗传差异性[2]。有研究表明，浙贝母含有丰富的皂苷和生物碱类成分[3-4]及氨基酸类成分[5]。近年来，随着对浙贝母药理研究的深入[6]，发现其有抑制癌细胞扩散的作用，抗癌疗效显著，这方面的研究受到了广泛的关注[7]。氨基酸是蛋白质的基本组成单元，同时也是人体代谢过程中的重要物质，它是人体必需营养成分之一，对疾病的治疗和康复具有积极作用[8]。有文献报道，浙贝母花期地上部分总氨基酸含量丰富[9]，测出含有17种氨基酸，其中谷氨酸和精氨酸含量较高，精氨酸在细胞增殖和分裂以及蛋白质合成方面发挥着重要的作用[10-11]。对于浙贝母氨基酸方面的研究主要集中在地上部分，但对浙贝母药用部位——鳞茎的氨基酸相关研究报道较少。

响应面分析，是指在多因素数量处理试验的分析中，分析试验指标与多个试验因素间的回归关系，因其方便快捷，结果可靠，目前在化学、生物学等领域占据重要地位[12]。陈文等[13]采用响应面分析法优化海参氨基酸提取条件。目前，氨基酸测定方法有氨基酸分析仪-柱后衍生法[14-15]、柱前衍生-蒸发光散射检测器法[16-17]和柱前衍生化-高效液相色谱法等[18-21]。氨基酸的衍生试剂较多，异硫氰酸苯酯(phenyl isothiocyanate，PITC)因其配制简单、操作方便，衍生后可直接进样，成为最常用的衍生试剂。因此，本文拟采用响应面法优化提取浙贝母鳞茎中氨基酸最优试验条件，并采用柱前衍生UPLC法测定其含有的氨基酸种类和含量，比较栽前栽后氨基酸含量的差别，以期为相关研究提供技术和理论支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪(含PDA检测器，Empower 3色谱工作站)，美国Waters公司；ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)，美国Waters公司；HDL-4型离心机，江苏省金坛市鸿科科技有限公司；Vortex Genius 3型涡旋混合器，德国IKA公司；ME204E型万分之一分析天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；HN200型多功能氮吹仪，山东海能科学仪器有限公司；GZX-GF101-MBS型恒温电热干燥箱，上海跃进医疗器械有限公司；UV-2450紫外-可见分光光度计，岛津企业管理(中国)有限公司；KQ-300B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；GM-0.33A隔膜真空泵，天津市津腾实验设备有限公司；MS105DV十万分之一分析天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司。

1.2 试剂

谷氨酸(Glu，批号GG202002，含量≥98%)、脯氨酸(Pro，批号PP202001，含量≥98%)、赖氨酸(Lys，批号LS201911，含量≥99%)、亮氨酸(Leu，批号LL201912，含量≥98%)、精氨酸(Arg，批号JA202005，含量≥99%)、异亮氨酸(Ile，批号YI191221，含量≥99%)、甘氨酸(Gly，批号VB202110，含量≥98%)，均购自BOMEI公司；苏氨酸(Thr，批号DST191010-135，含量≥99%)、缬氨酸(Val，批号DST190906-061，含量≥99%)、苯丙氨酸(Phe，批号DST190812-136，含量≥98%)、天门冬氨酸(Asp，批号DST190806-897，含量≥98%)、丙氨酸(Ala，批号DST190908-112，含量≥98%)、组氨酸(His，批号DST190720-069，含量≥98%)、丝氨酸(Ser，批号DST190901-190，含量≥98%)，购自成都德思特生物技术有限公司。

盐酸、三乙胺、乙酸钠、冰醋酸(均为分析纯)，成都科龙化工试剂厂；异硫氰酸苯酯(PITC，≥99%蛋白测序级)，麦克林试剂公司；乙腈(色谱纯)，德国默克公司；实验用水为怡宝纯净水。

