类蛋白反应是在合适的蛋白酶催化下，将浓缩的蛋白水解物质合成凝胶状物质的反应，可用于合成一些高分子质量的类蛋白物质[1]。水解反应是类蛋白反应的第一步，是原料蛋白经酶水解成浓度较低的蛋白水解物。所以发生水解可能发生了类蛋白反应。类蛋白反应的操作过程如图1所示[2]：第一步是蛋白质在蛋白酶作用下分解成低聚肽混合物；第二步是浓缩反应，通常用冷冻干燥或喷雾干燥将水解产物浓缩，同时除去一些非蛋白物质；第三步是合成反应，调整浓缩产物浓度或加入肽、氨基酸衍生物，加入蛋白酶，调整到合适的pH进行类蛋白反应[3]。
图1 类蛋白反应过程
Fig.1 Process of plastein reaction
一些含蛋白质的农业和食品原料可以用作底物进行类蛋白反应，如植物叶子蛋白、玉米蛋白、卵白蛋白、牛奶、玉米、菌蛋白、鱼和鱼饲料等，但在肉和畜禽屠宰副产物中未见报道[4]。本文对类蛋白反应的机理、影响因素以及在肉类中的应用进行综述，以期为蛋白质的深度利用以及高值化研究提供理论参考。
1 类蛋白反应机理
在一个多世纪的时间里，人们对类蛋白的了解有限，形成机理并未阐明。在19世纪80年代中期，高投入和低产量限制了类蛋白的商业化应用，人们对类蛋白营养方面的研究兴趣有所下降，但是在近十年内，类蛋白再次出现在研究人员的视野。
类蛋白形成的机理还没有完全被阐述清楚。当使用失活的蛋白酶时，基于游离氨基氮含量的降低和沉淀的生成，早年认为类蛋白反应是蛋白质的重新合成，然而，有研究认为沉淀是水解的产物中高分子量物质的变性形成的，在类蛋白反应中疏水相互作用在肽的聚集中起主要作用[5]，可是这些结论没有排除缩合和转肽作用的参与，后两者会导致氨基酸残基的重排，在疏水诱导的肽聚集前形成“疏水内核”。后来，研究人员又提出了几个类蛋白形成的机理，包括肽的缩合，转肽和由物理力形成的聚集作用。
1.1 缩合反应
缩合反应是指蛋白水解物中的肽和氨基酸在酶的催化作用下形成肽键。在缩合反应过程中，游离氨基酸含量下降，生成了新的高分子质量的蛋白质或肽。张娟娟等[6]以牡蛎为原料制备锌离子结合类蛋白反应修饰肽，通过红外光谱分析发现：反应后吸收峰变宽增强，指纹区吸收带较多，生成了新的物质，证明发生了缩合反应；崔铁军[7]和任增超等[8]分别研究了鱼类和罗非鱼下脚料的类蛋白反应，发现反应后均生成了分子质量较大的类蛋白，证明小分子的多肽和氨基酸发生了缩合反应；YAMASHITA等[9]以大豆蛋白为原料，对其水解物进行类蛋白反应，得到蛋白水解物分子质量约为2.1 kDa，而肽分子质量约为21.6 kDa，表明有大分子物质生成。然而，已证明封闭肽的氨基和羧基末端只会稍微降低类蛋白的产量[10]。这表明，类蛋白反应可能还有除缩合作用外的其他机制。
1.2 转肽作用
转肽作用一般指转肽基作用，涉及到肽链一级结构的改变，在这个过程中有肽键的断裂和形成，使氨基酸残基从一个肽序列转移到另一个肽序列。LOZANO等[11]发现在类蛋白反应过程中，肽分子通过肽的作用，将疏水性氨基酸转化为疏水性多肽，并逐渐形成不溶于水的类蛋白产物。综上所述，类蛋白反应过程中缩合作用较小，主要是转肽作用。
1.3 物理聚集作用
类蛋白的形成除了缩合反应和转肽作用外，还可能与物理聚集有关，主要是氢键和疏水相互作用。蛋白质中存在疏水性氨基酸，疏水性相互作用越强，类蛋白质反应越好[4]。图2描述了类蛋白形成过程中蛋白酶诱导聚合反应的过程。梁雪[12]分析了类蛋白产物的结构特征。发现类蛋白产物的二级结构与原蛋白相比发生了变化，表面疏水性增加，证明了反应过程中存在氢键和疏水相互作用。姜岁岁等[13]也同样提出，类蛋白反应产物的稳定性主要依赖于疏水键和氢键。
图2 类蛋白形成过程中蛋白质酶诱导聚集反应步骤[5]
