香辛料是指在菜品中起调香、调味、着色的植物香料，具有香、辛、麻、辣等特点，其在日常生活中是不可缺少的调味料。花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxin)是香辛料的一种，属芸香科落叶小乔木或灌木，是我国“八大调味品”之一，也是一种中药材，有杀虫、散寒、除湿的功效[1]。
烯效唑(uniconazole)又名特效唑，结构式见图1，是一种光谱性唑类植物生长调节剂，赤霉素合成抑制剂，具有控制营养生长，抑制细胞伸长，缩短节间、矮化植株，促进侧芽生长和花芽形成的作用[2]，因此能提高作物的抗倒伏能力，提高产量，改善品质[3-4]。由于目前在水稻、花生、小麦、大豆、大麦等作物上的广泛应用，造成在植物源性食品中该类农药的残留。如果食用，短时间内影响不明显，但如果长时间摄入会对人体的血液、肝脏，肾脏造成危害[5]，导致人体代谢失调，诱发多种疾病[6]，并可能引起癌变。
我国对烯效唑的最大残留限量(maximum residue limit，MRL)只在谷物类和油料油脂类上规定，在花椒上暂时没有制定[7]，欧盟(European Union,EU)和国际食品法典委员会(Codex Alimentarius Commission,CAC)均未制定烯效唑在农产品中的MRL值。目前关于烯效唑残留检测方法主要有气相色谱法(GC)[8]、高效液相色谱法(HPLC)[9-10]、气质联用法(GC-MS)[11]、液质联用法(HPLC-MS/MS)[12]和超高效液相色谱串联质谱法(ultra performance liquid chromatography tandem mass spectromentry，UPLS-MS/MS)[3,13]等；GC和GC-MS需要更换溶剂，操作比较复杂；HPLC受基质干扰较大；HPLC-MS/MS具备样品前处理简单、灵敏度高、定性能力好等特点。上述方法主要涉及水果、蔬菜、烟草等，而检测花椒中烯效唑残留方法以及烯效唑在花椒中的贮藏稳定性未见报道。于是，本研究运用了改进的QuEChERS选用不同提取剂(乙腈、含有体积分数0.1%乙酸的乙腈)、不同种类的净化剂(PSA、C18、C18+GCB、PSA+GCB)，结合UHPLC-MS/MS分析方法检测鲜花椒、干花椒中烯效唑残留，同时研究花椒中烯效唑在冷冻条件下的贮藏稳定性。本文通过优化质谱参数和色谱条件，考察了不同流动相、不同前处理方法及基质效应等因素，建立了UPLC-MS/MS法检测花椒中烯效唑残留以及烯效唑在花椒中的贮藏稳定性。为烯效唑在花椒中残留监控和质量安全评价提供技术支撑，同时为中国制定花椒中烯效唑的合理使用准则以及其MRL标准提供数据依据。
图1 烯效唑结构式
Fig.1 The structural formula of uniconazole
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
烯效唑(98.7%)标准品，国家农药产品质检中心；乙腈(色谱纯)，德国默克公司；乙腈(分析纯)，天津市科密欧化学试剂有限公司；甲酸(色谱纯)，美国Thermo Fisher科技有限公司；乙酸(分析纯)，天津市光复科技发展有限公司；实验用水为屈臣氏蒸馏水。
UItimate 3000/TSQ Vantage型超高效液相色谱-串联质谱，美国Thermo Fisher 公司；Hypersil GOLD 型C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)，赛默飞科技(中国)有限公司；CK200型高通量组织研磨器，北京托摩根生物有限公司；电子分析天平(精度为0.000 1 g)，德国Sartorius公司；多管涡旋仪，杭州瑞诚仪器有限公司；TG16-11型台式高速离心机，湖南平凡科技有限公司；0.22 μm有机滤膜，日本岛津公司。
1.2 标准溶液的配制
准确称取烯效唑标准品0.010 1 g (精确到0.000 1 g)，用色谱纯乙腈配制10 mL 1 000 mg/L的标准储备液，保存于4 ℃冰箱中。取烯效唑标准储备液适量，用色谱纯乙腈稀释制得烯效唑标准工作溶液，标准工作液浓度分别为2.0、0.8、0.2、0.08 mg/L。
1.3 设计试验
根据NT/T3094—2017《植物源农产品中农药残留储藏稳定性试验准则》[14]设计试验。花椒中烯效唑的贮藏稳定性试验是在空白花椒样品加入一定质量浓度的烯效唑，再将样品放入-20 ℃冰箱中保存，不同贮藏时期时对样品进行检测，测定花椒中烯效唑的稳定性。
1.3.1 制备贮藏稳定性试验样品
称取2.0 g空白花椒样品于50 mL离心管中，准确加入0.5 mL 2.0 mg/L的烯效唑溶剂标准溶液，盖上盖子后混匀，每个贮藏期取2个样品及3个空白样品，2 h内放入-20 ℃冰箱中贮藏。
1.3.2 质控样品
质控样品是在空白样品中加入与贮藏样品体积相同、质量浓度相同的溶剂标准溶液，每个时期设置2个质控样品。
1.4 样品的检测
1.4.1 样品前处理