1.3 样品来源

浙贝母新鲜鳞茎采自浙江、江苏及重庆3个省种植基地同一批大小基本一致的样品，经三峡库区道地药材绿色种植与深加工重庆市工程实验室(重庆三峡学院)周浓教授鉴定为百合科贝母属浙贝母(Fritillaria thunbergia Mig.)的新鲜鳞茎，样品来源为：浙江省宁波市千祥镇、浙江省磐安县新渥镇、江苏南通市张芝山镇和重庆市奉节县冯坪乡，按照栽前与栽后依次编号为Zq-1、Zh-1；Zq-2、Zh-2；Zq-3、Zh-3；Zq-4、Zh-4。

1.4 试验方法

1.4.1 响应面优化浙贝母氨基酸提取工艺

1.4.1.1 单因素变量考察

(1)水解时间对吸光度的影响

称取样品0.100 0 g于顶空瓶中，加入6 mol/L盐酸10 mL，超声处理30 min，密封。在110 ℃的恒温干燥箱中分别水解18、20、22和24 h后，取出，冷却至室温。将内容物过滤去除固体物，收集滤液定容至25 mL。

(2)超声时间对吸光度的影响

称取样品0.100 0 g于顶空瓶中，加入6 mol/L盐酸10 mL，分别超声处理20、30、40和50 min，密封。在110 ℃的恒温干燥箱中水解20 h后，取出，冷却至室温。将内容物过滤去除固体物，收集滤液定容至25 mL。

(3)水解温度对吸光度的影响

称取样品0.100 0 g于顶空瓶中，加入6 mol/L盐酸10 mL，超声处理30 min，密封。分别在100、110、120和130 ℃的恒温干燥箱水解20 h后，取出，冷却至室温。将内容物过滤去除固体物，收集滤液定容至25 mL。

(4)盐酸用量对吸光度的影响

称取样品0.100 0 g于顶空瓶中，分别加入6 mol/L盐酸6、8、10、12和14 mL，超声处理30 min，密封。在110 ℃的恒温干燥箱中水解20 h后，取出，冷却至室温。将内容物过滤去除固体物，收集滤液定容至25 mL。

1.4.1.2 Box-Behnken中心组合实验设计

经过单因素实验数据对比，每个因素选取4个对氨基酸影响较大水平。设计4因素3水平的Box-Behnken中心组合试验。采用陈文等[13]方法，在360 nm处测定样品吸光度并作为响应值，每组重复3次，取其平均值。

1.4.2 柱前衍生UPLC法浙贝母氨基酸含量测定

1.4.2.1 对照品溶液制备

精密称取Asp、Glu、Ser、Gly、His、Arg、Thr、Ala、Pro、Val、Ile、Leu、Phe、Lys对照品适量，用0.1 mol/L盐酸溶解并定容于5 mL容量瓶中，配制成质量浓度分别为0.369、0.335、0.315、0.339、1.087、1.838、1.378、0.171、0.109、0.348、0.724、1.293、1.076、0.695 mg/mL的对照品贮备溶液，即得。

1.4.2.2 供试品溶液制备

样品水解：准确称取0.100 0 g浙贝母样品粉末(过3号筛)于顶空瓶中，加入6 mol/L盐酸溶液10 mL，混合均匀，密封，放至110 ℃的电热鼓风恒温箱内水解20 h，取出，冷却至室温，过滤，滤液加蒸馏水定容至25 mL，混匀即得水解液。

样品衍生：取样品水解液400 μL于氮吹管中，放入氮吹仪中氮吹至干，除去高浓度盐酸溶液，加入纯净水400 μL复溶，加入1.0 mol/L三乙胺-乙腈溶液200 μL，涡旋混匀，再加入0.1 mol/L异硫氰酸苯酯-乙腈溶液200 μL，涡旋混匀，室温下衍生1 h，每隔20 min 涡旋振荡1次，衍生完成后加入正己烷800 μL，涡旋混匀，4 000 r/min离心5 min，弃去上清液，再重复操作2次，除去多余衍生试剂，过0.22 μm微孔滤膜即得样品溶液。