Fig.2 Steps of protein-enzyme induced aggregation in the process of plastein formation
总之，类蛋白反应的机制比较复杂，目前主要是缩合、转肽、物理聚集作用。周雪松等[14]认为要判断哪一种机制占主导作用主要看两个方面，一是终产物平均分子质量和水解产物平均分子质量相比是否会因为类蛋白反应发生变化；二是可溶肽酶促转化成不溶物质是否与分子质量的增加有关。也有研究认为哪种机制占主导与参加反应的底物、酶、温度、pH等有关[15]。比如浓度对类蛋白反应影响非常大，反应过程中可能存在水解和缩合两个过程，底物浓度较高时，缩合反应占主导；底物浓度较低时，水解反应占主导。
2 类蛋白反应影响因素
影响类蛋白反应的因素很多，如酶、底物、温度和pH，每个因素的改变都能影响类蛋白产率。类蛋白反应一般在底物浓度30%～50%(质量浓度)，最好在40%，pH 3.0～7.0，温度37～50 ℃时进行。根据孵育的条件，类蛋白反应的时间为24～72 h[16]。表1列举了不同物质发生类蛋白反应的最优条件。
表1 不同物质发生类蛋白反应的最优条件
Table 1 Optimal conditions for enzymatic hydrolysis of different substances
原料影响因素最优条件参考文献罗非鱼下脚料蛋白酶、水解温度、pH、时间、底物浓度、pH、加酶量底物浓度44.16%,pH值5.08,胃蛋白酶加酶量4.12%;在此条件下,类蛋白产率达到(10.08% ±0.03%)%。[8]乳鸽胸脯肉蛋白酶、水解温度、pH、时间风味蛋白酶600 U/g,水解温度55 ℃,pH 7.0,时间2.5 h,水解度达到(28.69±0.29)%。[17]河蚌肉蛋白酶、加酶量、温度、时间、pH木瓜蛋白酶、风味蛋白酶质量比1.71∶1,酶添加量1.6%,温度50 ℃,反应时间4.5 h,pH值6.74,最终水解度为42.75%。[18]低值虾加酶量、温度、pH、时间中性蛋白酶用量3 000 U/g和风味蛋白酶用量1 200 U/g,温度50 ℃,pH 7.0和时间240 min条件下,短肽(360～1 000 Da)的得率达到42.93%。[19]大豆蛋白和芝麻蛋白蛋白酶、底物水解度、底物的分子质量、底物浓度、pH胃蛋白酶作为催化剂,底物水解度为80%,底物的分子质量在1 000以下。底物最佳浓度为30%,最佳pH为5.0。合成类蛋白质分子质量约为10 000。[20]鹅肉蛋白酶、固液比、温度、时间、pH45 ℃恒温水浴酶解6.5 h,固液比1∶3(g∶mL),木瓜蛋白酶加酶量1 200 U/g,pH 7.0的条件下,木瓜蛋白酶酶解液水解度最大且寡肽质量分数最高[21]鸡胸肉蛋白酶、温度、时间、pH木瓜蛋白酶和中性蛋白酶添加量分别为0.27%和0.13%, pH 6.8,反应5 h,温度54.3 ℃时,所得鸡胸肉酶解液水解度为(36.03%±0.31)%。[22]罗非鱼下脚料底物浓度、温度、加酶量、pH、反应时间底物浓度31.76%,温度37 ℃,胃蛋白酶加酶量2.92%,pH 4.95,反应时间24 h的条件下,类蛋白产物风味综合评分为2.56±0.03,类蛋白产率为(8.96±0.11)%。[23]
2.1 蛋白酶的影响