准确称取2.00 g(精确到0.01 g)均质花椒试样于50 mL塑料离心管，加入2.0 mL屈臣氏蒸馏水和20 mL含0.1%(体积分数)乙酸的乙腈溶液，涡旋振荡1 h，加入2.00 g无水MgSO4、1.00 g NaCl混匀，涡旋振荡10 min，5 000 r/min离心5 min，取上清液1.0 mL到2 mL 离心管(装有25 mg PSA和100 mg GCB)中，涡旋2 min，5 000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 μm的有机滤膜，取滤液接体积比1∶1加屈臣氏蒸馏水后供UPLC-MS/MS测定。
1.5 色谱与质谱条件
Hypersil GOLD 型C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；流速：0.25 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：5 μL；流动相：A为乙腈，B为0.1%的甲酸水；洗脱程序：0～0.5 min 80% B；0.5～1.0 min 80%～5% B；1.0～4.0 min 5% B；4.0～4.5 min 5%～80% B；4.5～5.0 min 80% B。
ESI离子源，扫描方式为MRM多反应监测，毛细管电压：3.2 kV，离子源温度：350 ℃，脱溶剂温度：330 ℃，辅助气(N2)流速：10 arb，鞘气(N2)流速：30 arb，碰撞气为氩气。烯效唑定性、定量离子对等质谱分析参数见表1。
表1 烯效唑的保留时间及质谱分析参数
Table 1 Retention times and MS/MS parameters of uniconazole
化合物保留时间/min母离子(m/z)子离子(m/z)锥孔电压/V碰撞电压/eV烯效唑3.12(+)292.052125.014∗/218.1017530/18
注：*代表定量离子
1.6 基质效应
由于液质联用以及花椒基质的复杂性，考察了基质效应(matrix effect，ME)的影响。采用标准曲线测定法来测定花椒的基质效应即分析了空白花椒基质标准溶液和纯溶剂标准溶液，绘制标准曲线，以二者的斜率比来判定基质效应的强弱[15],如公式(1)所示：
(1)
式中:Sm为基质标准曲线的斜率，Ss为溶剂标准曲线的斜率[15]。
当ME为0时，表明不存在基质效应的影响；当ME为-20%～20%时表明存在弱基质效应；当ME为-50%～-20%或20%～50%时表明存在中等基质效应；当ME≤-50%或>50%时表明存在强基质效应[16]。
2 结果与分析
2.1 色谱、质谱条件的确定
烯效唑结构中含有羟基易于离子化，适合采用ESI源。试验采用直接进样方式，在ESI+模式下找到烯效唑母离子，然后通过碰撞能量的调节选择相对丰度较高的特征离子作为定量离子和定性离子，分析时再结合化合物的保留时间，进行定性、定量分析；烯效唑离子对及其对应的质谱参数见表1。
烯效唑在C18色谱柱上保留效果好，采用梯度洗脱，提高单位样品的分析效率并减少了强保留杂质在色谱柱的积累。试验选择了甲醇-0.1%甲酸水溶液， 0.1%甲酸水-乙腈组成的流动相体系，研究了不同流动相对烯效唑洗脱效果的影响。以乙腈-0.1%甲酸水为流动相时，烯效唑能获得较好的色谱峰和稳定的信号强度。因此流动相采用0.1%甲酸水-乙腈。
2.2 净化方法的选择
2.2.1 提取剂的选择
QuEChERS方法中，乙腈为常用的提取溶剂[17]，溶解性能好，能够溶解有机、无机以及气体等多种物质。由于农药结构的不同，不同pH下对提取效果影响较大，实验人员在乙腈中加入不同比例的试剂，如乙酸，取得了更好的回收率[18-20]。本实验提取溶剂选择乙腈、0.1%乙酸乙腈，比较花椒中烯效唑的加标回收率，结果表明以乙腈为提取溶剂时，鲜花椒、干花椒中烯效唑的平均回收率分别为62.71%、65.43%，低于NY788—2018标准中所允许的回收率范围(70%～120%)[21]；以0.1%乙酸乙腈为提取溶剂时，鲜花椒、干花椒中烯效唑的平均回收率分别为84.12%、71.50%；因此选择0.1%乙酸乙腈为提取溶剂。采用不同提取剂(n=6)时，鲜花椒、干花椒中烯效唑的回收率如图2-A。
2.2.2 净化剂的选择
PSA吸附结构中含2个氨基，属于氨基吸附剂，通过氢键能够除去有机酸、脂肪酸、糖等物质；C18是一种非极性、广谱性的净化剂，能有效去除提取液中微量的非极性杂质；GCB吸附剂表面有极强的吸附性，能够去除色素。分别以PSA、C18、C18+ GCB，PSA+GCB为净化剂比较其回收率。鲜花椒采用PSA+GCB为净化剂时烯效唑的平均回收率(84.12%)优于PSA、C18、C18+GCB为净化剂时烯效唑的平均回收率(63.53%、64.82%、68.64%)，干花椒采用PSA+GCB为净化剂时烯效唑的平均回收率(71.50%)优于PSA、C18、C18+GCB为净化剂时烯效唑的平均回收率(66.53%、64.83%、68.92%)，采用不同净化剂时(n=6)，鲜花椒、干花椒中烯效唑添加回收率如图2-B。
A-不同提取剂；B-不同净化剂
图2 不同提取剂、净化剂鲜花椒和干花椒中烯效唑 加标回收率
Fig.2 Recovery rates of uniconazole in fresh Zanthoxylum bungeanum Maxim and dried Zanthoxylum bungeanum Maxim with different extracting solution and purifying agent