1.4.2.3 空白衍生溶液制备

取0.1 mol/L盐酸溶液400 μL于氮吹管中，按照“1.4.2.2”项下方法进行衍生萃取，即得空白衍生溶液。

1.4.2.4 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 (1.7 μm，2.1 mm×150 mm)；流动相：A为0.1 mol/L乙酸钠溶液(冰醋酸调pH=6.5)-乙腈(体积比97∶3)，B为乙腈-水(体积比4∶1)，梯度洗脱见表1。检测波长为254 nm，进样体积2 μL，柱温40 ℃。

2 结果与分析

2.1 响应面优化浙贝母氨基酸提取工艺结果

2.1.1 单因素变量试验结果

2.1.1.1 水解时间对样品氨基酸吸光度的影响

吸取1.4.1.1(1)滤液400 μL，按照1.4.2.2方法衍生，应用紫外-分光光度计测定其吸光度，所得结果如图1所示。由图1可知，随着水解时间的延长，吸光度逐渐增大，在20 h时，吸光度达到最大。之后，随着水解时间的继续延长，吸光度明显下降，因此最佳水解时间为20 h。

2.1.1.2 超声时间对样品吸光度的影响

吸取1.4.1.1(2)滤液400 μL，按照1.4.2.2方法衍生。应用紫外-分光光度计测定其吸光度，所得结果如图2所示。由图2可知，随着超声时间的延长，吸光度逐渐增大，在30 min时，吸光度达到最大。之后，随着超声时间的继续延长，吸光度明显下降，因此最佳超声提取时间30 min。

2.1.1.3 水解温度对样品吸光度的影响

吸取1.4.1.1(3)滤液400 μL，按照1.4.2.2方法衍生，应用紫外-分光光度计测定其吸光度，所得结果如图3所示。由图3可知，随着水解温度的增高，吸光度逐渐增大，在110 ℃时，吸光度达到最大。之后，随着水解温度的继续升高，吸光度明显下降，因此最佳水解温度为110 ℃。

2.1.1.4 盐酸用量对样品吸光度的影响

吸取1.4.1.1(4)滤液400 μL，按照1.4.2.2方法衍生，应用紫外-分光光度计测定其吸光度，所得结果如图4所示。由图4可知，随着盐酸用量的增大，吸光度逐渐增大，在8 mL时，吸光度达到最大。之后，随着盐酸用量的继续增大，吸光度明显下降，因此最佳盐酸用量为8 mL。

2.1.2 响应面优化试验结果

2.1.2.1 响应面试验回归方程拟合

根据单因素试验结果，氨基酸水解的最佳条件为：水解时间20 h、超声时间30 min、水解温度110 ℃及6 mol/L盐酸8 mL。因此以最佳条件为0水平，在左右两侧取-1和1水平进行响应面试验。试验数据采用Design Expert 8.0.6.1软件进行处理分析。拟合方程为：吸光度=1.63+0.017A-0.037B-0.025C-0.027D+0.024AB-0.042AC+0.028AD-0.024BC-0.031BD+0.056CD-0.038A2-0.085B2-0.036C2-0.093D2。

其中：A、B、C、D分别代表盐酸用量(mL)、超声时间(min)、水解时间(h)和水解温度(℃)。

2.1.2.2 响应面试验优化分析

由图5可知，当超声时间不变时，随着盐酸用量的增加，吸光度逐渐增大，当盐酸用量为8 mL时，吸光度达到峰值。随后随着盐酸用量继续增大，吸光度又逐渐减小。同时，当盐酸用量不变时，随着超声时间的延长，吸光度逐渐增大，当超声时间为30 min时，吸光度达到峰值。随后随着超声时间的继续延长，吸光度又逐渐减小。等高线中的椭圆度较大，证明2个因素的交互作用对吸光度的影响显著。由表3可知，AB交互作用的P值<0.01，影响极显著。

由图6可知，当水解时间不变时，随着盐酸用量的增加，吸光度逐渐增大，当盐酸用量为8 mL时，吸光度达到峰值。随后随着盐酸用量继续增大，吸光度又逐渐减小。同时，当盐酸用量不变时，随着水解时间的延长，吸光度逐渐增大，当水解时间为20 h时，吸光度达到峰值。随后随着超声时间的继续延长，吸光度又逐渐减小。等高线中的椭圆度较大，证明2个因素的交互作用对吸光度的影响显著。由表3可知，AC交互作用的P值<0.01，影响极显著。