类蛋白反应需要有活性的酶参与[10]，酶活性越高，产物产量越高。水解和合成可以是不同的酶，也可以用一种酶，使用不同的酶会导致蛋白质进一步水解，使产量降低[5]。蛋白质水解及类蛋白反应中用到的酶包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶等，一般认为胃蛋白酶是高产率类蛋白反应的最有效的酶，尤其是近中性时凝胶强度最高。许永红[24]提出当使用相同的底物时，蛋白酶不同会导致作用结果不同，蛋白质水解中多肽的长度及组成结构不同，因此蛋白酶的选择至关重要。唐霄等[21]以鹅肉为原料，用4种酶制备呈味肽，发现在相同底物条件下使用不同的酶，在不同底物条件下使用相同的酶都会影响蛋白质的水解效果，同时对使用4种酶的滋味进行评定，发现使用中性蛋白酶制得的水解物风味较好。赵晓玥[25]为了提高海参肠、卵的综合利用率，对酶解工艺进行优化，发现在木瓜蛋白酶添加量为3%，风味蛋白酶添加量2%的条件下水解度最高，达到64%，可以获得口感、风味较好的酶解产物。这都体现了蛋白酶会影响类蛋白反应产物的产率和风味。
2.2 反应温度的影响
类蛋白反应是酶促过程，因此反应温度会影响类蛋白产率。一般来讲，温度升高会增加类蛋白产率。但是温度过高(大于70 ℃)时使酶失活，类蛋白产率比20～50 ℃任何一个温度都低。WILLIAMS等[4]在不同温度下用胃蛋白酶孵育霉菌蛋白肽样品，结果显示，在研究的最高温度(65 ℃)下，类蛋白迅速形成，产量为最大量的93%，在50 ℃和37 ℃下孵育，以百分比表示的类蛋白生成速率稍慢。SUKAN等[26]的研究结果显示胃蛋白酶催化合成类蛋白反应的最适温度在37～50 ℃，也证实了这一点。王俊霞等[27]通过热反应制备鸡肉香精，通过优化酶解参数发现当温度过高(达到160～180 ℃)时，会产生一些小分子的醛酮醇类物质，对鸡肉香精的风味产生不好的影响。
2.3 反应体系的pH值
pH也会影响合成蛋白的产量。因大多数蛋白质的等电点都在pH=4.0～7.0[10,26]，所以这也是类蛋白反应的最适pH。任增超等[8]测试在相同的水解度、底物浓度和加酶量的条件下，使用不同的pH对合成蛋白产量的影响，发现pH在2～5时，类蛋白产率呈上升趋势，在pH=5时达到最高，产量不再增加。YAMASHITA[9]提出，用于水解和合成反应的最适pH值不一定一致，定义合成中的最佳pH减去水解中的最佳pH为ΔpH，并将与ΔpH有关的情况分为3种：ΔpH>0、ΔpH<0和ΔpH=0，分别代表了合成最适pH大于、小于和等于水解最适pH的情况，分别对应3种酶：胃蛋白酶型、胰凝乳蛋白酶型和木瓜蛋白酶型。通常，胰凝乳蛋白酶类型的酶的pH差异要比其他酶大，在任何pH范围内均不能催化生成类蛋白产品。
2.4 底物的影响
2.4.1 底物浓度
浓度是影响类蛋白反应的主要因素之一。有文献认为最适肽浓度为20%～40%，在高于或低于此浓度时类蛋白的产率与肽浓度形状上几乎呈指数关系[4]。TSAI等[28]在不同底物浓度的条件下对合成类蛋白反应进行研究，发现底物肽的浓度在11%～43%，随着底物浓度增加，类蛋白的产量呈指数增长，且底物浓度为30%～40%时，合成类蛋白产率最大。杨倩等[29]观察了不同浓度下3种酶对大米蛋白的水解效果，发现随着底物浓度的增加，大米蛋白的水解度均呈现先增加后减少的趋势，并且胰蛋白酶、碱性蛋白酶和胃蛋白酶底物浓度分别在7%、5%和5%时，大米蛋白酶解产物的水解度最高，相比之下，底物浓度对对碱性蛋白酶水解效率的影响更显著。因此，选择合适的底物浓度对于类蛋白的合成至关重要，底物浓度过高或过低都会影响合成类蛋白产量，甚至不合成类蛋白。
2.4.2 底物的相对分子质量
除了底物浓度，底物的相对分子质量也会影响合成蛋白的产量。张雅丽等[20]取水解度不同的大豆蛋白胰蛋白酶水解物，发现在水解度为80%和70%时，合成类蛋白产量最高，分别为70%和52%；水解度为40%和50%时，未发生类蛋白反应，甚至有微弱水解，水解度增大，合成类蛋白产物增加，但当水解度增加到90%时，合成类蛋白产物降低。由此可见，底物水解度(即分子质量大小)是影响合成类蛋白产物的重要因素。
2.4.3 底物的亲/疏水性