2.3 基质效应、方法的线性范围与定量限
采用鲜花椒、干花椒基质空白溶液及溶剂配制烯效唑质量浓度为1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 ng/mL的标准溶液，在优化的实验条件下测定，横坐标(x)为标准溶液的质量浓度(ng/mL)，纵坐标(y)为相应的峰面积，绘制标准曲线，烯效唑的回归方程和相关系数见表2。结果显示，烯效唑在1.0～50.0 ng/mL均呈良好的线性关系，相关系数(R2)为0.993 7～0.999 7。通过添加回收实验，以最小添加浓度作为方法的定量限(limit of quantitation,LOQ)，烯效唑方法LOQ为0.02 mg/kg。
表2 烯效唑的基质效应、回归方程、R2和LOQ
Table 2 Matrix effects、regression equations、R2 and LOQ of uniconazole
化合物基质基质效应/%线性方程R2LOQ/(mg·kg-1)溶剂 -y=22 161x+19 7060.998-烯效唑鲜花椒-83.9y=3 566.2x+7 432.90.993 70.02干花椒-96.0y=884.05x+8 155.10.999 70.02
2.4 添加回收试验结果
结果(表3)显示，在0.02、0.05、0.2 mg/kg 3个添加水平下，鲜花椒、干花椒中烯效唑的回收率在71.50%～85.98%，相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)在1.13%～5.36%，表明本方法均有较好的精密度和准确度，符合农药残留分析的要求。鲜花椒 (加标浓度0.2 mg/kg)的MRM图谱如图3所示。
表3 鲜花椒、干花椒中烯效唑的加标回收率和RSD (n=6)
Table 3 Spiked recoveries and RSD of fresh Zanthoxylum bungeanum Maxim、dried Zanthoxylum bungeanum Maxim(n=6)
基质烯效唑加标量/(mg·kg-1)回收率/%RSD/%0.0285.984.43鲜花椒0.0581.395.360.2084.121.130.0277.674.53干花椒0.0573.563.360.2071.501.62
A-鲜花椒空白；B-0.01 mg/kg烯效唑溶剂标；C-0.2 mg/kg鲜花椒添加；D-鲜花椒样品添加
图3 空白鲜花椒基质，烯效唑溶剂标和鲜花椒添加，鲜花椒样品添加色谱图
Fig.3 Chromatography of fresh Zanthoxylum bungeanum Maxim blank, uniconazole solvent standard and matrix standard, sample with uniconazole in fresh Zanthoxylum bungeanum
2.5 烯效唑在花椒中的贮藏稳定性及实际样品分析
应用本研究所建立的方法，测定花椒中烯效唑不同贮藏时间烯效唑的降解率，烯效唑的平均降解率<30%，说明烯效唑在-20 ℃贮藏是稳定的，结果如表4所示。并对贵州省试验点施用烯效唑的鲜花椒、干花椒末次施药后70、80、110 d 3个时间点的样品进行了检测，结果如表5所示。
3 结论
本文建立了同时检测鲜花椒、干花椒2种基质中烯效唑的一种简便可靠的残留分析方法。样品前处理简单，根据农药残留分析的要求，该方法的各种性能指标(LOQ、线性范围、平均添加回收率)均能满足要求；烯效唑的定量限为0.02 mg/kg，在0.02、0.05、0.20 mg/kg 3个加标水平下平均回收率为71.50%～85.98%，RSD为1.13%～5.36%。该方法适用于花椒中烯效唑多残留的快速、准确定性和定量分析。
表4 不同时期鲜花椒和干花椒中烯效唑残留量及降解率 单位：%
Table 4 Content of uniconazole residues and in fresh Zanthoxylum bungeanum Maxim and dried Zanthoxylum bungeanum Maxim
基质加标量/(mg·kg-1)1 d7 d15 d30 d60 d90 d120 d150 d鲜花椒0.516.2021.5618.1618.7026.4325.9324.3025.36干花椒0.512.3418.3117.4918.1025.3926.1926.3126.59
表5 烯效唑在鲜花椒和干花椒中的残留量 单位：mg/kg
Table 5 Content of uniconazole residues in fresh Zanthoxylum bungeanum Maxim and dried Zanthoxylum bungeanum Maxim
基质70 d80 d110 d鲜花椒0.020 40.010 50.005 7干花椒0.1610.0780.055
用该方法测定了烯效唑在花椒中的贮藏稳定性，结果表明在-20 ℃冷冻条件下烯效唑在花椒中的平均消解率为12.34%～26.59%，均不超过30%。因此，花椒中烯效唑在-20 ℃至少能稳定贮藏5个月。
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