由图7可知，当水解温度不变时，随着盐酸用量的增加，吸光度逐渐增大，当盐酸用量为8 mL时，吸光度达到峰值。随后随着盐酸用量继续增大，吸光度又逐渐减小。同时，当盐酸用量不变时，随着水解温度的增高，吸光度逐渐增大，当水解温度为110 ℃时，吸光度达到峰值。随后随着水解温度的继续增大，吸光度又逐渐减小。等高线中的椭圆度较大，证明2个因素的交互作用对吸光度的影响显著。由表3可知，AD交互作用的P值<0.01，影响极显著。

由图8可知，当水解时间不变时，随着超声时间的延长，吸光度逐渐增大，当超声时间为30 min时，吸光度达到峰值。随后随着超声时间继续延长，吸光度又逐渐减小。同时，当超声时间不变时，随着水解时间的增高，吸光度逐渐增大，当水解时间为20 h时，吸光度达到峰值。随后随着水解时间的继续延长，吸光度又逐渐减小。等高线中的椭圆度较大，证明2个因素的交互作用对吸光度的影响显著。由表3可知，BC交互作用的P值<0.01，影响极显著。

由图9可知，当水解温度不变时，随着超声时间的延长，吸光度逐渐增大，当超声时间为30 min时，吸光度达到峰值。随后随着超声时间继续延长，吸光度又逐渐减小。同时，当超声时间不变时，随着水解温度的增高，吸光度逐渐增大，当水解温度为110 ℃时，吸光度达到峰值。随后随着水解温度的继续增高，吸光度又逐渐减小。等高线中的椭圆度较小，证明两个因素的交互作用对吸光度的影响不显著。由表3可知，BC交互作用的P值=0.944 4>0.05，影响不显著。

由图10可知，当水解温度不变时，随着水解时间的延长，吸光度逐渐增大，当水解时间为20 h时，吸光度达到峰值。随后随着水解时间继续延长，吸光度又逐渐减小。同时，当水解时间不变时，随着水解温度的增高，吸光度逐渐增大，当水解温度110 ℃时，吸光度达到峰值。随后随着水解温度的继续增高，吸光度又逐渐减小。等高线中的椭圆度较大，证明2个因素的交互作用对吸光度的影响显著。由表3可以看出，CD交互作用的P值=0.034 5，影响显著。

2.1.3 方差分析

由表3可知，该模型的P<0.01，证明该试验拟合方程所成模型极显著。与此同时，失拟项的P值>0.1，证明此模型与正交的结果，线性关系极好。标志着用此模型可以推断出最佳结果。R2=0.990 3，拟合度很好。CV=0.46%，置信度可观，误差较小。因此可以用此模型来预估试验结果，从而减少试验量。表3结果表明，除BD和CD的交互作用的影响不显著外，其余因素的影响都为极显著，证明这些因素及其交互作用对氨基酸提取的影响是极显著的。

2.2 柱前衍生UPLC法浙贝母氨基酸含量测定结果分析

2.2.1 方法学考察

2.2.1.1 线性关系考察

取“1.4.2.1”项下对照品储备液100、200、300、400、500 μL于5 mL容量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液定容至刻度，配制成系列混合对照品溶液。取系列混合对照品溶液各400 μL，按“1.4.2.2”项下条件衍生，按“1.4.2.4”项下色谱条件进行测定，以各对照品浓度为横坐标(Y)，以峰面积为纵坐标(X)，绘制标准曲线，结果见表4，结果显示各个成分在线性范围内线性关系良好。

2.2.1.2 精密度试验

取“1.4.2.1”项下混合对照品溶液衍生液400 μL，按“1.4.2.2”项下条件衍生，按“1.4.2.4”项下色谱条件连续进样6次，测得各氨基酸峰面积RSD值在1.74%～2.82%，结果表明仪器精密度良好。