底物的亲/疏水性对类蛋白反应有很大的影响。苏亚文等[30]提出类蛋白在水中的溶解度很低，一般疏水性肽会优先参与反应，疏水性越高，反应速度越快，但是疏水性过高的底物还没进行类蛋白反应就从溶液中沉淀出来，产量很低；亲水的水解物也不是进行类蛋白反应的有效底物，因为生成的类蛋白产物会溶于水。
3 类蛋白反应在肉类中的应用
3.1 提高肽的生物活性
3.1.1 修饰酶解液活性
蛋白酶和类蛋白反应与外源氨基酸的结合可以产生具有增强生物活性和潜在健康效益的酪蛋白水解产物[31]。目前多数研究是利用类蛋白反应修饰改善酶解液活性。例如，沈晴晴等[32]以海地瓜为原料，经过类蛋白反应后，得到的蛋白酶解物具有血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)抑制活性，且活性高于原酶解液，同时发现类蛋白反应修饰使海地瓜天然肽序列发生改变，得到了新的具有较高ACE抑制活性的氨基酸序列NQNFVQYTTNT。张娟娟等[6]以牡蛎为原料，采用锌离子结合谷氨酸和类蛋白反应对多肽进行修饰。结果表明，锌离子结合物具有一定的稳定性和抗消化能力，但蛋白结合肽的稳定性和抗消化能力较高。GAO等[33]用蛋白酶催化类蛋白反应，提高了ACE抑制能力。其中胰酶催化的类蛋白反应对ACE的抑制活性最高，提高了28.57%，表明鸡血浆蛋白是具有开发潜力的新功能食品。马春敏等[34]在茶肠切片上涂抹一定浓度的色氨酸及类蛋白反应修饰产物，发现具有一定的抑菌作用，能够得到延长茶肠的保质期。
3.1.2 提高呈味肽活性，改善风味
呈味肽属于生物活性肽，可以由氨基酸合成，从食物中提取，也可以通过酶解打开蛋白质的结构获得，有酸、甜、苦、鲜和咸5种不同的呈味效果，可以使食品风味增强，柔和细腻，达到使用单一调味品不能达到的效果。国内一些食品加工企业和调味料生产企业大多使用这种方式来提高产品的档次。
姜淼等[35]对海参肠进行酶解和Plastein反应修饰，得出在一定条件下风味蛋白酶酶解产物鲜味浓郁。游离氨基酸组成分析显示，经过Plastein反应后，必需氨基酸含量增加，脱腥后的修饰物有一定的海鲜风味。从大部分研究结果可以看出：蛋白酶酶解和类蛋白反应修饰可以提高呈味肽活性，生产出更多美味的食物。
3.1.3 提高抗氧化肽活性
蛋白质的酶水解还可以制备具有抗氧化活性的产物抗氧化肽。王晗欣等[36]用碱性蛋白酶水解鹰嘴豆蛋白，并对水解物进行类蛋白反应修饰，发现修饰后产物的还原力和羟自由基清除力明显提高。吴丹等[37]用木瓜蛋白酶水解酪蛋白，用响应面优化法得出类蛋白反应的最适条件为：温度30 ℃，反应时间5.6 h，酶添加量500 U/g，底物质量分数50%。通过这两步得到抗氧化肽，通过对清除DPPH自由基活性、清除羟自由基活性、清除ABTS自由基活性的测定得出结论：类蛋白反应可以提高产物的抗氧化活性。戚莉佳等[38]以酪蛋白水解产物为原料，通过测定DPPH自由基清除能力、超氧阴离子清除能力和还原能力，获得类蛋白反应改性产物的抗氧化活性。结果表明，色氨酸改性产物具有较高的抗氧化活性。本研究提供了一种获得高纯度抗氧化肽的方法。
类蛋白反应在生物活性肽领域具有新的应用价值，利用食品蛋白质酶解产物得到活性肽，可以提高食物的抗氧化性，提高食品风味，生产出促进健康的功能性食品配料，具有其他处理方式没有的优越性，但是因为场地、成本等的约束性，类蛋白反应距离在肉类工业中大范围应用还有一定距离。
3.2 减少蛋白酶解液苦味
蛋白酶水解的蛋白质可提供高附加值的产品，加工后的产品可获得营养和功能。因此，蛋白酶水解技术在动物制品和海产品中得到了广泛的应用。但是蛋白酶解液在产品开发和工业化生产仍然存在许多问题，具有苦味是蛋白酶解风味不佳的主要原因。蛋白酶分为内切酶和外切酶两种，内切蛋白酶疏水氨基酸含量多，酶解液较苦；外切蛋白酶是从肽链的一端将氨基酸切下来，疏水氨基酸少，酶解液苦味较弱。蛋白水解物中的疏水性氨基酸残基可以在类蛋白反应中被包埋聚集构成“疏水核”，从而减少蛋白质水解物的苦味，并且在整个过程中保持了肽的完整性和水解产物的功能性，不会影响蛋白质的结构和功能。
陈海涛等[39]以鸡肉酶解液为原料，考察不同的酶解条件对鸡肉香精香气的影响，得出在酶解温度50 ℃、底物质量比1∶1、总加酶量1.1%、加酶方式 1 h∶2 h的条件下，水解度可达20.47%，制备的鸡肉香精肉香突出，仿真度高，且将酶解时间定在3 h可减少美拉德反应产生一些短肽类的苦味物质，为具有鸡肉香气特征的热反应香精的生产提供参考。王朋[40]以金枪鱼下脚料为实验材料，利用干燥的肽粉进行类蛋白反应，针对目前蛋白水解物中普遍存在的腥苦味进行了相关研究。用喷雾干燥和冷冻干燥的方法对目标组分干燥，测定干燥过的活性肽粉的活性效果。确定各因素对类蛋白反应的影响，得出使苦味得到改善的条件是pH为5，底物浓度40%，温度32 ℃。通过对腥味进行评分，得出腥味物质主要是氮氧类化合物。通过这些实验，使类蛋白反应产物最终达到脱苦脱腥，改善风味的效果。
3.3 改善蛋白的功能特性
蛋白质的功能特性包括溶解性、乳化性、起泡性和稳定性等。类蛋白反应可以改善蛋白的某些加工特性。周雪松等[14]提出，通过类蛋白反应生成的物质能改变氨基酸的组成，可以弥补原来的氨基酸组成不均衡的缺陷，有利于开发更多的优质蛋白质，同时合成类蛋白后溶液溶解度增加，这在研制一些饮料等方面具有良好的前景。郑玥[41]等用胃蛋白酶水解醋蛋液并用类蛋白反应修饰，发现水解物的胆酸结合能力和对蛋白酶抵抗的能力提高。王再扬等[42]以牡蛎源多肽为基础，研究了结合物的生物补锌性。发现结合物进入肠道后减少了食物组分对于锌的竞争型组合，类蛋白反应将与锌结合能力强的氨基酸引入到牡蛎肽中，促进了机体对于锌的吸收，进一步提高了与锌的结合能力和稳定性。由此可见，类蛋白反映在改善蛋白的功能特性等方面具有很好的应用价值。SIKORSKI等[43]提出类蛋白反应将鱼浓缩蛋白转换为具有稳定理想感官特性的产品，可以用来代替肉类。YAMASHIFA等[44]提出了类蛋白反应可以提高大豆蛋白含硫氨基酸水平，将此用于小鼠进行动物试验，与未进行类蛋白反应的小鼠进行比较，发现营养价值明显提高。RAGHOUNATH等[45]尝试对鱼类废弃物水解液中进行硅化，将其置于类蛋白反应中，用来回收蛋白质，达到了理想的效果。这表明类蛋白反应具有从非常规资源回收蛋白质的潜力。
类蛋白反应可以改善氨基酸组成，解决氨基酸组成不均匀的问题，同时经过反应合成类似蛋白质的物质，有利于开发新的蛋白质资源，提高蛋白质的营养价值，为生产出更优质的蛋白质提供了基础。日常生活中可以利用类蛋白反应提高溶解度的特性生产饮料，利用其补锌性用于锌缺乏症，为我们的生产生活带来了便利。
4 结论与展望
随着酶技术和生物技术的快速发展，国内外学者对类蛋白反应的机制和应用研究越来越深入，目前类蛋白反应已经被广泛应用于肉类中，具有巨大的发展潜力和市场需求。但大部分研究仍处于基础阶段，大都是通过优化酶解工艺得到能改变蛋白特性的最佳酶解条件，要想在肉类中实现工业化，还需要更大规模和更深入的研究。
我国人口资源众多，优质蛋白资源短缺，随着人们生活水平的提高，越来越多的人致力于追求绿色健康的食品。肽产品比蛋白质更容易被人体消化和吸收，进一步加强对类蛋白反应机制研究，将重心放在提高工艺条件的可控性和产品的稳定性，设计更加高效的酶及控制成本上，开发利用合适的酶制剂和氨基酸衍生物，对促进类蛋白反应在肉类工业中的应用有重要意义。
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