2.2.1.3 重复性试验

取浙贝母鳞茎粉末(Zq-2)0.100 0 g，平行6次，按“1.4.2.2”项下条件水解衍生，按“1.4.2.4”项下色谱条件进行测定，测得各氨基酸峰面积RSD值为0.83%～2.88%，结果表明重复性良好。

2.2.1.4 稳定性试验

取浙贝母鳞茎样品(Zh-1)0.100 0 g，按“1.4.2.2”项下条件水解衍生，按“1.4.2.4”项下色谱条件在0、2、4、6、8 h进行测定，测得各氨基酸峰面积RSD值为1.43%～2.95%，结果表明浙贝母衍生液在8 h内稳定性良好。

2.2.1.5 加样回收率试验

取6份已知氨基酸含量的滇重楼根茎粉末(Zh-2)0.050 0 g，置于顶空瓶中，加各氨基酸对照品储备液适量，按“1.4.2.2”项下条件水解衍生，按“1.4.2.4”项下色谱条件进行测定，记录各成分峰面积，计算回收率和RSD，结果见表5。结果显示，各氨基酸平均加样回收率为95%～105%，RSD值为0.97%～2.78%，表明该方法准确可靠。

2.2.2 样品测定

精密称取“1.3”项下的8份不同产地栽前及栽后浙贝母样品(过3号筛)0.100 0 g，按“1.4.2.2”项下条件水解衍生，按“1.4.2.4”项下色谱条件进行测定，带入标准曲线方程，计算14种氨基酸含量，结果见表6。空白衍生溶液、混合对照品及样品色谱图见图11。由图11可知，与标准品对照，样品中含有14种氨基酸。样品中各组分得到了较好的分离，进一步验证了色谱条件的可行性。

由表6可知，不同产地浙贝母鳞茎中氨基酸含量存在一定差异，其中天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、异亮氨酸含量、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸含量分别为2.071～8.190、2.614～7.639、4.405～6.199、4.793～6.828、1.163～2.072、12.544～37.516、1.869～2.885、2.240～3.585、14.490～19.282、3.803～6.703、6.852～16.337、11.580～18.966、2.953～4.434、5.392～11.940 mg/g。4个产地栽前与栽后浙贝母样品中，精氨酸平均含量最高；脯氨酸和异亮氨酸平均含量较高。组氨酸含量最低。

2.2.3 独立样本t检验

采用SPSS 20.0软件对4个产地栽培前浙贝母和4个产地栽培后浙贝母鳞茎中14种氨基酸进行独立样本t检验分析，分析结果见表7。由表7可知，方差方程的Levene 检验可以看出，14种氨基酸方差相等(P>0.05)。均值方程的t检验可以看出，栽培前浙贝母与栽培后浙贝母鳞茎中14种氨基酸含量均无显著差异(P>0.05)。

3 结论

本文对氨基酸提取条件中的盐酸用量、超声时间、水解温度和水解时间4个因素，先进行了单因素考察。通过单因素考察初步确定了每个因素的最佳条件。为了进一步优化提取条件，我们采用了响应面法对这些因素进行深入研究。采用4因素3水平，通过Design Expert 8.0.6.1软件设计出试验组。研究发现盐酸用量、超声时间、水解温度和水解时间4个因素对氨基酸提取的影响都十分显著。最佳的浙贝母氨基酸提取条件为：6 mol/L盐酸8 mL、超声时间30 min、水解时间20 h及水解温度110 ℃。经过分析，这些因素间的交互作用，除了超声时间和水解温度的交互作用对其影响不显著外，其余交互作用对氨基酸提取的影响都十分显著。

采用柱前衍生法-UPLC测定8份浙贝母鳞茎栽前栽后样品中氨基酸含量，其中，精氨酸(Arg)含量最高，达到26.543 mg/g，其次是脯氨酸(Pro)，组氨酸(His)含量最低，仅有1.680 mg/g。栽前鳞茎总氨基酸含量为107.01～137.55 mg/g，栽后鳞茎总氨基酸含量为82.60～133.78 mg/g。总体来看，奉节和宁波浙贝母样品栽后的氨基酸含量比起栽前有所下降，奉节下降的最为明显，从137.55 mg/g下降至80.60 mg/g，而南通和磐安的浙贝母鳞茎中，栽后样品的氨基酸含量有所上升，南通从114.76 mg/g上升至121.89 mg/g，磐安则从107.01 mg/g上升至133.78 mg/g，结果表明从不同产地移植的鳞茎栽下后，环境对氨基酸含量还是存在一定的影响，导致这种差异的原因可能跟不同产地的生长环境、土壤条件等有关[22-23]。

本研究采用响应面法优化氨基酸提取条件后，建立了PITC柱前衍生化-UPLC法同时测定浙贝母鳞茎中14种氨基酸含量的方法，此方法灵敏度高、分离效果好、结果稳定可靠，可作为浙贝母的品质评价指标含量测定方法之一。采用此方法比较了不同产地浙贝母栽前栽后氨基酸含量差异，为浙贝母品种选育，解决其资源匮乏等问题提供了理论参考。

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The use of response surface methodology to optimize the extraction process and determine amino acids in Fritillaria thunbergii Mig

WEI Zuchen1,ZHAO Shunxin1,ZHOU Nong1,GU Wenchao2,CHEN Yanbin1,CHEN Qunhui1,ZHANG Hua1*

1(College of Food and Biological Engineering, The Chongqing Engineering Laboratory for Green Cultivation and Deep Processing of the Three Gorges Reservoir Area′s Medicinal Herbs, Chongqing Three Gorges University, Chongqing 404120, China) 2(College of Pharmacy and Chemistry, Dali University, Dali 671000, China)

Abstract To optimize the amino acid extraction conditions of Fritillaria thunbergii Mig by response surface methodology, a pre-column derivatization-ultra-performance liquid chromatography method was establish to determine the contents of 14 amino acids in Fritillaria thunbergii Mig bulbs before and after planting in different areas. The following conditions were used for the extraction of amino acids from bulbs in Fritillaria thunbergii Mig, which was 8 mL hydrochloric acid (6 mol/L) for ultrasonication 30 min and hydrolysis at 110 ℃ for 20 h, and then derivatized with phenyl isothiocyanate pre-column and followed by the detection by UPLC which used ACQUITY UPLC BEH C18 column (2.1 mm×150 mm, 1.7 μm). Mobile phase A was 0.1 mol/L sodium acetate solution (pH adjusted by glacial acetic acid=6.5)∶ acetonitrile (97∶3), and mobile phase B was acetonitrile∶water (4∶1); followed by gradient elution and the detection wavelength was 254 nm with flow rate 0.2 mL/min. The calibration curves of 14 kinds of amino acids showed good linearity within their test ranges (r ≥0.999 2). The average recoveries were between 95.12% and 101.05%, and the RSDs were less than 3.00% which indicating that the method was accurate and reliable. The amino acid content of Fritillaria thunbergii Mig before and after planting in different producing areas were different. This method finds the optimal conditions for the extraction of amino acids from Fritillaria thunbergii Mig, which can be used for the determination of amino acids in bulbs of Fritillaria thunbergii Mig.

Key words Fritillaria thunbergii Mig;amino acid;phenyl isothiocyanate;pre-column derivation;UPLC

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.025338

引用格式:魏祖晨，赵顺鑫，周浓，等.响应面法优化浙贝母氨基酸提取工艺及含量测定[J].食品与发酵工业,2021,47(8):180-188;196.WEI Zuchen,ZHAO Shunxin,ZHOU Nong, et al.The use of response surface methodology to optimize the extraction process and determine amino acids in Fritillaria thunbergii Mig[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(8):180-188;196.

第一作者：硕士研究生(张华副教授为通讯作者，E-mail:zhanghua03129@163.com)

基金项目：重庆市技术创新与应用示范项目(cstc2018jscx-msybX0367)；重庆市教委科学技术研究计划项目(KJQN201901227)

收稿日期：2020-08-11，改回日期：2020-11-16